Aula de nutrição e crescimento 2012.2 odonto e vet

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08/01/2013
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Nutrição, cultivo laboratorial, 
reprodução e crescimento dos 
micro-organismos
Microbiologia I
Josilene Matos
Universidade Federal da Bahia
Instituto de Ciências da Saúde
Departamento de Biointeração
UFBA
Condições necessárias para o cultivo
� Fatores físicos: temperatura, pH e pressão osmótica.
� Fatores químicos: água, fontes de carbono,
nitrogênio, hidrogênio, oxigênio, enxofre, fósforo e
fatores orgânicos.
� Fatores metabólicos: enzimas e processos
associados aos fatores físicos e químicos.
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Nutrição microbiana
“ Nutrientes: todos os materiais utilizados pela célula
para a construção e manutenção da sua estrutura e
organização, inclusive como fonte de energia,
quando esta é de natureza química.”
Bier, O., Microbiologia e Imunologia, 24a. Ed.,
1985.
�Nutrição bacteriana
� Degradação de macromoléculas por bactérias através da 
secreção de enzimas hidrolíticas (hidrolases), proteases, 
lipases, etc.
Nutrição microbiana
�Mecanismo que fornece às células as ferramentas
químicas (nutrientes) necessárias à síntese de
moléculas celulares e produção de energia.
� Importância da nutrição:
• Torna possível a reprodução e crescimento bacteriano.
� Ex: Protéinas estruturais, enzimas, mureína, LPS,
polissacarídeos, ácido teicóico, ácidos nucléicos.
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Nutrição microbiana - principais 
elementos
�Macronutrientes – Carbono
• Forma o esqueleto dos carboidratos, lipídeos e
proteínas.
• Principais fontes
�Autotróficos: utilizam o CO2 como principal ou única
fonte de carbono.
�Heterotróficos: utilizam compostos orgânicos como
principal fonte de carbono (proteínas, carboidratos,
lipídeos).
Macronutrientes
�Nitrogênio
• Proteínas, ácidos nucléicos, mureína, ácido teicóico.
• Principais fontes (diversidade dependente da espécie
bacteriana)
�Nitrogênio atmosférico (N2 → NH4
+) – fixação do
nitrogênio
�Obtenção a partir de nitrato ou amônia
�Nitrogênio orgânico (aminoácidos ou peptídeos –
fatores de crescimento).
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Macronutrientes
�Enxofre
• Síntese de aminoácidos (cisteína e metionina) e
vitaminas (tiamina e biotina).
• Principais fontes: 
� Íon sulfato (SO4
2-)→ H2S
� Sulfito de hidrogênio (H2S)
�Aminoácidos que contêm enxofre na estrutura
Macronutrientes
�Fósforo
• Compostos orgânicos celulares - ATP, NADP, LPS,
fosfolipídeos da membrana celular e ácidos
nucléicos.
• Principais fontes:
�Micro-organismo somente obtém na forma de fosfato
inorgânico (PO4
-3)
� Potássio, magnésio e cálcio são necessários como
co-fatores para as reações enzimáticas.
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Classificação dos micro-organismos quanto às fontes de 
energia e carbono
Nutrição microbiana
Oligo-elementos ou elementos-traços
�Elementos exigidos em quantidades muito
pequenas:
• Ferro, cobre, zinco, cobalto, manganês.
• Essenciais para a atividade de algumas enzimas.
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Fatores de crescimento
�Compostos orgânicos que alguns micro-
organismos necessitam:
• Vitaminas, aminoácidos, purinas e pirimidinas
�Micro-organismos fastidiosos
• Bactérias láticas: Lactobacillus, Leuconostoc,
Streptococcus, etc.
Cultivo Laboratorial
�Meios de cultura
• Material nutriente preparado no laboratório para
o crescimento de micro-organismos (cultura).
�Aplicação
• Isolamento e identificação de micro-organismos
�Meios quimicamente definidos
�Meios complexos (indefinidos)
• Composição química não definida
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Meio quimicamente definido
Meio complexo
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Quando se utiliza meios quimicamente 
definidos?
� Para determinar as necessidades nutricionais de um 
determinado micro-organismo.
� Cepa prototrófica
• Não requer qualquer suplemento orgânico para crescer
� Cepa auxotrófica
• Necessita de suplementos orgânicos em um meio mínimo 
para se desenvolver.
• Desenvolveu determinada necessidade nutricional em 
decorrência de uma mutação.
Cultivo de micro-organismos
� Cultivo de bactérias: meios de cultura
bacteriológicos.
� Cultivo de fungos: meios de cultura para fungos.
� Cultivo de vírus: ovo embrionado ou cultura de
células.
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Cultivo de bactérias
�Meios de cultura bacteriológicos
• Caldo nutriente (líquido)
�Extrato de carne
�Peptona
�Cloreto de sódio
�Água
• Para solidificar, acrescentar ágar
�Semi-sólido (0,3-05%)
�Sólido (1,5-2%)
Meio líquido - caldo BHI
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Meio sólido em tubo - inclinado
Meio sólido em placa de Petri
Qual seria a vantagem dos 
meios sólidos?
�Imobilizam as células e 
permitem a formação 
de colônias
• Características 
coloniais
• Pureza de uma cultura
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
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Como cultivar bactérias intracelulares? 
�Culturas de células
• Cultivos homogêneos que podem ser
propagados e manipulados da mesma forma
que as bactérias.
• Clamídias, riquétsias e algumas espiroquetas
são cultivadas em culturas de células.
Meios – finalidade bacteriológica
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Meios de cultura - conservantes
� Finalidade bacteriológica:
1. Conservantes
• Contém substâncias que inibem as enzimas
autolíticas e previnem os efeitos da oxidação
• Transporte - Stuart / Amies
Meios de cultura - seletivos
� Finalidade bacteriológica:
2. Seletivos
• Permitem o crescimento de um tipo particular de
micro-organismo e suprimem o crescimento de
outros.
• Mac Conkey/EMB
Microbelibrary.org (American Society of 
Microbiology)
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Meios de cultura
� Finalidade bacteriológica:
3. Não-seletivos
• Permitem o crescimento de ampla variedade de
micro-organismos
• Ágar sangue
Meios de cultura
� Finalidade bacteriológica:
4. De enriquecimento
• Aumentar o número de micro-organismos de
interesse até níveis detectáveis em uma população
mista.
• Caldo de tetrationato (Salmonella)
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Meios de cultura - diferenciais
� Finalidade bacteriológica:
5. Diferenciais
• Estabelecem diferenças entre micro-organismos de
características parecidas
• Ágar sangue/SS
Meios de cultura - indicadores
� Finalidade bacteriológica:
6. Indicadores
• Possuem substâncias que evidenciam a utilização de
determinados substratos
• Urease
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Meios de cultura - redutores
� Finalidade bacteriológica:
7. Redutores
• Agente redutor presente no meio remove o oxigênio
para produzir o meio reduzido
• Tioglicolato de sódio – combina quimicamente com o
oxigênio dissolvido em um meio e torna-o não
disponível para os micro-organismos
Crescimento e reprodução
microbianos
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Crescimento e 
reprodução
� Crescimento
• Aumento no número de 
células
� Reprodução
• Fissão binária (maioria)
• Brotamento (micoplasmas, 
leveduras)
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Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
Proteínas importantes no processo de 
divisão celular em bactérias
�Proteínas homólogas às do citoesqueleto de
células eucarióticas:
• MreB (homóloga à actina) – forma celular,
segregação dos cromossomos e localização de
proteínas.
• FtsZ (homóloga à tubulina) – forma celular
regulação da divisão celular e segregação
cromossômica.
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Proteínas Fts
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
Tempo de geração
� Tempo necessário para uma célula se dividir, ou para
que a população duplique em número.
� Fatores que podem influenciar o tempo de geração:
• Composição nutricional e as condições físicas de
incubação.
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Tempo de geração – são variados
• Escherichia coli 20 - 30 min
• Lactobacillus spp 70 - 85 min
• Mycobacterium tuberculosis 18 - 20 horas
Tortora et al, 
Microbiologia, 2012CRESCIMENTO BACTERIANO 
⇒ N= 2n 
O aumento do número de células de
uma cultura bacteriana em crescimento
exponencial ocorre em progressão
geométrica de quociente 2.
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Representação gráfica 
logarítmica x aritmética 
Curva de crescimento
� É um gráfico que mostra a variação do número de
células viáveis (capazes de se reproduzir) em função
do tempo.
� Esta curva é traçada para uma população em um
sistema fechado (tubo contendo meio de cultura).
• Nenhum novo nutriente é adicionado ao sistema e
nenhum produto de excreção metabólico é removido.
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Quais são as fases do 
crescimento microbiano?
Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
Métodos para quantificar diretamente o 
crescimento microbiano
� Contagem de colônias em placa
• Método Pour-Plate (semeadura em profundidade)
• Método de semeadura por espalhamento
� Filtração
� Contagem direta ao microscópio
• Câmara Petroff-Hausser
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Diluição seriada– 30 A 
300 colônias
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock,
2010
Contagem de colônias em placa
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Contagem de colônias em placa
� É a técnica mais utilizada na determinação do
tamanho de uma população bacteriana.
� Vantagem:
• As células viáveis são quantificadas.
�Desvantagem:
• Necessita tempo de incubação, em geral 24h.
�Deve-se utilizar a diluição seriada.
Contagem de bactérias pelo 
método de filtração
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Microbiologia, 2012
Quando 
devemos 
filtrar?
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Contagem direta ao microscópio
� Câmara de Petroff-Hausser
� Vantagem:
• Não necessita de período de incubação – resultado rápido.
� Desvantagens:
• Existe dificuldade para a contagem de bactérias móveis
• São quantificadas células viáveis e mortas.
• Limite de resolução do microscópio
Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
Câmara de contagem Petroff-Hausser
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Métodos indiretos na determinação do 
número de bactérias
� Turbidimetria
� Peso seco
� principalmente para fungos filamentosos
a) fungo é removido do 
meio por filtração
b) seco em dessecador
c) posterior pesagem
Cultura contínua
� Manter uma população
microbiana crescendo
continuamente em uma taxa
particular, na fase logarítmica
� Quimiostato
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
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Efeitos ambientais no crescimento 
microbiano
�Fatores físicos
• Temperatura
• pH
• Pressão osmótica
• Atmosfera gasosa (reposta ao oxigênio)
Efeitos ambientais - Temperatura
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
Por que logo 
acima da 
temperatura 
ótima, o 
crescimento cai 
dramaticamente?
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Curva de crescimento x variação na 
temperatura 
Curva de crescimento característica de diferentes micro-organimos
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
Crescimento de 
hipertermófilos
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Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
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pH – acidez ou alcalinidade?
� Maioria dos micro-organismos cresce melhor perto da 
neutralidade (pH 6,5 – 7,5);
� Maioria das Bactérias: faixa entre pH 7,0 (neutrofílicos).
�Exceções: 
• Bactérias acidófilas: alto grau de tolerância à acidez 
(Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5).
• Bactérias alcalifílicas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 – 11).
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Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
Efeitos ambientais – pressão osmótica
� Pressão osmótica
Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
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Madigan et al, Microbiologia 
de Brock, 2010
Concentração 
de sal
Halotolerantes: não 
necessitam de sal mas toleram 
a presença no meio.
Halófilos: necessitam de sal em 
uma concentração moderada.
Halófilos extremos: necessitam 
de sal em altas concentrações.
Madigan et al, Microbiologia 
de Brock, 2010
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Classificação de acordo com a atmosfera 
de cultivo
�Aeróbios obrigatórios: 21% de oxigênio.
�Anaeróbios obrigatórios: não podem crescer em presença do 
oxigênio. 
� Anaeróbios Facultativos: podem crescer na presença do oxigênio 
ou em anaerobiose.
�Microaerófilos: oxigênio de 1 a 15%.
�Anaeróbios aerotolerantes: anaeróbios que não morrem com a 
exposição ao oxigênio.
Utilização de oxigênio
AERÓBIO
ESTRITOS
alta [O2]
catalase
SOD
ANAERÓBIO 
ESTRITO
sem O2
ausência: 
catalase
SOD
MICRO
AERÓFILO
baixa [O2]
AERÓBIO 
FACULTATIVO
alta e baixa [O2]
catalase
SOD
alta e baixa [O2]
SOD
ANAERÓBIO 
AEROTOLERANTES
Catalase e a
superóxido
dismutase
reduzem para
H2O os
compostos
tóxicos.
Efeito do oxigênio sobre o crescimento de vários tipos de bactérias.
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
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Influência do oxigênio
�Anaeróbios
• Não utilizam Oxigênio para as reações de
produção de energia, podendo ser mortos por ele.
�Methanobacterium – anaeróbio estrito
�Anaeróbio aerotolerante – Lactobacillus
�Anaeróbio facultativo – Escherichia coli
�Microaerófilo – Campylobacter jejuni
�Aeróbio – Micococcus luteus
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
Por que o O2 é tóxico para os 
anaeróbios?
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Enzimas que inativam o O2 tóxico
�Superóxido dismutase
• Elimina os radicais 
superóxido, convertendo-os 
em peróxido de hidrogênio
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
Incubação de anaeróbios
�Métodos de produção de ambiente anaeróbio 
Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
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Incubação
�Métodos de produção de ambiente anaeróbio 
Injeção de N2, H2 e CO2
Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
LABEM
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Em posse dos conhecimentos adequados, é possível 
manipular micro-organismos das mais diversas formas