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Metodos Imunologicos Ultilizados na Diagnose de Doença de Plantas

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MÉTODOS IMUNOLÓGICOS UTILIZADOS NA 
DIAGNOSE DE DOENÇAS DE PLANTAS 
 
Julio Daniels 
EMBRAPA-CPACT, Caixa Postal 403, 96001-970 Pelotas, RS, Brasil 
 
 
RESUMO 
 
Os testes imunológicos constituem métodos práticos e precisos de 
detecção e de diagnose de grande número de patógenos de vegetais, incluindo 
bactérias, fungos e vírus. Esta revisão abrange os trabalhos realizados por 
fitopatologistas brasileiros na área de imunologia, com destaque para os testes 
de Microprecipitação, de Difusão Dupla em Ágar, de Aglutinação de Látex e 
de ELISA. 
 
 
SUMMARY 
 
IMMUNOLOGICAL TESTS FOR DIAGNOSIS OF PLANT DISEASES 
The immunological tests constitute practical and precise methods for 
detecting and diagnosing a large number of plant pathogens, including 
bacteria, fungi, and viruses. This review comprises the papers published by 
Brazilian plant pathologists in the field of immunology, with emphasis on the 
Microprecipitation, Agar Double Diffusion, Latex Agglutination, and ELISA 
tests. 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
As plantas são suscetíveis a grande número de doenças causadas 
por fatores abióticos, que incluem níveis prejudiciais de temperatura, de 
umidade, de luz, de nutrientes, de pH, de poluentes do ar e de pesticidas, e 
bióticos, que envolvem, entre outros agentes, bactérias, fungos, nematóides e 
vírus. Embora os sintomas nem sempre sejam aparentes, as plantas doentes 
são menos produtivas e, em casos extremos, podem ter sua produção 
completamente comprometida, causando grandes prejuízos aos agricultores. 
A diagnose de uma doença é o primeiro passo para a adoção de 
medidas de controle. Para algumas enfermidades, a causa pode ser 
determinada pelos sintomas; entretanto, em muitos casos, somente o exame 
dos tecidos vegetais afetados e/ou o uso de técnicas especiais podem levar ao 
diagnóstico correto. 
 
 
Entre os métodos de diagnose, destacam-se os testes de 
hibridização de ácidos nuclêicos, referidos em revisões recentes (Batista, 
1993; Miller & Martin, 1988; Sequeira, 1992), que possibilitam, inclusive, a 
detecção de viróides, mas exigem laboratórios bem-aparelhados, e os testes 
imunológicos, muito mais simples, usados principalmente para doenças 
causadas por bactérias, por fungos e por vírus. 
A utilização da imunologia na fitopatologia teve início com os 
trabalhos de Jensen (1918), que mostrou diferenças sorológicas entre raças de 
Agrobacterium tumefaciens (Smith & Town) Conn., e de Beale (1928), que 
constatou a produção de anticorpos específicos em coelhos injetados com 
suspensões contendo o vírus do mosaico do fumo (tobacco mosaic virus - 
TMV). No Brasil, entre os trabalhos pioneiros publicados nessa área, é citado 
o de Silva (1957), que realizou estudos sorológicos com dois fitovírus. Desde 
então, as dezenas de técnicas imunológicas desenvolvidas, juntamente com o 
aprimoramento das metodologias usadas na purificação de imunógenos e na 
produção de anticorpos, tornaram os testes mais específicos, sensíveis e 
práticos. 
A imunologia compreende métodos auxiliares na identificação de 
fitopatógenos que, além da detecção e/ou da diagnose pré-sintomática, 
permitem a melhoria das inspeções e das certificações de lavouras para 
produção de sementes, a quantificação de inóculos, a programação de 
tratamentos químicos e a determinação de espécies de raças de agentes 
patogênicos (Beriam, 1985; Lankow et al., 1984). Citam-se, também, a 
determinação do relacionamento taxionômico ou sorotípico de patógenos, a 
caracterização de epitopos e paratopos (determinação da estrutura antigênica 
de uma substância), a análise de produtos resultantes da tradução de ácidos 
nuclêicos "in vitro" e a análise "in vivo" de constituintes relacionados com a 
patogênese (Hampton et al., 1990). Deve-se acrescentar, ainda, a localização 
de antígenos e/ou patógenos, em secções histológicas de hospedeiros e de 
vetores, realizada através de imunomarcação “in situ” com anticorpos 
conjugados a ouro coloidal e de exame ao microscópio eletrônico (Benhamou 
et al., 1991; Kitajima, 1983). 
O histórico da sorologia aplicada às doenças de plantas no Brasil 
foi revisto por Oliveira et al. (1976). Os periódicos nacionais apresentam 
revisões sobre aplicações da sorologia (Alba, 1984), métodos utilizados 
(Rivera, 1987) e detecção sorológica de vírus em leguminosas (Lima, 1979; 
Lin, 1979; Tolin, 1977), de fungos fitopatogênicos (Figueiredo et al., 1977) e 
de fitovírus (Oliveira et al., 1976; Sequeira, 1992). A bibliografia 
internacional sobre esse tema é vasta e diversificada, citando-se, entre outros, 
os manuais de Ball (1974), de Hampton et al. (1990) e de Harlow & Lane 
(1988) sobre métodos sorológicos, as revisões de Clark (1981) e de Clark et 
al. (1986) sobre testes imunoenzimáticos e os trabalhos de Galfrè & Milstein 
 
(1981) e de Halk & De Boer (1985) sobre anticorpos monoclonais. 
Nesta revisão não se pretende cobrir todos os aspectos relacionados 
à imunologia, mas, dentro do possível, procurar-se-á reunir as principais 
informações em relação aos métodos sorológicos utilizados pelos 
fitopatologistas brasileiros, principalmente no que se refere à detecção e à 
diagnose de patógenos. 
 
 
TERMOS UTILIZADOS 
 
A maioria dos termos específicos utilizados com freqüência na 
imunologia pode ser encontrada no dicionário publicado por Herbert & 
Wilkinson (1977). A seguir, estão relacionados alguns vocábulos utilizados 
no texto, conforme definições de Hampton et al. (l990). 
Antígenos ou imunógenos (antígenos injetáveis) são substâncias, 
geralmente proteínas ou polissacarídeos, que induzem a uma resposta imune 
em um animal ou que se ligam especificamente aos anticorpos. 
Anti-soro é o soro de uma animal que contém anticorpos 
específicos a um determinado antígeno. 
Anticorpos são moléculas de imunoglobina produzidas pelos 
linfócitos B, em resposta a um estímulo antigênico. Cada molécula tem dois 
ou mais sítios de ligação com antígenos chamados paratopos. 
Epitopo é o sítio antigênico de uma molécula. Uma substância 
antigênica (imunógena) pode apresentar um ou mais epitopos. O menor 
peptídeo que demonstra reatividade antigênica e representa o epitopo possui 
cerca de cinco a sete aminoácidos. Um epitopo reconhece um paratopo. 
Anticorpos policlonais são obtidos do soro de um animal inoculado 
com um antígeno contendo diversos epitopos. Consistem em uma população 
de anticorpos que reagem com mais de um epitopo. 
Anticorpos monoclonais são obtidos de linfócitos B 
individualizados e imortalizados pela fusão com uma célula de mieloma 
(cancerigena). Ao linfócito é conferida a capacidade de produzir anticorpos e 
à célula de mieloma de multiplicar-se indefinidamente. Consistem em 
anticorpos que reagem com apenas um tipo de epitopo. Entre as vantagens do 
seu uso, são citadas a especificidade, a perpetuidade de produção e a 
padronização das reações sorológicas. Podem ser selecionados para reagirem 
com epitopos gerais (comuns a diversos patógenos) ou específicos. 
Existem cinco classes de moléculas de anticorpos ou 
imunoglobulinas (Ig), respectivamente, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, além de 
oito subclasses. A IgM é a primeira classe de anticorpos produzidos por um 
animal estimulado; seu pico da concentração ocorre cerca de dez dias após o 
estímulo e, então, cai. A IgG (Fig. 1) é a principal imunoglobulina utilizada 
 
 
nos testes sorológicos e seu pico de concentração ocorre aos quatorze dias do 
estímulo. Se o animal é reestimulado, a concentração de IgG, geralmente, será 
muito maior do que as de outras classes de anticorpos. Os anticorpos IgA, 
IgD e IgE ocorrem em baixíssimas concentraçõese, raramente, são usados 
como reagentes em diagnósticos. 
A interação entre um antígeno e um anticorpo envolve ligações de 
hidrogênio, pontes de sais, cargas eletrostáticas e forças hidrofóbicas, de van 
der Waal e de Coulomb. Essa interação é reversível e a sua maior ou menor 
taxa de associação (afinidade) pode ser afetada pela temperatura e pelo pH, 
entre outras condições. A habilidade de um anticorpo formar complexos 
imunes estáveis é conhecida por avidez. A IgM, com dez paratopos, tem 
maior avidez do que a IgG, com dois paratopos. 
 
 
PREPARAÇÃO DE ANTÍGENOS 
 
FITOVIROSES 
 
Os antígenos normalmente utilizados são constituídos por partículas de 
vírus inteiras ou por viriões, mas também têm sido usadas unidades 
constituintes de capa protéica viral (Dust & Carvalho, 1988; Sakakibara et al., 
1987) e inclusões induzidas por vírus (Hiebert et al., 1984). 
O processo de purificação de antígenos virais depende dos equipamentos 
e dos reagentes disponíveis. O primeiro passo para a purificação de viriões de 
plantas é uma pesquisa bibliográfica sobre os métodos já utilizados para vírus 
idênticos ou similares (do mesmo grupo). O ponto de partida desse estudo 
pode ser a excelente série sobre fitoviroses publicada na Inglaterra 
(CMI/AAB, 1970 - presente). A consulta deve se estender a livros textos 
(Mattews, 1981) e a manuais (Brakke, 1990). Alguns trabalhos específicos 
sobre purificação e sorologia de vírus de plantas podem ser encontrados nas 
seguintes referências de periódicos brasileiros: Aragão et al. (l993); De Ávila 
et al., (l980); De Ávila & Dusi (l988); Dusi & Carvalho (l988); Dusi & De 
Ávila (l988); Gama et al. (l987); Gama & De Ávila (l988); Kuhn et al. (1982); 
Lima et al. (1981); Lima & Amaral (l985); Lin (l979); Lin & Kitajima (l978); 
Marinho & Kitajima (l989); Matyis et al. (l975); Oliveira et al. (l981); Pavan 
& Carvalho (l988); Silva et al. (l961). 
 
 
 
Figura 1. Representação gráfica da molécula de imunoglobina G, de acordo 
com Darnell et al. (1986), com os quatro peptídeos (dois pesados e 
dois leves) ligados por pontes de enxofre. Fc = fragmento 
cristalizável; Fab = fragmento de ligação com o antígeno. 
FITOBACTÉRIAS 
 
Os antígenos bacterianos, conforme De Boer & Schaad (1990), 
podem ser extra ou intracelulares, sendo constituídos por proteínas, por 
polissacarídeos ou por lipídios. Os imunógenos podem consistir em células 
inteiras (não tratadas, tratadas por calor, fixadas com formol ou com 
glutaraldeído), de extratos (glicoproteínas, complexos protêicos da membrana) 
ou de outros componentes purificados (lipopolissacarídeos, ribossomos, 
enzimas de secreção, flagelos, pêlos). Entre as referências brasileiras, são 
citados Bach et al. (1982) e Maringoni & Kimati (1987). 
 
FUNGOS FITOPATOGÊNICOS 
 
Comparados aos vírus, e mesmo às bactérias, os fungos são 
patógenos complexos, o que dificulta o isolamento de imunógenos adequados 
para a produção de anticorpos específicos. Extratos das estruturas somáticas e 
de disseminação (conídios ou esporos) desses organismos, além de antígenos 
extracelulares (metabólitos encontrados no meio de cultura), têm sido usados 
mais freqüentemente para imunização. A escolha da fonte dos imunógenos, 
em geral, tem sido realizada de maneira empírica e subjetiva (Fegies, 1992). 
Devido à complexidade dos antígenos, os resultados são muito variáveis, 
permitindo, em alguns trabalhos, a discriminação de isolados (Hardham et al., 
1986) e de raças de patógenos (Morton & Dukes, 1966), enquanto que em 
outros não foi possível a discriminação, dos isolados (Centurion & Kiniati, 
1992). Alguns trabalhos determinaram a presença de antígenos comuns em 
fungos e em plantas (Alba et al., 1983; Alba & De Vay, 1984). 
 
OUTROS PATÓGENOS 
 
Além de sua aplicação aos patógenos mencionados, a sorologia tem 
sido utilizada para a detecção de espiroplasmas (Clark et al., 1978; Eden-
Green, 1982), de micoplasmas (Aives & Gaspar, 1985; Hsu et al., 1990), de 
nematóides (Davies & Lander, 1992; El-Sherif & Mai, 1968) e de riquétsias 
(Beretta et al., 1991; Castro et al., 1987; Leite Jr. & Leite, 1991; Raju et al., 
1982). 
 
 
 
 
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS 
 
ESCOLHA DO ANIMAL 
 
Fáceis de obter e de manejar, os coelhos são os animais preferidos 
para a produção de anticorpos policlonais, porque produzem volumes 
expressivos de soro com pequenas quantidades de imunógenos. Já os ratos e 
os camundongos são mais usados na produção de anticorpos monoclonais, 
enquanto a utilização de galinhas tem a vantagem de permitir o isolamento de 
anticorpos presentes em ovos (Bar-Joseph & Malkinson, 1980; Harakava & 
Moraes, 1993). 
 
IMUNIZAÇÃO 
 
As vias de imunização podem ser: intravenosa, intramuscular, 
subcutânea, intraperitonial, intradermal, intraarticular e intranodular, podendo-
se considerar esta como uma série, em ordem crescente, de efeitos 
estimuladores à resposta imunológica. A quantidade de imunógenos depende 
de certos fatores, como pureza, antigenicidade e método de imunização. Um 
resumo das metodologias pode ser encontrado em Ball et al. (1990). Em 
geral, são usadas três ou quatro injeções intramusculares, seguidas ou não de 
uma intravenosa, a intervalos semanais. Nas injeções intramusculares é 
comum emulsificar o imunógeno com adjuvantes (Freund et al., 1948). De 
acordo com Oliveira (1975), a técnica mais eficiente de imunização de 
coelhos consiste em injetar os imunógenos nos linfonódulos. 
 
ARMAZENAMENTO DO ANTI-SORO 
 
Os soros conservados em congelador perdem, gradativamente, a 
reatividade (Oliveira et al., 1977). Para melhorar a conservação, é 
recomendada a liofilização ou a adição de azida de sódio (0,025 %) e de 
glicerol (50 %), armazenando-se a suspensão em pequenas alíquotas, a cerca 
de -20 ºC. 
 
AQUISIÇÃO DE ANTI-SOROS 
 
Embora seja relativamente simples a produção de determinados 
anticorpos, muitas vezes não vale a pena fazê-lo, uma vez que podem ser 
facilmente adquiridos de instituições nacionais ou estrangeiras. A 
Universidade de Brasília (Lin & Kitajima, 1978), o Instituto Agronômico de 
Campinas (Oliveira et al., 1983) e a Universidade Federal do Ceará (Lima & 
 
Santos, 1988) dispõem de sorotecas, com algumas dezenas de anti-soros para 
patógenos de vegetais. A Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária 
(EMBRAPA) produz anti-soros para patógenos de plantas em algumas de suas 
unidades, entre as quais o Centro Nacional de Pesquisas em Hortaliças 
(CNPH) e o Centro de Pesquisas Agropecuárias de Clima Temperado 
(CPACT), que dispõem de anti-soros para bactérias e para vírus de vegetais e 
prestam serviços na diagnose sorológica de doenças de plantas. No exterior, a 
American Type Culture Collection (l2301 Parklawn Drive, Rockville, MD 
20852, Estados Unidos) fornece centenas de itens, incluindo grande número 
de anti-soros para fitoviroses (McDaniel & Emerson, 1990), e o Centro 
Internacional de la Papa (Casilla Postal 4393, Lima, Peru) que fornece kits 
para detecção de vírus de batata e de batata-doce. Algumas empresas 
fornecem anti-soros e kits de detecção e, em alguns casos, prestam serviços de 
diagnose, citando-se, entre outras, a Agdia Inc. (30380 County Road 6, 
Elkhart/IN 46514, Estados Unidos), a Bioreba AG (Gempenstrasse 27, 
Postfach 98, CH-4008 Basel, Suíça), a Boehringer Mannheim France S. A. (2, 
Avenue du Vercors, 38420 Meylan, França), a Igen, Inc. (l530 E. Jefferson 
Street, Rockville/MD 20852, Estados Unidos), a Ingetinasa (Hnos. Garcia 
Noblejas, 41 - 2ª planta, 28037 Madrid, Espanha) e a Loewe Biochemica 
GmbH (Nordring 38, Postfach 9, D-8156 Otterfing,Alemanha). 
 
 
PREPARAÇÃO DA IMUNOGLOBULINA 
 
ABSORÇÃO CRUZADA 
 
É feita para remover os anticorpos não específicos para o patógeno, 
que ocorrem freqüentemente e interferem nas reações sorológicas. Nos testes 
de fitoviroses, esses anticorpos reagem com alguns constituintes do 
hospedeiro, destacando-se, entre os métodos de absorção cruzada, a utilização 
do extrato em pó de hospedeiro sadio (Ball et al., 1990). Nos testes de 
bacterioses, uma vez que a maioria das células bacterianas utilizadas como 
imunógenos é cultivada em meios artificiais, isso não ocorre. Mesmo assim, a 
absorção cruzada tem sido utilizada, em alguns casos, para remover antígenos 
comuns a outras espécies patogênicas ou saprófitas (Crowley & De Boer, 
1982). 
 
 
 
PURIFICAÇÃO E CONJUGAÇÃO COM ENZIMAS 
 
As moléculas de IgG podem ser parcialmente purificadas pela 
precipitação seletiva com sulfato de amônio, seguida ou não de cromatografia 
em coluna de celulose, conforme protocolos de Ball et al. (1990). 
A fosfatase alcalina e a peroxidase, enzimas mais usadas no teste de 
ELISA, a partir dos trabalhos pioneiros de Avrameas (1969), podem ser 
conjugadas à imunoglobulina através de diversos métodos (Mackenzie, 1990; 
O'Sullivan & Marks, 1981). De acordo com Mackenzie (1990), o método do 
glutaraldeído, simplificado, geralmente dá bons resultados com a fosfatase 
alcalina, sendo a oxidação do periodato o melhor para a peroxidase. 
 
 
TESTES SOROLÓGlCOS 
 
Entre os testes sorológicos mais usados, no Brasil, para diagnose de 
doenças das plantas, destacam-se: Microprecipitação, Difusão Dupla em Ágar, 
Aglutinação de Látex e ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). 
 
MICROPRECIPITAÇÃO 
 
Esse teste, geralmente, é feito em placas de Petri plásticas, 
quadriculadas com lápis de cera, formando quadrados com aproximadamente 
um centímetro de lado. Também podem ser utilizadas placas de vidro, desde 
que tratadas com Formvar a 0,1 % em clorofórmio, para tornar a superfície 
hidrofóbica. Uma variação do método foi publicada por Romeiro & Fukuda 
(1983). Este é um teste mais simples, pois consiste em misturar e incubar, por 
algum tempo, gotas (20 a 40 l) de suspensões de antígenos e de anticorpos, 
geralmente feitas em água salina (NaCl 0,85 %). Para evitar a evaporação, 
cobrem-se as gotas com parafina líquida ou com óleo mineral, ou coloca-se a 
placa em câmara úmida. Para otimização do teste, as diluições dos reagentes 
são testadas previamente, e os resultados avaliados com o auxílio de uma lupa 
(10 a 50 aumentos) munida de campo escuro. A formação de precipitados 
indica a combinação anticorpo/antígeno e, portanto, a reação (Fig. 2). O teste 
não funciona com vírus em baixas concentrações no hospedeiro, requerendo, 
na solução a testar, pelo menos, 0,5 g de viriões/ml (Martin, 1985). O 
protocolo com detalhes para a realização do teste pode ser encontrado em Ball 
(1974). Pela baixa sensibilidade e pela necessidade de grandes quantidades de 
anti-soros, o teste vem sendo substituído por outros, especialmente pelo 
ELISA, como no caso 
 
 
Figura 2. Representação gráfica do Teste de Microprecipitação, conforme 
Fribourg & Nakashima (1981). 
das diagnoses de rotina, em programas de produção de batata-semente, em que 
era muito utilizado. Mais recentemente, seu uso tem sido limitado à 
determinação de títulos de anti-soros. 
 
DIFUSÃO DUPLA EM ÁGAR 
 
Nesse teste, desenvolvido por Ouchterlony (1948) e introduzido na 
diagnose de fitoviroses por Van Slogteren (l955), as suspensões com 
antígenos e com anticorpos são colocadas separadamente em cavidades 
abertas na camada de ágar contida em placa de Petri. Os reagentes se 
difundem pelo ágar e, quando se encontram, formam linhas de precipitação 
facilmente visíveis. O teste é simples, mas pouco sensível, exigindo o uso de 
anti-soros concentrados e, em casos de baixas concentrações no hospedeiro, 
de antígenos semipurificados. A principal vantagem é a determinação das 
interrelações entre antígenos e anticorpos, pelas linhas de precipitação que se 
desenvolvem. A formação de uma linha contínua entre as cavidades ocupadas 
pelos antigenos indica sua identidade serológica, enquanto a presença de 
esporão (fragmento da linha que se destaca em relação a uma das cavidades) 
revela existência de relação, mas não de identidade (Fig. 3). São utilizados 
géis com 0,5 a 1,0 % de agar, sendo que, quanto maior a concentração, 
menores serão os poros e mais demorada a difusão dos reagentes. Os viriões 
alongados, com mais de 500 mm de comprimento, difundem-se com 
dificuldade no gel, devendo ser dissociados com o detergente dodecil sulfato 
de sódio ou por outros métodos (Van Regenmortel, 1978). A adição de 
ciclohexamida ao ágar melhora a performance do teste para a detecção de 
fitobactérias (Sugimori et al., 1986). No Brasil, a primeira utilização do teste 
de difusão dupla em ágar foi realizada por Silva et al. (1961), em trabalhos 
com o vírus da necrose branca do fumo. Excluindo as diagnoses de rotina, é o 
teste mais utilizado por fitopatologistas brasileiros na detecção de vírus 
(Barbosa & Paguio, 1982; De Ávila et al., 1980; Lima et al., 1981; Lin et al., 
1981), em estudos epidemiológicos (Batista et al., 1980), em levantamentos de 
incidência (Lima et al., 1991), nas comparações de isolados de fitovírus (Alba 
& Oliveira, 1976; Gaspar et al., 1985; Lin et al., 1980, Lin & Hill, 1982; 
Lovisolo et al., 1986; Nagata et al., 1993; Vasconcelos & Lima, 1981), de 
fungos fitopatogênicos (Cardoso & Oliveira, 1977; Geraldi & Kimati, 1982; 
Ghini & Kimati, 1985; Paiva et al., 1990), de fitobactérias (Maringoni & 
Kimati, 1987; Sugimori et al., 1982), na detecção de bactérias em sementes 
(Donato et al., 1986) e na comparação de antígenos comuns entre plantas e 
fungos (Alba et al., 1983; Alba & De Vay, 1984). 
 
 
Figura 3. Representação gráfica do Teste de Difusão Dupla em Ágar, 
conforme Rivera (1987), sendo os paratopos das imunoglobulinas 
representados por A, B, C e D, e os epitopos dos antígenos, por a, 
b, c e d. Tipos de reações: 1. Identidade entre os epitopos; 2. 
Parcial identidade entre os epítopos; 3. Não identidade. 
AGLUTINAÇÃO DE LÁTEX 
 
É uma modificação do teste de Microprecipitação, visando a 
ampliar o precipitado decorrente da combinação anticorpo/antígeno. O látex 
comercial (Difco, Sigma, etc.) usado no teste é adquirido como uma suspensão 
de microesferas de poliestireno com aproximadamente 800 nm de diâmetro. 
A sensibilização consiste em misturar as esferas de látex com anticorpos que 
ficam adsorvidos por elas (Fribourg, 1981; Fig. 4A). Quando a suspensão de 
látex sensibilizado é misturada com o extrato da planta contendo os antígenos 
específicos, ocorrem os agregados (Fig. 4B). Segundo Salazar (1982), o 
método apresenta vantagens sobre a Microprecipitação, pois não requer 
centrifugação do extrato da planta, a reação é mais rápida, os resultados são 
visíveis a olho nu e usa menos anti-soro, sendo de cem a mil vezes mais 
sensível do que a Microprecipitação. A principal desvantagem é a 
dependência do látex importado. Para superar essa dificuldade, têm sido 
testados substitutos, como células do sangue (Rajeshwari et al., 1981) e 
gelatina (Natsuaki et al., 1988). O teste tem sido utilizado no Brasil para 
detecção de vírus (Daniels et al., 1984; Gama et al., 1987; Gama & De Ávila, 
1988) e de bactérias (Castro et al., 1991; Castro et al., 1992; Silveira et al., 
1992). 
 
ELISA 
 
Nos testes de ELISA, a combinação anticorpo/antígeno é 
determinada pela reação de uma enzima (hidrólise), geralmente fosfatase 
alcalinaou peroxidase, com o seu substrato. Portanto, o ELISA é um teste 
imunoenzimático, no qual as atividades imunológicas e enzimáticas das 
moléculas são manipuladas, visando a aumentar a especificidade e a 
sensibilidade. Pode ser feito em diversos suportes sólidos, com diferentes 
tipos de reagentes, o que possibilita muitas modificações nos procedimentos 
originalmente utilizados. Assim, são encontradas dezenas de formas ou de 
tipos de ELISA na literatura (Barbara & Clark, 1982; Kaniewski & Thomas, 
1988; Koenig & Paul, 1982; Mowat & Dawson, 1987; Zrein et al., 1986), 
além das descritas no texto. Os tipos de ELISA dividem-se em dois grupos: 
direto, no qual o anticorpo da detecção é usado, também, na conjugação com a 
enzima e indireto, no qual o conjugado não é especifico para o antígeno a ser 
detectado, mas sim para o anticorpo ou reagente usado na detecção. As 
vantagens do teste incluem grande sensibilidade, maior do que a Aglutinação 
de Látex, e adequação aos testes de rotina. A principal desvantagem está no 
grande número de passos necessários para sua realização, o que inclui a 
lavagem sistemática das placas de microtitulação entre as etapas. A 
versatilidade do ELISA permite que, em trabalhos de indexação de rotina, 
 
 
Figura 4. Representação gráfica do Teste de Aglutinação de Látex, conforme 
Fribourg & Nakashima (1981). A. Sensibilização das esferas de 
látex com imunoglobulinas; B. Reação serológica do látex 
sensibilizado com os antígenos homólobos. 
sejam detectados antígenos em sementes (Jafarpour et al., 1979), e que, não 
interessando a identidade dos patógenos, seja usado para detecção de diversos 
antígenos simultaneamente (Dusi; 1969; Salazar, 1979). Um dos fatores que 
encarecem o teste de ELISA é a placa de microtitulação. Porém, tem sido 
demonstrada a possibilidade de esta ser reutilizada (Bar-Joseph et al., 1979; 
Meissner Filho, 1989). A avaliação do teste pode ser visual, ou com o auxílio 
de um colorímetro, que mede a densidade ótica do produto da reação. A 
interpretação dos dados pode ser feita de acordo com Sutula et al. (1986). 
 
DAS (DOUBLE ANTIBODY SANDWICH) - ELISA 
 
É um método direto, popularizado por Clark & Adams (1977) para 
diagnose de fitoviroses. No Brasil, foi utilizado pela primeira vez para a 
detecção da bactéria Xanthomonas campestris pv. citri (Hasse) Dye (Bach et 
al., 1981). Envolve quatro etapas (Fig. 5): na primeira, os anticorpos são 
adsorvidos; na segunda, os antígenos correspondentes, se presentes na 
amostra, aderem aos anticorpos; na terceira, é adicionado o conjugado, que, na 
presença dos antígenos, formará o sanduíche; e, na quarta, é colocado o 
substrato da enzima, sendo produzida a reação calorimétrica característica. 
No Brasil, o teste tem sido utilizado para a detecção de diversos vírus de 
plantas (Araújo et al., 1989; Daniels et al., 1984; De Ávila, 1986; De Ávila et 
al., 1988; Dusi et al., 1988; Marinho et al., 1993), da bactéria X. c. pv. citri 
(Bach et al., 1982) e da riquétsia causadora da escaldadura das folhas da 
ameixeira (Castro et al., 1987). 
 
PAS (PROTEIN A SANDWICH) - ELISA 
 
É um método indireto, utilizado para diagnose de fitoviroses, pela 
primeira vez, por Edwards & Cooper (l985). Baseia-se na propriedade da 
proteína A, extraída de Streptococcus aureus, de ligar-se à parte cristalizável 
(Fc) da molécula IgG de diversas espécies de animais (Harlow & Lane, 1988). 
Envolve seis etapas (Fig. 5): Inicialmente, é colocada a proteína A; a seguir, o 
anti-soro bruto, convenientemente diluído; após, são adicionadas amostras a 
serem testadas; seguindo-se a reaplicação do anti-soro da segunda etapa; na 
quinta etapa, é colocado o conjugado de enzima com proteína A; C, 
finalmente, o substrato da enzima. Embora com maior número de etapas, o 
método tem a vantagem de utilizar anti-soros brutos e um só tipo de 
conjugado. Tem sido empregado em testes de anti-soros, em diagnoses de 
rotina e na caracterização de isolados de vírus (Daniels & Campbell, 1992; 
Daniels & Castro, 1991; Hughes & Thomas, 1988). 
 
 
 
Figura 5. Representação gráfica de testes de ELISA: DAS = double antibody 
sandwich; PAS = protein A sandwich; TAS = triple antibody 
sandwich. 
TAS (TRIPLE ANTIBODY SANDWICH) - ELISA 
 
Com o aumento da disponibilidade de anticorpos monoclonais, esse 
teste é cada vez mais utilizado. Também é um método indireto e envolve 
cinco etapas (Ellis & Wieczorek, 1992; Fig. 5), que podem ser reduzidas a 
quatro, no caso de mistura prévia dos reagentes dos passos três e quatro (J. 
Daniels, não publicado). Primeiramente, a placa é recoberta com anticorpos 
policlonais produzidos em coelhos; a seguir, são colocadas as amostras para 
testar; na terceira etapa, é colocado o segundo anticorpo (um monoclonal 
produzido em ratos); após, é adicionado o conjugado de enzima com o 
terceiro anticorpo (IgGs de outra espécie animal, que reagem com lgGs de 
ratos); finalmente, é adicionado o substrato da enzima. No Brasil, o teste tem 
sido utilizado para a detecção do vírus do nanismo da ameixeira (prune dwarf 
virus - PDV) e do vírus da mancha anelar necrótica de Prunus (prune necrotic 
ringspot virus - PNRSV) em fruteiras de clima temperado (J. Daniels, não 
publicado). 
 
DOT-ELISA 
 
O termo 'dot' não e um acrônimo de palavras inglesas, como os 
usados nos outros tipos de ELISA já descritos. É um vocábulo que se traduz 
por 'pequena mancha', 'pingo', 'ponto’ etc. O que o distingue do ELISA 
tradicional é o suporte sólido utilizado. Em lugar da placa de microtitulação, 
é usada a membrana de nitrocelulose ou de nylon. Outra modificação 
importante ocorre no desenvolvimento da reação, em que se usam diferentes 
sistemas de substrato/enzima. Detalhes desse teste podem ser encontrados em 
Hammond & Jordan (1990) e em Lazarovits (l990). Entre outras vantagens, 
possibilita a aplicação das amostras (tecido de plantas e vetores) diretamente 
nas membranas (Navot et al., 1988). Só recentemente vem sendo utilizado por 
pesquisadores brasileiros (Marinho & Dusi, 1991; Pio-Ribeiro et al., 1993; 
Pozzer et al., 1993). 
 
OUTROS TESTES 
 
A microscopia eletrônica imunoespecífica (immuno specific 
electron microscopy - ISEM), conforme Derrick (1973), também chamada de 
microscopia eletrônica de imunoadsorção - MEIAD, é um teste muito 
sensível. Tem sido utilizado em dois laboratórios brasileiros que dispõem de 
microscópio eletrônico, o do Instituto Agronômico de Campinas e o da 
Universidade de Brasília (Gama & De Ávila, 1988; Oliveira et al., 1988; Vega 
et al., 1982; Vega &, Rezende, 1993), que têm realizado, inclusive, 
aperfeiçoamentos na técnica (Ribeiro & Kitajima, 1983; Vega & Kuniyuki, 
1986). 
 
 
A técnica de difusão simples em ágar tem sido utilizada para 
identificação de viroses em caupi (Lima & Purcifull, 1979), em batata (Araújo 
& Carvalho, 1984) e em feijão (Dusi et al., 1988). 
São citados, ainda, a imunofluorescência, em que os anticorpos são 
marcados com fluorocromos, por exemplo, o isotiocianato de fluoresceína 
(Gingery, 1990), e a reação é observada com o auxílio de um microscópio de 
fluorescência, e o rádio imunoensaio, que utiliza como marcador um isótopo 
radioativo, por exemplo, o Iôdo 125, sendo a reação medida com um contador 
de cintilações, ou pela observação através da impressão em filme fotográfico 
(Ghabrial & Shepherd, 1980). 
 
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