Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
MÉTODOS IMUNOLÓGICOS UTILIZADOS NA DIAGNOSE DE DOENÇAS DE PLANTAS Julio Daniels EMBRAPA-CPACT, Caixa Postal 403, 96001-970 Pelotas, RS, Brasil RESUMO Os testes imunológicos constituem métodos práticos e precisos de detecção e de diagnose de grande número de patógenos de vegetais, incluindo bactérias, fungos e vírus. Esta revisão abrange os trabalhos realizados por fitopatologistas brasileiros na área de imunologia, com destaque para os testes de Microprecipitação, de Difusão Dupla em Ágar, de Aglutinação de Látex e de ELISA. SUMMARY IMMUNOLOGICAL TESTS FOR DIAGNOSIS OF PLANT DISEASES The immunological tests constitute practical and precise methods for detecting and diagnosing a large number of plant pathogens, including bacteria, fungi, and viruses. This review comprises the papers published by Brazilian plant pathologists in the field of immunology, with emphasis on the Microprecipitation, Agar Double Diffusion, Latex Agglutination, and ELISA tests. INTRODUÇÃO As plantas são suscetíveis a grande número de doenças causadas por fatores abióticos, que incluem níveis prejudiciais de temperatura, de umidade, de luz, de nutrientes, de pH, de poluentes do ar e de pesticidas, e bióticos, que envolvem, entre outros agentes, bactérias, fungos, nematóides e vírus. Embora os sintomas nem sempre sejam aparentes, as plantas doentes são menos produtivas e, em casos extremos, podem ter sua produção completamente comprometida, causando grandes prejuízos aos agricultores. A diagnose de uma doença é o primeiro passo para a adoção de medidas de controle. Para algumas enfermidades, a causa pode ser determinada pelos sintomas; entretanto, em muitos casos, somente o exame dos tecidos vegetais afetados e/ou o uso de técnicas especiais podem levar ao diagnóstico correto. Entre os métodos de diagnose, destacam-se os testes de hibridização de ácidos nuclêicos, referidos em revisões recentes (Batista, 1993; Miller & Martin, 1988; Sequeira, 1992), que possibilitam, inclusive, a detecção de viróides, mas exigem laboratórios bem-aparelhados, e os testes imunológicos, muito mais simples, usados principalmente para doenças causadas por bactérias, por fungos e por vírus. A utilização da imunologia na fitopatologia teve início com os trabalhos de Jensen (1918), que mostrou diferenças sorológicas entre raças de Agrobacterium tumefaciens (Smith & Town) Conn., e de Beale (1928), que constatou a produção de anticorpos específicos em coelhos injetados com suspensões contendo o vírus do mosaico do fumo (tobacco mosaic virus - TMV). No Brasil, entre os trabalhos pioneiros publicados nessa área, é citado o de Silva (1957), que realizou estudos sorológicos com dois fitovírus. Desde então, as dezenas de técnicas imunológicas desenvolvidas, juntamente com o aprimoramento das metodologias usadas na purificação de imunógenos e na produção de anticorpos, tornaram os testes mais específicos, sensíveis e práticos. A imunologia compreende métodos auxiliares na identificação de fitopatógenos que, além da detecção e/ou da diagnose pré-sintomática, permitem a melhoria das inspeções e das certificações de lavouras para produção de sementes, a quantificação de inóculos, a programação de tratamentos químicos e a determinação de espécies de raças de agentes patogênicos (Beriam, 1985; Lankow et al., 1984). Citam-se, também, a determinação do relacionamento taxionômico ou sorotípico de patógenos, a caracterização de epitopos e paratopos (determinação da estrutura antigênica de uma substância), a análise de produtos resultantes da tradução de ácidos nuclêicos "in vitro" e a análise "in vivo" de constituintes relacionados com a patogênese (Hampton et al., 1990). Deve-se acrescentar, ainda, a localização de antígenos e/ou patógenos, em secções histológicas de hospedeiros e de vetores, realizada através de imunomarcação “in situ” com anticorpos conjugados a ouro coloidal e de exame ao microscópio eletrônico (Benhamou et al., 1991; Kitajima, 1983). O histórico da sorologia aplicada às doenças de plantas no Brasil foi revisto por Oliveira et al. (1976). Os periódicos nacionais apresentam revisões sobre aplicações da sorologia (Alba, 1984), métodos utilizados (Rivera, 1987) e detecção sorológica de vírus em leguminosas (Lima, 1979; Lin, 1979; Tolin, 1977), de fungos fitopatogênicos (Figueiredo et al., 1977) e de fitovírus (Oliveira et al., 1976; Sequeira, 1992). A bibliografia internacional sobre esse tema é vasta e diversificada, citando-se, entre outros, os manuais de Ball (1974), de Hampton et al. (1990) e de Harlow & Lane (1988) sobre métodos sorológicos, as revisões de Clark (1981) e de Clark et al. (1986) sobre testes imunoenzimáticos e os trabalhos de Galfrè & Milstein (1981) e de Halk & De Boer (1985) sobre anticorpos monoclonais. Nesta revisão não se pretende cobrir todos os aspectos relacionados à imunologia, mas, dentro do possível, procurar-se-á reunir as principais informações em relação aos métodos sorológicos utilizados pelos fitopatologistas brasileiros, principalmente no que se refere à detecção e à diagnose de patógenos. TERMOS UTILIZADOS A maioria dos termos específicos utilizados com freqüência na imunologia pode ser encontrada no dicionário publicado por Herbert & Wilkinson (1977). A seguir, estão relacionados alguns vocábulos utilizados no texto, conforme definições de Hampton et al. (l990). Antígenos ou imunógenos (antígenos injetáveis) são substâncias, geralmente proteínas ou polissacarídeos, que induzem a uma resposta imune em um animal ou que se ligam especificamente aos anticorpos. Anti-soro é o soro de uma animal que contém anticorpos específicos a um determinado antígeno. Anticorpos são moléculas de imunoglobina produzidas pelos linfócitos B, em resposta a um estímulo antigênico. Cada molécula tem dois ou mais sítios de ligação com antígenos chamados paratopos. Epitopo é o sítio antigênico de uma molécula. Uma substância antigênica (imunógena) pode apresentar um ou mais epitopos. O menor peptídeo que demonstra reatividade antigênica e representa o epitopo possui cerca de cinco a sete aminoácidos. Um epitopo reconhece um paratopo. Anticorpos policlonais são obtidos do soro de um animal inoculado com um antígeno contendo diversos epitopos. Consistem em uma população de anticorpos que reagem com mais de um epitopo. Anticorpos monoclonais são obtidos de linfócitos B individualizados e imortalizados pela fusão com uma célula de mieloma (cancerigena). Ao linfócito é conferida a capacidade de produzir anticorpos e à célula de mieloma de multiplicar-se indefinidamente. Consistem em anticorpos que reagem com apenas um tipo de epitopo. Entre as vantagens do seu uso, são citadas a especificidade, a perpetuidade de produção e a padronização das reações sorológicas. Podem ser selecionados para reagirem com epitopos gerais (comuns a diversos patógenos) ou específicos. Existem cinco classes de moléculas de anticorpos ou imunoglobulinas (Ig), respectivamente, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, além de oito subclasses. A IgM é a primeira classe de anticorpos produzidos por um animal estimulado; seu pico da concentração ocorre cerca de dez dias após o estímulo e, então, cai. A IgG (Fig. 1) é a principal imunoglobulina utilizada nos testes sorológicos e seu pico de concentração ocorre aos quatorze dias do estímulo. Se o animal é reestimulado, a concentração de IgG, geralmente, será muito maior do que as de outras classes de anticorpos. Os anticorpos IgA, IgD e IgE ocorrem em baixíssimas concentraçõese, raramente, são usados como reagentes em diagnósticos. A interação entre um antígeno e um anticorpo envolve ligações de hidrogênio, pontes de sais, cargas eletrostáticas e forças hidrofóbicas, de van der Waal e de Coulomb. Essa interação é reversível e a sua maior ou menor taxa de associação (afinidade) pode ser afetada pela temperatura e pelo pH, entre outras condições. A habilidade de um anticorpo formar complexos imunes estáveis é conhecida por avidez. A IgM, com dez paratopos, tem maior avidez do que a IgG, com dois paratopos. PREPARAÇÃO DE ANTÍGENOS FITOVIROSES Os antígenos normalmente utilizados são constituídos por partículas de vírus inteiras ou por viriões, mas também têm sido usadas unidades constituintes de capa protéica viral (Dust & Carvalho, 1988; Sakakibara et al., 1987) e inclusões induzidas por vírus (Hiebert et al., 1984). O processo de purificação de antígenos virais depende dos equipamentos e dos reagentes disponíveis. O primeiro passo para a purificação de viriões de plantas é uma pesquisa bibliográfica sobre os métodos já utilizados para vírus idênticos ou similares (do mesmo grupo). O ponto de partida desse estudo pode ser a excelente série sobre fitoviroses publicada na Inglaterra (CMI/AAB, 1970 - presente). A consulta deve se estender a livros textos (Mattews, 1981) e a manuais (Brakke, 1990). Alguns trabalhos específicos sobre purificação e sorologia de vírus de plantas podem ser encontrados nas seguintes referências de periódicos brasileiros: Aragão et al. (l993); De Ávila et al., (l980); De Ávila & Dusi (l988); Dusi & Carvalho (l988); Dusi & De Ávila (l988); Gama et al. (l987); Gama & De Ávila (l988); Kuhn et al. (1982); Lima et al. (1981); Lima & Amaral (l985); Lin (l979); Lin & Kitajima (l978); Marinho & Kitajima (l989); Matyis et al. (l975); Oliveira et al. (l981); Pavan & Carvalho (l988); Silva et al. (l961). Figura 1. Representação gráfica da molécula de imunoglobina G, de acordo com Darnell et al. (1986), com os quatro peptídeos (dois pesados e dois leves) ligados por pontes de enxofre. Fc = fragmento cristalizável; Fab = fragmento de ligação com o antígeno. FITOBACTÉRIAS Os antígenos bacterianos, conforme De Boer & Schaad (1990), podem ser extra ou intracelulares, sendo constituídos por proteínas, por polissacarídeos ou por lipídios. Os imunógenos podem consistir em células inteiras (não tratadas, tratadas por calor, fixadas com formol ou com glutaraldeído), de extratos (glicoproteínas, complexos protêicos da membrana) ou de outros componentes purificados (lipopolissacarídeos, ribossomos, enzimas de secreção, flagelos, pêlos). Entre as referências brasileiras, são citados Bach et al. (1982) e Maringoni & Kimati (1987). FUNGOS FITOPATOGÊNICOS Comparados aos vírus, e mesmo às bactérias, os fungos são patógenos complexos, o que dificulta o isolamento de imunógenos adequados para a produção de anticorpos específicos. Extratos das estruturas somáticas e de disseminação (conídios ou esporos) desses organismos, além de antígenos extracelulares (metabólitos encontrados no meio de cultura), têm sido usados mais freqüentemente para imunização. A escolha da fonte dos imunógenos, em geral, tem sido realizada de maneira empírica e subjetiva (Fegies, 1992). Devido à complexidade dos antígenos, os resultados são muito variáveis, permitindo, em alguns trabalhos, a discriminação de isolados (Hardham et al., 1986) e de raças de patógenos (Morton & Dukes, 1966), enquanto que em outros não foi possível a discriminação, dos isolados (Centurion & Kiniati, 1992). Alguns trabalhos determinaram a presença de antígenos comuns em fungos e em plantas (Alba et al., 1983; Alba & De Vay, 1984). OUTROS PATÓGENOS Além de sua aplicação aos patógenos mencionados, a sorologia tem sido utilizada para a detecção de espiroplasmas (Clark et al., 1978; Eden- Green, 1982), de micoplasmas (Aives & Gaspar, 1985; Hsu et al., 1990), de nematóides (Davies & Lander, 1992; El-Sherif & Mai, 1968) e de riquétsias (Beretta et al., 1991; Castro et al., 1987; Leite Jr. & Leite, 1991; Raju et al., 1982). PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ESCOLHA DO ANIMAL Fáceis de obter e de manejar, os coelhos são os animais preferidos para a produção de anticorpos policlonais, porque produzem volumes expressivos de soro com pequenas quantidades de imunógenos. Já os ratos e os camundongos são mais usados na produção de anticorpos monoclonais, enquanto a utilização de galinhas tem a vantagem de permitir o isolamento de anticorpos presentes em ovos (Bar-Joseph & Malkinson, 1980; Harakava & Moraes, 1993). IMUNIZAÇÃO As vias de imunização podem ser: intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperitonial, intradermal, intraarticular e intranodular, podendo- se considerar esta como uma série, em ordem crescente, de efeitos estimuladores à resposta imunológica. A quantidade de imunógenos depende de certos fatores, como pureza, antigenicidade e método de imunização. Um resumo das metodologias pode ser encontrado em Ball et al. (1990). Em geral, são usadas três ou quatro injeções intramusculares, seguidas ou não de uma intravenosa, a intervalos semanais. Nas injeções intramusculares é comum emulsificar o imunógeno com adjuvantes (Freund et al., 1948). De acordo com Oliveira (1975), a técnica mais eficiente de imunização de coelhos consiste em injetar os imunógenos nos linfonódulos. ARMAZENAMENTO DO ANTI-SORO Os soros conservados em congelador perdem, gradativamente, a reatividade (Oliveira et al., 1977). Para melhorar a conservação, é recomendada a liofilização ou a adição de azida de sódio (0,025 %) e de glicerol (50 %), armazenando-se a suspensão em pequenas alíquotas, a cerca de -20 ºC. AQUISIÇÃO DE ANTI-SOROS Embora seja relativamente simples a produção de determinados anticorpos, muitas vezes não vale a pena fazê-lo, uma vez que podem ser facilmente adquiridos de instituições nacionais ou estrangeiras. A Universidade de Brasília (Lin & Kitajima, 1978), o Instituto Agronômico de Campinas (Oliveira et al., 1983) e a Universidade Federal do Ceará (Lima & Santos, 1988) dispõem de sorotecas, com algumas dezenas de anti-soros para patógenos de vegetais. A Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) produz anti-soros para patógenos de plantas em algumas de suas unidades, entre as quais o Centro Nacional de Pesquisas em Hortaliças (CNPH) e o Centro de Pesquisas Agropecuárias de Clima Temperado (CPACT), que dispõem de anti-soros para bactérias e para vírus de vegetais e prestam serviços na diagnose sorológica de doenças de plantas. No exterior, a American Type Culture Collection (l2301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, Estados Unidos) fornece centenas de itens, incluindo grande número de anti-soros para fitoviroses (McDaniel & Emerson, 1990), e o Centro Internacional de la Papa (Casilla Postal 4393, Lima, Peru) que fornece kits para detecção de vírus de batata e de batata-doce. Algumas empresas fornecem anti-soros e kits de detecção e, em alguns casos, prestam serviços de diagnose, citando-se, entre outras, a Agdia Inc. (30380 County Road 6, Elkhart/IN 46514, Estados Unidos), a Bioreba AG (Gempenstrasse 27, Postfach 98, CH-4008 Basel, Suíça), a Boehringer Mannheim France S. A. (2, Avenue du Vercors, 38420 Meylan, França), a Igen, Inc. (l530 E. Jefferson Street, Rockville/MD 20852, Estados Unidos), a Ingetinasa (Hnos. Garcia Noblejas, 41 - 2ª planta, 28037 Madrid, Espanha) e a Loewe Biochemica GmbH (Nordring 38, Postfach 9, D-8156 Otterfing,Alemanha). PREPARAÇÃO DA IMUNOGLOBULINA ABSORÇÃO CRUZADA É feita para remover os anticorpos não específicos para o patógeno, que ocorrem freqüentemente e interferem nas reações sorológicas. Nos testes de fitoviroses, esses anticorpos reagem com alguns constituintes do hospedeiro, destacando-se, entre os métodos de absorção cruzada, a utilização do extrato em pó de hospedeiro sadio (Ball et al., 1990). Nos testes de bacterioses, uma vez que a maioria das células bacterianas utilizadas como imunógenos é cultivada em meios artificiais, isso não ocorre. Mesmo assim, a absorção cruzada tem sido utilizada, em alguns casos, para remover antígenos comuns a outras espécies patogênicas ou saprófitas (Crowley & De Boer, 1982). PURIFICAÇÃO E CONJUGAÇÃO COM ENZIMAS As moléculas de IgG podem ser parcialmente purificadas pela precipitação seletiva com sulfato de amônio, seguida ou não de cromatografia em coluna de celulose, conforme protocolos de Ball et al. (1990). A fosfatase alcalina e a peroxidase, enzimas mais usadas no teste de ELISA, a partir dos trabalhos pioneiros de Avrameas (1969), podem ser conjugadas à imunoglobulina através de diversos métodos (Mackenzie, 1990; O'Sullivan & Marks, 1981). De acordo com Mackenzie (1990), o método do glutaraldeído, simplificado, geralmente dá bons resultados com a fosfatase alcalina, sendo a oxidação do periodato o melhor para a peroxidase. TESTES SOROLÓGlCOS Entre os testes sorológicos mais usados, no Brasil, para diagnose de doenças das plantas, destacam-se: Microprecipitação, Difusão Dupla em Ágar, Aglutinação de Látex e ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). MICROPRECIPITAÇÃO Esse teste, geralmente, é feito em placas de Petri plásticas, quadriculadas com lápis de cera, formando quadrados com aproximadamente um centímetro de lado. Também podem ser utilizadas placas de vidro, desde que tratadas com Formvar a 0,1 % em clorofórmio, para tornar a superfície hidrofóbica. Uma variação do método foi publicada por Romeiro & Fukuda (1983). Este é um teste mais simples, pois consiste em misturar e incubar, por algum tempo, gotas (20 a 40 l) de suspensões de antígenos e de anticorpos, geralmente feitas em água salina (NaCl 0,85 %). Para evitar a evaporação, cobrem-se as gotas com parafina líquida ou com óleo mineral, ou coloca-se a placa em câmara úmida. Para otimização do teste, as diluições dos reagentes são testadas previamente, e os resultados avaliados com o auxílio de uma lupa (10 a 50 aumentos) munida de campo escuro. A formação de precipitados indica a combinação anticorpo/antígeno e, portanto, a reação (Fig. 2). O teste não funciona com vírus em baixas concentrações no hospedeiro, requerendo, na solução a testar, pelo menos, 0,5 g de viriões/ml (Martin, 1985). O protocolo com detalhes para a realização do teste pode ser encontrado em Ball (1974). Pela baixa sensibilidade e pela necessidade de grandes quantidades de anti-soros, o teste vem sendo substituído por outros, especialmente pelo ELISA, como no caso Figura 2. Representação gráfica do Teste de Microprecipitação, conforme Fribourg & Nakashima (1981). das diagnoses de rotina, em programas de produção de batata-semente, em que era muito utilizado. Mais recentemente, seu uso tem sido limitado à determinação de títulos de anti-soros. DIFUSÃO DUPLA EM ÁGAR Nesse teste, desenvolvido por Ouchterlony (1948) e introduzido na diagnose de fitoviroses por Van Slogteren (l955), as suspensões com antígenos e com anticorpos são colocadas separadamente em cavidades abertas na camada de ágar contida em placa de Petri. Os reagentes se difundem pelo ágar e, quando se encontram, formam linhas de precipitação facilmente visíveis. O teste é simples, mas pouco sensível, exigindo o uso de anti-soros concentrados e, em casos de baixas concentrações no hospedeiro, de antígenos semipurificados. A principal vantagem é a determinação das interrelações entre antígenos e anticorpos, pelas linhas de precipitação que se desenvolvem. A formação de uma linha contínua entre as cavidades ocupadas pelos antigenos indica sua identidade serológica, enquanto a presença de esporão (fragmento da linha que se destaca em relação a uma das cavidades) revela existência de relação, mas não de identidade (Fig. 3). São utilizados géis com 0,5 a 1,0 % de agar, sendo que, quanto maior a concentração, menores serão os poros e mais demorada a difusão dos reagentes. Os viriões alongados, com mais de 500 mm de comprimento, difundem-se com dificuldade no gel, devendo ser dissociados com o detergente dodecil sulfato de sódio ou por outros métodos (Van Regenmortel, 1978). A adição de ciclohexamida ao ágar melhora a performance do teste para a detecção de fitobactérias (Sugimori et al., 1986). No Brasil, a primeira utilização do teste de difusão dupla em ágar foi realizada por Silva et al. (1961), em trabalhos com o vírus da necrose branca do fumo. Excluindo as diagnoses de rotina, é o teste mais utilizado por fitopatologistas brasileiros na detecção de vírus (Barbosa & Paguio, 1982; De Ávila et al., 1980; Lima et al., 1981; Lin et al., 1981), em estudos epidemiológicos (Batista et al., 1980), em levantamentos de incidência (Lima et al., 1991), nas comparações de isolados de fitovírus (Alba & Oliveira, 1976; Gaspar et al., 1985; Lin et al., 1980, Lin & Hill, 1982; Lovisolo et al., 1986; Nagata et al., 1993; Vasconcelos & Lima, 1981), de fungos fitopatogênicos (Cardoso & Oliveira, 1977; Geraldi & Kimati, 1982; Ghini & Kimati, 1985; Paiva et al., 1990), de fitobactérias (Maringoni & Kimati, 1987; Sugimori et al., 1982), na detecção de bactérias em sementes (Donato et al., 1986) e na comparação de antígenos comuns entre plantas e fungos (Alba et al., 1983; Alba & De Vay, 1984). Figura 3. Representação gráfica do Teste de Difusão Dupla em Ágar, conforme Rivera (1987), sendo os paratopos das imunoglobulinas representados por A, B, C e D, e os epitopos dos antígenos, por a, b, c e d. Tipos de reações: 1. Identidade entre os epitopos; 2. Parcial identidade entre os epítopos; 3. Não identidade. AGLUTINAÇÃO DE LÁTEX É uma modificação do teste de Microprecipitação, visando a ampliar o precipitado decorrente da combinação anticorpo/antígeno. O látex comercial (Difco, Sigma, etc.) usado no teste é adquirido como uma suspensão de microesferas de poliestireno com aproximadamente 800 nm de diâmetro. A sensibilização consiste em misturar as esferas de látex com anticorpos que ficam adsorvidos por elas (Fribourg, 1981; Fig. 4A). Quando a suspensão de látex sensibilizado é misturada com o extrato da planta contendo os antígenos específicos, ocorrem os agregados (Fig. 4B). Segundo Salazar (1982), o método apresenta vantagens sobre a Microprecipitação, pois não requer centrifugação do extrato da planta, a reação é mais rápida, os resultados são visíveis a olho nu e usa menos anti-soro, sendo de cem a mil vezes mais sensível do que a Microprecipitação. A principal desvantagem é a dependência do látex importado. Para superar essa dificuldade, têm sido testados substitutos, como células do sangue (Rajeshwari et al., 1981) e gelatina (Natsuaki et al., 1988). O teste tem sido utilizado no Brasil para detecção de vírus (Daniels et al., 1984; Gama et al., 1987; Gama & De Ávila, 1988) e de bactérias (Castro et al., 1991; Castro et al., 1992; Silveira et al., 1992). ELISA Nos testes de ELISA, a combinação anticorpo/antígeno é determinada pela reação de uma enzima (hidrólise), geralmente fosfatase alcalinaou peroxidase, com o seu substrato. Portanto, o ELISA é um teste imunoenzimático, no qual as atividades imunológicas e enzimáticas das moléculas são manipuladas, visando a aumentar a especificidade e a sensibilidade. Pode ser feito em diversos suportes sólidos, com diferentes tipos de reagentes, o que possibilita muitas modificações nos procedimentos originalmente utilizados. Assim, são encontradas dezenas de formas ou de tipos de ELISA na literatura (Barbara & Clark, 1982; Kaniewski & Thomas, 1988; Koenig & Paul, 1982; Mowat & Dawson, 1987; Zrein et al., 1986), além das descritas no texto. Os tipos de ELISA dividem-se em dois grupos: direto, no qual o anticorpo da detecção é usado, também, na conjugação com a enzima e indireto, no qual o conjugado não é especifico para o antígeno a ser detectado, mas sim para o anticorpo ou reagente usado na detecção. As vantagens do teste incluem grande sensibilidade, maior do que a Aglutinação de Látex, e adequação aos testes de rotina. A principal desvantagem está no grande número de passos necessários para sua realização, o que inclui a lavagem sistemática das placas de microtitulação entre as etapas. A versatilidade do ELISA permite que, em trabalhos de indexação de rotina, Figura 4. Representação gráfica do Teste de Aglutinação de Látex, conforme Fribourg & Nakashima (1981). A. Sensibilização das esferas de látex com imunoglobulinas; B. Reação serológica do látex sensibilizado com os antígenos homólobos. sejam detectados antígenos em sementes (Jafarpour et al., 1979), e que, não interessando a identidade dos patógenos, seja usado para detecção de diversos antígenos simultaneamente (Dusi; 1969; Salazar, 1979). Um dos fatores que encarecem o teste de ELISA é a placa de microtitulação. Porém, tem sido demonstrada a possibilidade de esta ser reutilizada (Bar-Joseph et al., 1979; Meissner Filho, 1989). A avaliação do teste pode ser visual, ou com o auxílio de um colorímetro, que mede a densidade ótica do produto da reação. A interpretação dos dados pode ser feita de acordo com Sutula et al. (1986). DAS (DOUBLE ANTIBODY SANDWICH) - ELISA É um método direto, popularizado por Clark & Adams (1977) para diagnose de fitoviroses. No Brasil, foi utilizado pela primeira vez para a detecção da bactéria Xanthomonas campestris pv. citri (Hasse) Dye (Bach et al., 1981). Envolve quatro etapas (Fig. 5): na primeira, os anticorpos são adsorvidos; na segunda, os antígenos correspondentes, se presentes na amostra, aderem aos anticorpos; na terceira, é adicionado o conjugado, que, na presença dos antígenos, formará o sanduíche; e, na quarta, é colocado o substrato da enzima, sendo produzida a reação calorimétrica característica. No Brasil, o teste tem sido utilizado para a detecção de diversos vírus de plantas (Araújo et al., 1989; Daniels et al., 1984; De Ávila, 1986; De Ávila et al., 1988; Dusi et al., 1988; Marinho et al., 1993), da bactéria X. c. pv. citri (Bach et al., 1982) e da riquétsia causadora da escaldadura das folhas da ameixeira (Castro et al., 1987). PAS (PROTEIN A SANDWICH) - ELISA É um método indireto, utilizado para diagnose de fitoviroses, pela primeira vez, por Edwards & Cooper (l985). Baseia-se na propriedade da proteína A, extraída de Streptococcus aureus, de ligar-se à parte cristalizável (Fc) da molécula IgG de diversas espécies de animais (Harlow & Lane, 1988). Envolve seis etapas (Fig. 5): Inicialmente, é colocada a proteína A; a seguir, o anti-soro bruto, convenientemente diluído; após, são adicionadas amostras a serem testadas; seguindo-se a reaplicação do anti-soro da segunda etapa; na quinta etapa, é colocado o conjugado de enzima com proteína A; C, finalmente, o substrato da enzima. Embora com maior número de etapas, o método tem a vantagem de utilizar anti-soros brutos e um só tipo de conjugado. Tem sido empregado em testes de anti-soros, em diagnoses de rotina e na caracterização de isolados de vírus (Daniels & Campbell, 1992; Daniels & Castro, 1991; Hughes & Thomas, 1988). Figura 5. Representação gráfica de testes de ELISA: DAS = double antibody sandwich; PAS = protein A sandwich; TAS = triple antibody sandwich. TAS (TRIPLE ANTIBODY SANDWICH) - ELISA Com o aumento da disponibilidade de anticorpos monoclonais, esse teste é cada vez mais utilizado. Também é um método indireto e envolve cinco etapas (Ellis & Wieczorek, 1992; Fig. 5), que podem ser reduzidas a quatro, no caso de mistura prévia dos reagentes dos passos três e quatro (J. Daniels, não publicado). Primeiramente, a placa é recoberta com anticorpos policlonais produzidos em coelhos; a seguir, são colocadas as amostras para testar; na terceira etapa, é colocado o segundo anticorpo (um monoclonal produzido em ratos); após, é adicionado o conjugado de enzima com o terceiro anticorpo (IgGs de outra espécie animal, que reagem com lgGs de ratos); finalmente, é adicionado o substrato da enzima. No Brasil, o teste tem sido utilizado para a detecção do vírus do nanismo da ameixeira (prune dwarf virus - PDV) e do vírus da mancha anelar necrótica de Prunus (prune necrotic ringspot virus - PNRSV) em fruteiras de clima temperado (J. Daniels, não publicado). DOT-ELISA O termo 'dot' não e um acrônimo de palavras inglesas, como os usados nos outros tipos de ELISA já descritos. É um vocábulo que se traduz por 'pequena mancha', 'pingo', 'ponto’ etc. O que o distingue do ELISA tradicional é o suporte sólido utilizado. Em lugar da placa de microtitulação, é usada a membrana de nitrocelulose ou de nylon. Outra modificação importante ocorre no desenvolvimento da reação, em que se usam diferentes sistemas de substrato/enzima. Detalhes desse teste podem ser encontrados em Hammond & Jordan (1990) e em Lazarovits (l990). Entre outras vantagens, possibilita a aplicação das amostras (tecido de plantas e vetores) diretamente nas membranas (Navot et al., 1988). Só recentemente vem sendo utilizado por pesquisadores brasileiros (Marinho & Dusi, 1991; Pio-Ribeiro et al., 1993; Pozzer et al., 1993). OUTROS TESTES A microscopia eletrônica imunoespecífica (immuno specific electron microscopy - ISEM), conforme Derrick (1973), também chamada de microscopia eletrônica de imunoadsorção - MEIAD, é um teste muito sensível. Tem sido utilizado em dois laboratórios brasileiros que dispõem de microscópio eletrônico, o do Instituto Agronômico de Campinas e o da Universidade de Brasília (Gama & De Ávila, 1988; Oliveira et al., 1988; Vega et al., 1982; Vega &, Rezende, 1993), que têm realizado, inclusive, aperfeiçoamentos na técnica (Ribeiro & Kitajima, 1983; Vega & Kuniyuki, 1986). A técnica de difusão simples em ágar tem sido utilizada para identificação de viroses em caupi (Lima & Purcifull, 1979), em batata (Araújo & Carvalho, 1984) e em feijão (Dusi et al., 1988). São citados, ainda, a imunofluorescência, em que os anticorpos são marcados com fluorocromos, por exemplo, o isotiocianato de fluoresceína (Gingery, 1990), e a reação é observada com o auxílio de um microscópio de fluorescência, e o rádio imunoensaio, que utiliza como marcador um isótopo radioativo, por exemplo, o Iôdo 125, sendo a reação medida com um contador de cintilações, ou pela observação através da impressão em filme fotográfico (Ghabrial & Shepherd, 1980). LITERATURA CITADA ALBA, A.P.C. & DE VAY, J.E. 1984. Detecção de antígenos comuns entre Phytophthora infestans (Mont) De Bary e Solanum spp. por ELISA indireto. Fitopatol. Bras. 9:375. (Res.). ALBA, A.P.C.; GUZZO, S.D.; BERETTA, M.J.G.;MAHLOW, M.F.P. & MORAES, W.B.C. 1983. Common antigens in extracts of Hemileia vastatrix urediniospores and of Coffea arabica leaves and roots. Fitopatol. Bras. 8:473-83. ALBA, A.P.C. & OLIVEIRA, A.R. 1976. Estudos sorológicos de vírus do grupo do vírus Y da batata, que ocorrem no estado de São Paulo. Rev. Soc. Bras. Fitopatol. 9:31. (Res.). ALVES, M.N. & GASPAR, J.O. 1985. Purificação do micoplasma do anão do milho 'corn stunt’ visando obtenção de antígenos para preparar anti- soros específicos. Summa Phytopathol. 11:57-8. (Res.). ARAGÃO, F.J.L.; MARINHO, V.L.A. & KITAJIMA, E.W. 1993. Ocorrência do vírus X do cactus (Cactus virus X) em cactáceas no Brasil e um método novo para purificá-lo diretamente de tecido de cactus. Fitopatol. Bras. 18:112-7. ARAÚJO, M.A. & CARVALHO, M.G. 1984. Difusão real simples, modificada, como método diagnóstico para o mosaico latente em batateira. Fitopatol. Bras. 9:415. (Res.). ARAÚJO, S.; DUSI, A.N. & KITAJIMA, E.W. 1989. Levantamento da ocorrência do vírus da mancha anular clorótica de hibiscus em algumas regiões do Brasil por ELISA. Fitopatol. Bras. 14:124. (Res.). AVRAMEAS, S. 1969. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibodies. Immunochemistry 6:43-52. BACH, E.E.; ALBA, A.P.C.; CIVEROLO, E.L.; PEREIRA, A.L.G. & ZAGATTO, A.G. 1981. Aplicação do teste de ELISA na serodiagnose da bactéria Xanthomonas citri (Hasse) Dowson em suspensão. Fitopatol. Bras. 6:542. (Res.). BACH, E.E.; ALBA, A.P.C. & RODRIGUES NETO, J. 1982. Detection of strains of Xanthomonas campestris pv. citri (Hasse) Dye by enzime- linked immunosorbent assay (ELISA). Fitopatol. Bras. 7:407-15. BALL, E.M. 1974. Serological tests for the identification of plant viruses. St. Paul, MN, APS Press. BALL, E.M.; HAMPTON, R.O. & SHAAD, N.W. 1990. Polyclonal antibodies. In: Hampton, R.O., Ball, E.M. & De Boer, S.H. (Ed.). Serological methods for detection and identification of viral and bacterial plant pathogens. St. Paul, MN, APS Press, p.33-54. BARBARA, D.I. & CLARK, M.F. 1982. A simple indirect ELISA using F(ab')2 fragments of immunoglobulin. J. Gen. Virol. 58:315-22. BARBOSA, F.R. & PAGUIO, O.R. 1982. Identificação do vírus da mancha anular do mamoeiro no estado de Pernambuco. Fitopatol. Bras. 7:37-45. BAR-JOSEPH, M. & MALKINSON, M. 1980. Hen egg yolk as a source of antiviral antibodies in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): a comparison of two plant viruses. J. Virol. Meth, 1:179-83. BAR-JOSEPH, M.; MOSCOVITZ, M. & SHARAFI, Y. 1979. Reuse of coated enzyme-linked immunosorbent assay plates. Phytopathology 69:424-6. BATISTA, M.F. 1993. Métodos moleculares para identificação de patógenos de plantas. Rev. An. Patol. Plant. 1:165-96. BATISTA, M.F.; COSTA, C.L. & LIN, M.T. 1980. Disseminação do vírus do mosaico da abóbora em campo experimental. Fitopatol. Bras. 5:385- 6. (Res.). BEALE, H.A. 1928. Immunologic reactions with tobacco mosaic virus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 25:602. BENHAMOU, N.; GRENIER, J. & ASSELIN, A. 1991. Immunogold localization of pathogenesis-related protein P14 in tomato root cells infected by Fusarium oxysporium f.sp. radicis-lycopersici. Physiol. Mol. Plant Pathol. 38:237-54. BERETTA, M.I.G.; BACH, E.E.; ROSSET'TI, V.; LEE, R.F. & DERRICK, K.S. 1991. Serological detection of Xylella fastidiosa associated with citrus variegated chlorosis disease in Brazil. Summa Phytopathol. 17:10. (Res.). BERIAM, L.O.S. 1985. A serologia como método auxiliar no controle de fitovírus. Summa Phytopathol. 11:121-6. BRAKKE, M.K. 1990. Preparation of antigens, viruses. In: Hampton, R.O., Ball, E.M. & De Boer, S.H. (Ed.). Serological methods for detection and identification of viral and bacterial plant pathogens. St. Paul, MN, APS Press, p. 15-26. CARDOSO, R.M.G. & OLIVEIRA, A.R. 1977. Diferenciação serológica entre isolamentos de Ceratocystis paradoxa (Dade) C. Moreau. Fitopatol. Bras. 2:70. (Res.). CASTRO, L.A.S. de; COUTO, M.O. & SILVEIRA, J.R.P. 1992. Utilização do látex sensibilizado para diagnose de Pseudomonas solanacearum. Fitopatol. Bras. 17:182. (Res. ). CASTRO, L.A.S. de; FINARDI, N.L.; DANIELS, J. & MEDEIROS, A.R.M. de. 1987. Incidência da escaldadura das folhas da ameixeira nos estados do sul do Brasil. In: XIX CONGRESSO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA. Campinas, SP. Anais... Soc. Bras. Frutic., 197-102. CASTRO, L.A.S. de; MARTINS, O.M.; SILVEIRA, J.R.P. & COUTO, M.E.O. 1991. Avaliação serológica de Xanthomonas campestris pv. pruni. Fitopatol. Bras. 16:48. (Res. ). CENTURION, M.A.P.C. & KIMATI, H. 1992. Caracterização serológica de Fusarium moniliforme e F. moniliforme var. subglutinans. Summa Phytopathol. 18:239-46. CLARK, M.F. 1981. Immunosorbent assays in plant pathology. Ann. Rev. Phytopathol. 19:83-106. CLARK, M.F. & ADAMS, A.N. 1977. Characteristics of the microplate method of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34:475-83. CLARK, M.F.; FLEGG, C.L.; BAR-JOSEP H.M. & ROTTE, M.S. 1978. The detection of Spiroplasma citri by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Phytopathol. Zeist. 92:332-7. CLARK, M.F.; LISTER, R.M. & BAR-JOSEP H.M. 1986. ELISA techniques. Meth. Enzymol. 118:742-66. COMMONWEALTH MYCOLOGICAL INSTITUTE/ASSOCIATION OF APPLIED BIOLOGISTS (CMI/AAB). 1970-presente. Descriptions of plant viruses. Surey, England. CROWLEY, C.F. & DE BOER, S.H. 1982. Non pathogenic bacteria associated with potato stems cross-react with Corynebacterium sepedonicum antisera in immunofluorescence. Am. Potato J. 59:1-8. DANIELS, J. & CAMPBELL, R.N. 1992. Characterization of cucumber mosaic virus isolates from California. Plant Dis. 76:1245-50. DANIELS, J. & CASTRO, L.A.S. de 1991. Utilização do PAS-ELISA na diagnose de rotina de doenças de plantas. Fitopatol. Bras. 16:50. (Res.). DANIELS, J.; PAIVA, E.; ASSIS, M. de & CASTRO, L.A.S. de. 1984. Produção e utilização de anti-soros para diagnose de viroses em batata. Fitopatol. Bras. 9:412. (Res. ). DARNELL, J.; LODISH, H. & BALTIMORE, D. 1986. Molecular cell biology. New York, Scientific American Books. DAVIES, K.G. & LANDER, E.B. 1992. Immunological differentiation of root-knot nematodes (Meloidogyne spp) using monoclonal and polyclonal antibodies. Nematológica 38:353-66. DE ÁVILA, A.C. & DUSI, A.N. 1988. Purificação e serologia, por ELISA, do vírus do mosaico da melancia 1 (PRS V-W). Fitopatol. Bras. 13:387- 8. DE ÁVILA, A.C.; DUSI, A.N.; NAKASHIMA, J. & SALAZAR, L.F. 1988. Produção de anti-soros para detecção de viroses da batata por ELISA. Fitopatol. Bras. 13:144. (Res.). DE ÁVILA, A.C.; GAMA, M.I.C.S.; NAKASHIMA, J. & BEEK, M.A. 1986. Produção de anti-soro em ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) para detecção do vírus Y da batata em batata (Solanum tuberosum L.). Fitopatol. Bras. 11:297. (Res.). DE ÁVILA, A.C.; LIN, M.T.; KITAJIMA, E.W.; CUPERTINO, F.P. & COSTA, C.L. 1980. Caracterização de um isolado do vírus do mosaico do nabo obtido de couve manteiga (Brassica oleracea var. acephala Dc.) sem sintomas. Fitopatol. Bras. 5:311-28. DE BOER, S.H. & SCHAAD, N.W. 1990. Preparation of antigens, bacteria. In: Hampton, R.O., Ball, E.M. & De Boer, S.H. (Ed.). Serological methods for detection and identification of viral and bacterial plant pathogens. St. Paul, MN, APS Press, p.27-31. DERRICK, K.S. 1973. Quantitative assay for viruses using serologically- specificelectron microscopy. Virology 56:652-3. DONATO, J.L.; SUGIMORI, M.H. & OLIVEIRA, A.R. 1986. Diagnóstico serológico de Xanthomonas campestris pv. malvacearum em lotes de sementes de algodão. Summa Phytopathol. 12:9. (Res.). DUSI, A.N. 1989. Utilização de combinação de anti-soros na detecção simultânea de PVS, PVX e PVY em batata-semente. Fitopatol. Bras. 14:129. (Res.). DUSI, A.N. & CARVALHO, M.G. 1988. Purificação e imugenicidade da proteína capsidial do vírus do mosaico comum do feijoeiro (VMCF). Fitopatol. Bras. 13:252-5. DUSI, A.N.; CARVALHO, M.G. & ZAMBOLIN, E.M. 1988. Uso de ELISA e difusão radial simples na detecção do vírus do mosaico comum do feijoeiro em sementes de feijão. Fitopatol. Bras. 13:282-3. DUSI, A.N. & DE ÁVILA, A.C. 1988. Purificação e serologia do vírus do mosqueado andino da batata (APMV), por ELISA direto e indireto. Fitopatol. Bras. 13:389-91. EDEN-GREEN, S.J. 1982. Detection of corn stunt spiroplasm "in vivo" by ELISA using antisera to extracts from infected corn plants (Zea mays). Plant Pathol. 31:289-97. EDWARDS, M.L. & COOPE R, J.I. 1985. Plant virus detection using a new form of indirect ELISA. J. Virol. Meth. 11:309-19. ELLIS, P.J. & WIECZOREK, A. 1992. Production of monoclonal antibodies to beet western yellows virus and potato leafroll virus and their use in luteovirus detection. Plant Dis. 76:75-8. EL-SHERIF, M. & MAI, W.F. 1968. The use of immunodiffusion in nematode identification. Nematológica 14:593-5. FEGIES, N.C. 1992. Técnicas imunoenzimáticas para detecção de fungos fitopatogênicos. Fitopatol. Bras. 17:147. FIGUEIREDO, M.B.; ALBA, A.P.C. & OLIVEIRA, A.R. 1977. Serologia aplicada ao estudo de fungos fitopatogênicos. Summa Phytopathol. 3:233-59. FREUND, J.; THOMPSON, K.; HOUGH, H.B.; SOMMER, H.E. & PISANI, T.H. 1948. Antibody formation and sensitisation with the aid of adjuvants. J. Immunol. 60:383-98. FRIBOURG, C.E. 1981. Procedure for latex sensitisation: laboratory practical guide. Lima, Peru, Centro Internacional de la Papa. FRIBOURG, C.E. & NAKASHIMA, J. 1981. Prueba de látex para detectar virus de papa. Lima, Peru, Centro Internacional de la Papa. (Diapositivas didacticas. Guia II/1). GALFRÈ, G. & MILSTEIN, C. 1981. Preparation of monoclonal antibodies strategies and procedures. Meth. Enzymol. 73:3-46. GAMA, M.I.C.S. & DE ÁVILA, A.C. 1988. Detecção de vírus em alho látex sensibilizado e microscopia eletrônica imuno-específica. Fitopatol. Bras. 13:66-9. GAMA, M.I.C.S.; DE ÁVILA, A.C. & NAKASHIMA, J. 1987. Produção de látex sensibilizado para detecção do vírus X da batata. Fitopatol. Bras. 12:273-5. GASPAR, J.O.; BERIAM, L.O.S.; ALVES, M.M.; OLIVEIRA, A.R. & COSTA, A.S. 1985. Identidade serológica entre os vírus do mosaico angular do feijoeiro e do mosqueado fraco do caupi. Fitopatol. Bras. 10:195-9. GERALDI, M.A.P. & KIMATI, H. 1982. Caracterização patogênica e serológica de Coletotricum graminicola (Ces.) Wils. (sensu Arx, 1957) do trigo (Triticum aestivum L.). Summa Phytopathol. 8:16-28. GHABRIAL, S.A. & SHEPHERD, R.J. 1980. A sensitive radioimmunosorbent assay for detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 48:311-7. GHINI, R. & KIMATI, H. 1985. Caracterização morfológica, serológica e patogênica de espécies de Botrytis que ocorrem na cultura da cebola (Allium cepa L.). Summa Phytopathol. 11:127-39. GINGERY, R.E, 1990. Fluorescent antibody test, viruses. In: Hampton, R.O., Ball, E.M. & De Boer, S.H. (Ed.). Serological methods for detection and identification of viral and bacterial plant pathogens. St. Paul, MN, APS Press, p.287-93. HALK, E.L. & DE BOER, S.H. 1985. Monoclonal antibodies in plant disease research. Ann. Rev. Phytopathol. 23:321-50. HAMMOND, J. & JORDAN, R.L. 1990. Dot blots (viruses) and colony screening. In: Hampton, R.O., Ball, E.M. & De Boer, S.H. (Ed.). Serological methods for detection and identification of viral and bacterial plant pathogens. St. Paul, MN, APS Press, p.237-248. HAMPTON, R.O.; BALL, E.M. & DE BOER, S.H. 1990. Serological methods for detection and identification of viral and bacterial plant pathogens: a laboratory manual. St. Paul, MS, APS Press. HARAKAVA, R. & MORAES, W.B.C. 1993. Obtenção de anticorpos para antígenos de Hemileia vastatrix e Coffea arabica a partir de ovos postos por galinhas poedeiras imunizadas. Fitopatol. Bras. 18:333. (Res.). HARDHAM, A.R.; SUZAKI, E. & PERKIN, J.L. 1986. Monoclonal antibodies to isolate-, species-, and genus specific components on the surface of zoospores and cysts of the fungus Phytophthora cinnamomi. Can. J. Bot. 64:311-21. HARLOW, E. & LANE, D. 1988. Antibodies: a laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory. HERBERT, W.J. & WILKINSON, P.C. 1977. Dictionary of immunology. Boston, Blackwell Scientific Publications. HIEBERT, E.; PURCIFULL, D.E. & CHRISTIE, R.G. 1984. Purification and immunological analyses of plant virus inclusion bodies. In: Maramoroch, K. & Koprowski, H. (Ed.). Methods in virology. New York, Academic Press, v.8, p.225-79. HSU, H.T.; LEE, I.M.; DAVIS, R.E. & WANG, Y.C. 1990. Immunization for generation of hibridoma antibodies specifically reacting with plants infected with a mycoplasmalike organism (MLO) and their use in detection of MLO antigens. Phytopathology 80:946-50. HUGHES, A. & THOMAS, B.J. 1988. The use of protein A-sandwich ELISA as a means for quantifying serological relationships between members of the tobamovirus group. Ann Appl. Biol. 112:117-26. JAFARPOUR, B.; SHEPHERD, R.J. & GROGAN, R.G. 1979. Serological detection of bean common mosaic and lettuce mosaic viruses in seed. Phytopathology 69:1125-9. JENSEN, C.O. 1918. Undersogelser vedrorende nogle suulstilignende dannelser hos planter. Ser umlaboratorium Meddelelser fra den Kgl. vetemiaer-og landbohojskoles aarsskrift. Copenhagen, Nielsen & Lydiche. KANIEWSKI, W.K. & THOMAS, P.E. 1988. A two-step ELISA for rapid, reliable detection of potato viruses. Am. Potato J. 65:561-71. KITAJIMA, E.W. 1983. Utilização do ouro coloidal em imunomicroscopia eletrônica para detecção de antígenos in situ. Fitopatol. Bras. 8:628. (Res.). KOENIG, R. & PAUL, H.L. 1982. Variants of ELISA in plant virus diagnosis. J. Virol. Meth. 5:113-25. KUHN, G.B.; LIN, M.T. & KITAJIMA, E.W. 1982. Algumas propriedades do vírus do mosaico do picão. Fitopatol. Bras. 7:185-95. LANKOW, R.K.; WOODHEAD, S.H.; PATTERSON, R.J.; MASSEY, R. & SCHOCHETMAN, G. 1984. Monoclonal antibody diagnostics in plant disease management. Plant Dis. 68:1100-1. LAZAROVITS, G. 1990. The dot immunobinding assay (DIA)-Bacteria. In: Hampton, R.O., Ball, E.M. & De Boer, S.H. (Ed.). Serological methods for detection and identification of viral and bacterial plant pathogens. St. Paul, MN, APS Press, p.249-26 1. LEITE Jr, R.P. & LEITE, R.M.V.B.L. 1991. Associação de Xylella fastidiosa com a clorose variegada dos citros. Summa Phytopathol. 17:7. (Res.). LIMA, J.A.A. 1979. Testes sorológicos para identificação de vírus de leguminosas. Fitopatol. Bras. 4:215-25. LIMA, J.A.A. & AMARAL, M.R.G. 1985. Purificação e serologia de 'squash mosaic virus' isolado de melancia. Fitopatol. Bras. 10:605-11. LIMA, J.A.A.; OLIVEIRA, F.M.E.S.; KITAJIMA, E.W. & LIMA, M.G.A. 1981. Propriedades biológicas, citológicas e sorológicas de um potyvirus isolado de feijão de corda no Ceará. Fitopatol. Bras. 6:205-16. LIMA, J.A.A. & PURCIFULL, D.E. 1979. Técnicas sorológicas de simples difusão em ágar e de microscopia eletrônica paraidentificação de vírus de caupi. Fitopatol. Bras. 4:299-308. LIMA, J.A.A.; PURCIFULL, D.E. & GONÇALVES, M.F.G. 1991. Levantamento sorológico da incidência do vírus da tristeza dos citros em municípios cearenses. Fitopatol. Bras. 16:276-9. LIMA, J.A.A. & SANTOS, A.A. 1988. Vírus que infectam o caupi no Brasil. In: Araujo, J.P.P. & Watts, E.E. (Ed.). O caupi no Brasil. Brasília, IICA/EMBRAPA, p.509-45. LIN, M.T. 1979. Purificação e serologia de vírus de leguminosas e milho no Brasil. Fitopatol. Bras. 4:203-13. LIN, M.T.; ANJOS, J.R.N. & RIOS, G.P. 1980. Agrupamento serológico de 14 isolados de 'cowpea mosaic virus-Arkansas serogroup' obtidos no Brasil Central. Fitopatol. Bras. 5:418-9. (Res.). LIN, M.T. & HILL, J.H, 1982. Identificação dos determinantes antigênicos e isolamento do anticorpo comum dos 4 sorotipos do vírus do mosaico severo do caupi. Fitopatol. Bras. 7:540. (Res.). LIN, M.T. & KITAJIMA, E.W. 1978. Preparo de anti-soros para a seroteca da Universidade de Brasília. Fitopatol. Bras. 3:93-4. (Res.). LIN, M.T.; KITAJIMA, E.W. & RIOS, G.P. 198 1. Detecção serológica de alguns vírus em caupi no Brasil Central. Fitopatol. Bras. 6:73-85. LOVISOLO, O.; MARINHO, V.L.A.; LIN, M.T. & KITAJIMA, E.W. 1986. Relações serológicas do vírus do endurecimento dos frutos do maracujazeiro ('passion fruit woodiness virus') com outros potyvirus. Fitopatol. Bras. 11:358. (Res.). MACKENZIE, D.J. 1990. Preparation of antibody-enzyme conjugates. In: Hampton, R.O., Ball, E.M. & De Boer, S.H. (Ed.). Serological methods for detection and identification of viral and bacterial plant pathogens. St. Paul, MN, APS Press, p.87-92. MARINGONI, A.C. & KIMATI, H. 1987. Diferenciação sorológica entre isolados de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria de pimentão e de tomateiro. Fitopatol. Bras. 12:322-4. MARINHO, V.L.A.; BATISTA, M.F.; FONSECA, M.E.N. & CIAMPI, A.Y. 1993. Indexação do banco de germoplasma de batata 'in vitro' do CENARGEN, quanto à presença de vírus e viróides. Fitopatol. Bras. 18:290. MARINHO, V.L.A. & DUSI, A.N, 1991. Detection of virus in sweet potato (Ipomea batatas) germplasm introduced from Japan for research purpose. In: XII International Plant Protection Congress, Rio de Janeiro. MARINHO, V.L.A. & KITAJIMA, E.W. 1989. Método simplificado de purificação de alguns potyvirus. Fitopatol. Bras. 14:91-3. MARTIN, R.R. 1985. Recent advances in virus detection. Hort. Science 20:837-45. MATHEWS, R.E.F. 1981. Plant virology. New York, Academic Press. MATYIS, J.C.; SILVA, D.M.; OLIVEIRA, A.R. & COSTA, A.S. 1975. Purificação e morfologia do vírus do mosaico dourado do tomateiro. Summa Phytopathol. 1:267-74. MCDANIEL, L.L. & EMERSON, E.L. 1990. Catalogue of plant viruses and antisera. 6 ed. Rockville, Maryland, American Type Culture Collection. MEISSNER FILHO, P.E. 1989. Reutilização de placas de microtitulação para os vírus X, Y, S e PLRV. Fitopatol. Bras. 14:129. (Res.). MILLER, S.A. & MARTIN, R.R. 1988. Molecular diagnosis of plant disease. Ann. Rev. Phytopathol. 26:409-32. MORTON, D.J. & DUKES, P.D. 1966. Serological differentiation of race l from race 2 of Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici. Plant Dis. Rep. 50:444-5. MOWAT, W.P. & DAWSON, S. 1987. Detection and identification of plant viruses by ELISA using crude sap extracts and unfractionated antisera. J. Virol. Meth. 14:233-47. NAGATA, T.; BOITEUX, L.S.; IIZUKA, N. & DUSI, A.N. 1993. Identification of phenotypic variation of tospovirus isolates in Brazil based on serological analysis and differential host response. Fitopatol. Bras. 18:2-30. NATSUAKI, K.T.; NISHIMURA, Y.; IKEDA, M. & TOMARU, K. 1988. Use of gelatin particie agglutination test for detection of plant viruses. Ann. Phytopathol. Soc. Japan 54:548-51. NAVOT, N.; BER, R. & CZOSNEK, H. 1988. Rapid detection of tomato yellow leaf curl virus in squashes of plants and insect vectors. Phytopathology 78:562-8. OLIVEIRA, A.R. 1975. Considerações sobre anti-soros obtidos pela técnica de injeção de antígeno no linfonódulo. Summa Phytopathol. 1:61-4. OLIVEIRA, A.R.; ALVA, A.P.C. & FIGUEIREDO, M.B. 1976. Serologia aplicada ao estudo dos vírus de plantas. Summa Phytopathol. 2:69-96. OLIVEIRA, A.R.; COSTA, A.S.; GASPAR, J.O. & BERIAM, L.O.S. 1983. Controle e manutenção de uma soroteca para fitovírus. Summa Phytopathol. 9:6. (Res.). OLIVEIRA, A.R.; COSTA, A.S. & NAKAMURA, T. 1977. Redução no título de anti-soros conservados em congelador. Fitopatol. Bras. 2:93. (Res.). OLIVEIRA, A.R.; VEGA, J.; KUNIYUKI, H. BAPTISTA, C.R.; MULLER, G.W. & COSTA, A.S. 1988. Detecção de vírus serologicamente idêntico ao da tristeza dos citros em calos de videira Seibel 2 com enrolamento da folha através de MEIAD. Fitopatol. Bras. 13:133. (Res.). OLIVEIRA, M.L.; LIN, M.T. & KITAJIMA, E.W. 1981. Purificação e serologia do vírus do mosaico amarelo do salsão. Fitopatol. Bras. 6:47- 55. O’SULLIVAN, M.J. & MARKS, V. 1981. Methods for the preparation of enzyme antibody conjugates for use in enzyme immunoassay. Meth. Enzymol. 73:147-66. OUCHTERLONY, O. 1948. In vitro method for testing the toxin-producing capacity of diphteria bacteria. Acta Pathol. Microbiol. Scand. 25:186- 91. PAIVA, E.; PEIXOTO, M.J.V.V.D.; FERREIRA, A.S. & CASELA, C. 1990. Diferenciação imunológica de raças fisiológicas de Colletotrichum graminicola do sorgo. Fitopatol. Bras. 15:299-302. PAVAN, M.A. & CARVALHO, M.G. 1988. Comparação de roteiros de purificação do vírus do mosaico da melancia ('papaya rings pot virus-w'). Fitopatol. Bras. 13:224-7. PIO-RIBEIRO, G.; ASSIS FILHO, F.M.; DA PAZ, C.D. & PIRES, C.R.C. 1993. Ocorrência de 'sweet potato feathery mottle virus' em germoplasma de batata-doce no estado de Pernambuco. Fitopatol. Bras. 18:458-60. POZZER, L.; DUSI, A.N.; KITAJIMA, E.W. & LIMA, M.I. 1993. Caracterização de um isolado de 'sweet potato feathery mottle virus'. Fitopatol. Bras. 18:274. (Res.). RAJESHWARI, R.; REDDY, D.V.R. & IIZUKA, N. 1981. Improvement in the passivo hemagglutinatio technique for serological detection of plant viruses. Phytopathology 71:306-8. RAJU, B.C.; WELLS, J.M.; NYLAND, G.; BRLANSKY, R.H. & LOWE, S.K. 1982. Plum leaf scald: isolation, culture, and pathogenicity of the causal agent. Phytopathology 72:1460-6. RIBEIRO, S.G. & KITAJIMA, E.W. 1983. Conservação das películas sensibilizadas com anticorpo para microscopia eletrônica imuno- específica. Fitopatol. Bras. 8:627. (Res.). RIVERA, C. 1987. Métodos serológicos y citológicos de diagnóstico y detección de virus de plantas. Fitopatol. Bras. 12:18-2 1. ROMEIRO, R.S. & FUKUDA, C. 1983. Métodos simples para determinação de título de aglutinação e/ou precipitação do anti-soro ou do antígeno. Fitopatol. Bras. 8:93-5. SAKAKIBARA, R.; TOMINAGA, N.; SAKAI, A. & ISHIGURO, M. 1987. Electrophoretic separation of proteins on agarose gel-application for direct immunization with a gel piece containing an antigen. Anal. Biochem. 162:150-5. SALAZAR, L.F. 1979. Aplicación de la técnica serológica con conjugados enzimáticos (ELISA) para diagnosticar virus de la papa. Fitopatologia 14:1-9. SALAZAR, L.F. 1982. Manual de enfermedades virosas de la papa. Lima, Peru, Centro Internacional de la Papa. SEQUEIRA, J.C. 1992. Técnicas serológicas e bio-moleculares de diagnóstico de vírus e de viróides em plantas. Summa Phytopathol. 18:79-110. SILVA, D.M. 1957. Estudos sorológicos com dois vírus de plantas. Rev. Agric. 32:189-94. SILVA, D.M.; OLIVEIRA,A.R.; KITAJIMA, E.W.; CARVALHO, A.M.B. & COSTA, A.S. 1961. Purificação e estudo de algumas propriedades do vírus da necrose branca do fumo. Bragantia 20:777-85. SILVEIRA, J.R.P.; CASTRO, L.A.S. de; MARTINS, O.M. & SOUTO, M.E.O. 1992. Produção de anti-soros para diagnose de bactérias do gênero Erwinia causadoras de podridão mole. Fitopatol. Bras. 17:195. (Res.). SUGIMORI, M.H.; OLIVEIRA, A.R.; RODRIGUES NETO, J. & DIAS, M.R. 1982. Testes serológicos de dupla difusão em ágar utilizados na caracterização e diferenciação de raças fisiológicas de Xanthomonas campestris pv. malvacearum. Fitopatol. Bras. 7:567. (Res.). SUGIMORI, M.H.; RODRIGUES NETO, J. & OLIVEIRA, A.R. 1986. Novo meio de reação para testes serológicos de dupla difusão em ágar com antígenos de fitobactérias. Summa Phytopathol. 12:33. (Res.). SUTULA, C.L.; GILLEVF, J.M.; MORRISSEY, S.M. & RAMSDELL, D.C. 1986. Interpreting ELISA data and establishing the positive-negative threshold. Plant Dis. 70:722-6. TOLIN, S.A. 1977. Identification of legume viruses in the field by serology. Fitopatol. Bras. 2:1-78. VAN REGENMORTEL, M.H.V. 1978. Applications of plant virus serology. Ann. Rev. Phytopathol. 16:57-81. VAN SLOGTEREN, D.H.M. 1955. Serological analysis of some plant viruses with the gel-diffusion method. In: 11 Conf. Potato Virus Diseases. Wageningen, p.45-50. VASCONCELOS, M.F.R. & LIMA, J.A.A. 1981. Purificação e serologia de raças de ‘cowpea severe mosaic virus’ isoladas de 4 espécies de leguminosas. Fitopatol. Bras. 6:534. (Res.). VEGA, J.; GASPAR, J.O. & MULLER, G.W, 1982. Utilização da microscopia eletrônica imuno-específica na detecção do vírus da tristeza dos citros em São Paulo. Fitopatol. Bras. 7:548. (Res.). VEGA, J. & KUNIYUKI, H. 1986. Aperfeiçoamento da técnica MEIAD para detecção e comparação do vírus do mosaico do traviú. Summa Phytopathol. 12:14. (Res.). VEGA, J. & REZENDE, J.A.M. 1993. Relação serológica entre o vírus do amarelo letal do mamoeiro solo e o vírus do mosaico do pepino observada por MEIAD e ELISA. Fitopatol. Bras. 18:278. (Res.). ZREIN, M.; BURCKHARD, J. & REGENMORTEL, M.H. 1986. Use of the biotin-avidin system for detecting a broad range of serologically-related plant viruses by ELISA. J. Viral. Meth. 13:121-8.
Compartilhar