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ver italicos PERSPECTIVAS DE PLANTAS TRANSGENICAS NO CONTROLE DE FITOVIROSES Renato de Oliveira Resende Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Brasília, 70919-970 Brasília, DF, Brasil RESUMO Com o advento da engenharia genética, várias técnicas moleculares têm sido desenvolvidas no sentido de auxiliar a pesquisa no controle de doenças fitopatogênicas. A estratégia baseada na produção de plantas transgênicas representa uma destas técnicas, sendo amplamente explorada na busca de resistência a fungos, a bactérias e principalmente a viroses. Tal estratégia visa transferir e expressar genes intactos ou parte do genoma destes patógenos nos tecidos vegetais, conferindo resistência à infecção. Devido a sua rapidez e versatilidade, comparado ao melhoramento genético convencional, o uso de plantas transgênicas mostra-se promissor no controle fitossanitário, principalmente do ponto de vista comercial. Devido ao seu genoma menos complexo, as fitoviroses são, no momento, os organismos mais explorados com relação à aplicação desta nova tecnologia. Várias estratégias de proteção têm sido utilizadas com base na expressão transgênica do gene da capa protéica, na polimerase viral e em outras proteínas não-estruturais, como as de transporte e as de transmissão. Vírus satélites e RNAs defectivos interferentes também têm sido estudados. Sendo uma técnica recente, o uso de plantas transgênicas no controle de fitopatógenos ainda enfrenta problemas, como a expressão e a regulação dos transgenes, assim como sua estabilidade genética em condições de campo. Esta revisão apresenta e discute os principais exemplos de resistência já alcançados, bem como os problemas e as perspectivas desta nova tecnologia. SUMMARY PERSPECTIVES OF TRANSGENIC PLANTS TO CONTROL PLANT VIRUSES Several molecular techniques have been developed in an attempt to control plant diseases. Transgenic plants represent one of these techniques. It has been extensively studied in the past few years, in order to obtain plant resistance against fungus, bacteria, and mainly plant virus infection. This technique consists in transferring and expressing a target-specific gene or related sequences derived from these pathogens into the plant tissue conferring resistance to infection. Compared to the conventional breeding schemes the transgenic plant technique has several advantages and it has been an extremely attractive to commercial goal. Due to the less complex genomes plant viruses are the best explored organisms to obtain transgenic resistance. Several strategies to provide protection have been used, based on the expression of viral coat protein gene, polymerase genes and other nonstructural genes which encode transport and transmission related proteins. Virus satellites and defective interfering RNAs have also been used. Concerning the application of transgenic plants some questions still need to be answered, such as the expression and regulation of the transgenes and the genetic stability of the resistance under field conditions. This review discusses the main examples of pathogen resistance obtained by the transgenic plant strategy and the problems and perspectives related to the application of this new technology. INTRODUÇÃO Devido aos grandes prejuízos causados por patógenos fitopatogênicos em praticamente todas as plantas cultivadas, muito se tem feito no sentido de se desenvolver métodos de controle para doenças de plantas, buscando sempre alternativas rápidas, eficientes e de menor custo. Recentemente, a estratégia baseada no uso de plantas transgênicas para obtenção de resistência a fungos, a bactérias e principalmente a viroses fitopatogênicas tem sido amplamente estudada. Devido à sua rapidez e versatilidade, esta técnica vem mostrando ser promissora no controle fitossanitário. Se comparada ao melhoramento genético convencional, a estratégia de plantas transgênicas mostra-se vantajosa, devido à possibilidade de se identificar, isolar, transferir (em um único passo) e expressar um gene de resistência a ilimitado número de variedades comerciais. Esta transferência de genes independe de compatibilidade sexual, não compromete caracteres agronômicos desejáveis, e, ainda, evita a necessidade de grande número de retrocruzamentos. Deste modo, o uso de plantas transgênicas apresenta-se como uma alternativa extremamente atrativa do ponto de vista comercial e, além disso, promissora para aquelas espécies de plantas que possuem poucas ou nenhuma fonte natural de resistência a infecções causadas por organismos fitopatogênicos O processo mais utilizado nesta transferência genética baseia-se no uso do sistema conhecido como “Sistema da Agrobacterium tumefaciens - Ti plasmídeo”, pois tal bactéria possui a habilidade de integrar parte de seu genoma (T-DNA) no material genético da planta hospedeira. Recentes progressos na adaptação do sistema Agrobacterium tumefasciens - Ti plasmídeo para introduzir segmentos de DNA em células vegetais, com a subsequente obtenção de plantas transformadas (Rogers et al., 1988; Zambryski, 1988), dependeram dos avanços alcançados na elucidação da biologia molecular da doença conhecida como “Crown Gall” (produzida pela Agrobactéria). Esses avanços também dependeram do desenvolvimento de genes quiméricos, que funcionam como marcadores seletivos, da construção de vetores intermediários adequados para a introdução de genes no genoma da Agrobactéria e dos avanços da técnica de cultura de tecidos e de transformação celular, as quais propiciaram a rápida regeneração das plantas transformadas. Devido ao seu genoma menos complexo, as fitoviroses são, no momento, os organismos mais explorados com relação à aplicação desta nova técnica, e, portanto, constituir-se-ão o principal tópico desta revisão. Pretende-se apresentar e discutir os principais exemplos de resistência já alcançados, bem como os problemas enfrentados pelos pesquisadores na interpretação dos resultados. CONSTRUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS As plantas transgênicas são produzidas através da introdução de genes desejáveis em células isoladas (protoplastos) ou em tecidos intactos (Horsch et al., 1985), usando estirpes modificadas de A. tumefasciens. Nestas estirpes os genes causadores de tumor foram especificamente deletados e substituídos por genes marcadores apropriados (geralmente antibióticos como ampicilina, kanamicina e rifanpicilinas). Estas estirpes modificadas de A. tumefasciens retêm parte da seqüência dos chamados “vir-genes”, que são necessários à transferência do T-DNA para células vegetais (Rogers et al., 1988). As células transformadas são, então, selecionadas (através do uso de antibióticos) e regeneradas, originando plantas completas, utilizando-se, para isto, de técnicas especiais de cultura de tecidos. A produção de plantas transgênicas, empregando-se o sistema da Agrobacterium tumefasciens - Ti plasmídeo, pode ser dividida em cinco fases principais: (l) Construção dos vetores de expressão contendo os genes ou as seqüências gênicas de interesse; (2) Introdução de genes desejáveis em estirpes modificadas de A. tumefasciens; (3) Co-cultivo da Agrobactéria modificada com células ou com tecidos vegetais; (4) Seleção e regeneração dos transformantes; e (5) Análise e verificação da expressão gênica nas plantas transformadas. Os vetores de expressão são plasmídeos especialmente construídos que contêm o gene de interesse que é clonado dentro de uma região específica no plasmídeo, o qual possui vários sítiosenzimáticos de restrição. Esta região é formada por um promotor e por uma seqüência terminadora de transcrição. Geralmente, utiliza-se a região promotora 35S do “Cauliflower mosaic virus”, de aproximadamente 410 bases, incluindo as seqüências chamadas “CAAT e TATA box” (Odell et al., 1985). Esta região é capaz de prover um eficiente sistema promotor de transcrição em plantas transgênicas. A seqüência de poliadenilação (terminação de transcrição) é derivada do terminal 3' do gene “nopalin synthase” (NOS “terminator”) que contém aproximadamente 265 bases. Muitos vetores de expressão incluem ainda um ativador de tradução (normalmente se usa a seqüência do tobacco mosaic virus-TMV, denominada “Omega Leader”), visando aumentar significativamente a expressão da proteína codificada pelo gene que se deseja introduzir no genoma vegetal (Gallie et al., 1987). Esta construção (Promotor de transcrição - Ativador de tradução - Gene de interesse - terminador de transcrição) denominada “Gene Cassette” (Fig. 1) é, então, transferida para um novo plasmídeo, denominado vetor binário. Devido ao tamanho do plasmídeo Ti da A. tumefaciens (200 Kb), não é possível empregar os métodos normais de clonagem. Deste modo, utiliza alguns vetores intermediários de integração (que possuem replicação autônoma) para se transferir os genes diretamente de células de Escherichia coli para Agrobacterium tumefaciens. O vetor binário (pBin) é um destes vetores intermediários, freqüentemente utilizado para a integração de segmentos de DNA no genoma vegetal. O vetor tem aproximadamente 10 kilobases de comprimento e é eficientemente mobilizado pelo plasmídeo intermediário de conjugação pRK2O13 (que contém um gene de resistência à kanamicina e inclui os genes de transferência pRK2, os quais são clonados dentro do Col E l replicon (Ditta et al., 1980), dentro da A. tumefaciens (Bevan, 1984). Este plasmídeo binário (pBin) utiliza a capacidade de ação em “trans” da região vir presente no Ti- plasmídeo da Agrobactéria para transferir o fragmento de DNA para o genoma nuclear de plantas. Este plasmídeo possui ainda o gene “neomycin phosphorotransferase (NPT) tipo II e tipo III que conferem resistência à kanamicina em plantas e em bactérias transformadas. Contém também a região promotora lac Z (na qual vários sítios de enzimas de restrição estão localizados) facilitando a seleção dos plasmídeos recombinantes. Realiza-se, então, a chamada “Triparental Mating”, onde três estirpes de bactérias são misturadas e incubadas (Fig. 1). a) Estirpe de E. coli, contendo o vetor binário recombinante (pBin); b) Estirpe de E. coli, contendo o vetor intermediário (belper plasmid) de conjugação (pRK2O13); c) Bactéria receptora Agrobacterium tumefaciens. Durante o processo de incubação, o vetor binário (pBin) contendo o gene de interesse é mobilizado e transferido para a Agrobactéria, com a ajuda do plasmídeo (“helper”) de conjugação (pRK2O13) (Fig. 1). O próximo passo é cultivar a Agrobactéria transformada juntamente com os tecidos vegetais (processo denominado de cocultivo), ocorrendo, então, a introdução do gene desejável no genoma vegetal. Os explantes positivos (transgênicos, selecionados com utilização de antibióticos adequados) são regenerados e as plantas transformadas levadas à casa de vegetação para se desenvolverem. Estas plantas são analisadas para a verificação da expressão do gene introduzido no genoma da planta. Dependendo dos objetivos almejados com a estratégia do uso de plantas transgênicas (ex.: resistência a patógenos fitopatogênicos), as plantas transformadas podem ser testadas, inoculando-se o patógeno contra o qual se quer obter resistência. As Figuras l e 2 procuram exemplificar os passos a serem seguidos para a produção de plantas transgênicas, visando a obtenção de resistência a fitoviroses. USO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS NO CONTROLE DE FUNGOS E DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS Recentemente, plantas transgênicas de fumo expressando transgenes que codificavam proteínas de ação antimicrobiana mostraram uma crescente eficiência na proteção contra a infecção causada por vários fitopatógenos, principalmente pelos fungos. Entre estas proteínas, destacam-se as endoquitinases (Broglie et al., 1991; Jach et al., 1992), as quais limitaram o crescimento de fungos através da degradação de um dos principais componentes da parede celular destes fungos; proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) (Longemann et al., 1992) que têm ação de inibição da síntese de proteínas nos ribossomos de fungos; proteínas do tipo “thaumatin” (proteínas relacionadas à doença do grupo 5), as quais demonstraram ter efeito antifúngico através de interferência no mecanismo de permeabilização da membrana (Vigers et al., 1992). Outros trabalhos também demonstraram a ação antifúngica e antibacteriana de proteínas do grupo das tioninas (Carmona et al., 1993), que constituem polipeptídeos ricos em cisteínas, sendo tóxicos a estes organismos fitopatogênicos, e, ainda, a PR-1 a proteína encontrada em plantas de fumo Figura 1. Representação esquemática da recombinação “Triparental Mating” entre o vetor binário (pBin) contendo o gene desejável, o vetor intermediário de conjugação (pRK2013) e a A. tumefasciens. O gene do patógeno foi clonado entre o promotor 25S (CaMV 25S promoter), ativador de transcrição (TMV) 5’ “untranslated leader”), e o terminador NOS (NOS “terminator”). Esta construção é comumente designada “Gene Cassette”. Durante o processo de incubação o vetor binário (pBin) contendo o gene de interesse é mobilizado e transferido para a Agrobactéria com a ajuda do plasmídeo (“helper”) de conjugação (pRK2013). A Agrobactéria transformada é incubada juntamente com tecidos vegetais (processo denominado de cocultivo), ocorrendo, então, a introdução de gene desejável no genoma vegetal. Figura 2. Representação esquemática das diversas etapas de produção e de avaliação de plantas transgênicas expressando um gene viral visando a obtenção de resistência a estes fitopatógenos. Cada etapa específica apresenta o objetivo a ser alcançado, indicando os principais componentes envolvidos em cada passo desta estratégia. com função desconhecida (Alexander et al., 1993). Uma nova estratégia de sucesso no uso de plantas transgênicas no controle parcial de infecções fúngicas baseia-se na produção transgênica de novas fitoalexinas, através da transferência interespecífica de genes biossintéticos (Hain et al., 1993). Tais genes foram clonados de maneira a responder com a acumulação de fitoalexinas nos tecidos vegetais, antes e depois da entrada do patógeno. USO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS NO CONTROLE DE FITOVIROSES O advento da criação de plantas resistentes a infecções viróticas, através da engenharia genética, nasceu das observações de que o uso de formas não-virulentas, assintomáticas e atenuadas de estirpes de vírus protegem as plantas contra a infecção de estirpes severas das viroses relacionadas. Apesar de intensamente estudados, os mecanismos moleculares desta “proteção cruzada” ainda não são entendidos e, em muitos casos, são controvertidos. Em alguns casos, pensava-se que a proteína da capa protéica do vírus atenuado era responsável por esta proteção, prevenindo-se a decapsidação ou a reencapsidação do genoma da estirpe de vírus mais severa. Entretanto, viróides (240 a 380 nucleotídeos) que não possuem capa protéica e mutantes de viroses, os quais são deficientes na produção da proteína do capsídeo, também exibem o fenômeno de proteção cruzada contra estirpes severas do mesmo vírus. Estas observaçõesestimularam o aparecimento de teorias baseadas em interacões entre RNA “sense” e “antisense” ou entre as maquinarias replicativas dos vírus competidores (Palukaits & Zaitlin, 1984). O desenvolvimento da cultura in vitro de células e de tecidos vegetais (Horsh et al., 1985) juntamente com eficientes protocolos para transformação de plantas utilizando-se o sistema de Agrobacterium tumefasciens, permitiram, entre outras aplicações (Zambryski, 1988), testar a teoria da resistência a vírus através do uso de plantas transgênicas (Beachy, 1988). O primeiro relato de proteção de plantas mediada pela capa protéica (CPMP) foi verificado em “tobacco mosaic virus” (TMV) em, 1986, em um trabalho de colaboração entre pesquisadores da Monsanto e da Universidade de Washington (St. Louis) (Powell Abel et al., 1986). De acordo com levantamento realizado por Wilson (1993), até o presente, a resistência à infecção viral baseada no uso do gene da capa protéica foi descrita para mais de 20 viroses em, pelo menos, 10 grupos taxonômicos diferentes em um grande número de dicotiledôneas, e esta lista tem aumentado rapidamente. Em monocotiledôneas este tipo de resistência ainda não foi verificado devido principalmente às dificuldades técnicas para a transformação genética e para regeneração destas plantas. No momento, alguns grupos estão tentando utilizar a proteção da capa protéica contra importantes viroses de arroz, como: “rice tungro vírus” e “rice stripe tenuivirus” e, também, para viroses de milho. Até o presente, a maioria dos exemplos descritos de resistência através da capa protéica foi verificada para viroses de RNA positivo de fita simples (Baulcombe et al., 1987; Beachy et al., 1990; Fitchen & Beachy, 1993) com apenas dois exemplos de vírus de RNA negativo, “tomato spotted wilt virus” (TSWV) e “rice stripe tenuivirus” (Gielen et al., 1991; De Haan et al., 1992). Ainda não foram descritos trabalhos conclusivos mostrando resistência da capa protéica a viroses com genoma composto de DNA de fita dupla ou de fita simples: caulimo, badna e geminivirus. A maioria das espécies de plantas não são hospedeiras das centenas de fitoviroses descritas até o momento. Na maioria dos casos, os mecanismos não são conhecidos, e, portanto, esta incompatibilidade não pode ser explorada. Em contrapartida, todas as culturas são suscetíveis à infecção causada por um ou por mais vírus, acarretando significativas perdas de produção. Tal situação exige que os produtores e os órgãos responsáveis adotem medidas preventivas e de controle contra as doenças fitoviróticas. Entre estes métodos, destacam-se o uso de semente certificadas e de mudas livres de vírus nas culturas perenes e erradicação de plantas doentes; emprego de práticas culturais adequadas e controle químico de vetores, como insetos, nematóides e fungos; introdução de genes naturais de resistência contra o vírus (ou inseto) vetor, através do melhoramento genético de plantas. Esta última estratégia, apesar de mais desejável e duradoura, é uma técnica de longo prazo e requer grande investimento em tempo e dinheiro, principalmente considerando-se a grande versatilidade dos genomas virais e a existência de isolados que freqüentemente quebram estes genes de resistência. Pouco ou quase nada se sabe sobre o controle genético das interações vetor- planta. Grande parte de resistência de plantas à infecção viral identificada parece ser monogênica com dominância (Fraser & Loughlin, 1982; Fraser, 1983), mas tais genes ainda não foram clonados ou sequenciados, apesar de, em algumas culturas, como tomate, fumo e batata significativos progressos terem sido alcançados com alguns genes de resistência (Ex.: Tm1, Tm2, TM2 em tomate; Rx, Ry, em batata; N e N’, em fumo). Sem dúvida, muitos outros genes de resistência estão presentes em coleções de germoplasmas, mas, freqüentemente, são originados de espécies selvagens, não podendo ser usados convenientemente em programas de melhoramento genético. Portanto, a possibilidade de transferir-se, em uma única etapa, um gene de resistência, através da produção de plantas transgênicas, mostrou-se promissora, principalmente do ponto de vista comercial. Posteriormente, estes genes poderiam ainda ser utilizados em programas convencionais de melhoramento, criando-se resistências múltiplas destas combinações genotípicas. A resistência natural a viroses pode ser classificada em diferentes níveis (Hull & Davies, 1992): imunidade, na qual o vírus não se multiplica; infecção sublimal, na qual a replicação do vírus limita-se às células infectadas; reação de hipersensibilidade, onde a infecção viral fica restrita às células vizinhas do sítio primário de infecção, normalmente causando necroses. Em plantas tolerantes, verifica-se uma infecção pouco severa ou mesmo plantas assintomáticas, apesar de a replicação viral não ser afetada. O fenótipo de plantas transgênicas expressando genes virais pode variar caso a caso, desde um retardamento no aparecimento dos sintomas da doença, até a completa imunidade à inoculação do vírus ou de seu RNA. Mesmo o uso de plantas tolerantes ao vírus pode ser vantajoso, permitindo que as plantas se recuperem da infecção, evitando-se danos causados pela doença, bem como diminuindo o seu potencial de atuar como fonte de inóculo. Em plantas hospedeiras com reação de hipersensibilidade, a resistência de plantas transgênicas pode ser quantificada diretamente pela redução no número de lesões locais. Mesmo a redução na quantidade de vírus em infecções sistêmicas pode auxiliar no controle de viroses, reduzindo-se a eficiência da transmissão pelo vetor. Várias estratégias têm sido empregadas na tentativa de se obter resistência a fitoviroses, através do uso de plantas transgênicas. Tais estratégias variam basicamente no tipo de gene escolhido para se efetuar a transformação genética, sendo empregados o gene da capa protéica (o mais amplamente utilizado), o gene que codifica a polimerase viral e os genes que codificam proteínas não estruturais, que compreendem proteínas de replicação, de transporte e de transmissão. Além disso, vírus satélites e mutantes virais como RNA defectivos interferentes, têm sido utilizados devido à sua ligação com a atenuação dos sintomas causados por algumas fitoviroses (Tabela 1). Tais estratégias são descritas a seguir. PROTEÇÃO MEDIADA PELA PROTEÍNA DA CAPA PROTÉICA A resistência mediada pela capa protéica (CP) é utilizada para se referir à resistência obtida pela expressão do gene que codifica a proteína do Tabela 1. Exemplos de proteção a fitoviroses baseados no uso de plantas transgênicas Transgene e estratégia de proteção Viroses Capa Protéica Expressão da Proteína TMV, AIMV, CMV, TSV, PVX, PVY, TEV, TRV, PEBV, ToMV, PMMV, TMGMV, PLRV, TSWV, INSV, WMV II, ZYMV, PVS, PRV, SMV RNA-“Antisense” PVY, TSWV, INSV, TEV, PVX, PLRV, CMV, ZYMV Proteínas Não-Estruturais Replicase Viral TMV, PEBV, CMV, AIMV, BMV, PVX, CyRSV Proteínas de Transporte, Transmissão, Holoenzimas, “Subdomains” TMV, CMV, TRV, TSWV, AIMV, PLRV, PVX, BMV, CaMV Vírus Satélites CMV, TRSV RNAs Defectivos Interferentes BMC, ACMV, TSWV, CyRSV TMV (tomato mosaic virus), AIMV (alfalfa mosaic virus), CMV (cucumber mosaic virus), TSV (tobacco streak virus), PVX (potato virus X), PVY (potato virus Y), TEV (tobacco etch virus), TRV (tobacco rattle virus), PEBV (pea early browning virus), ToMV (tomato mosaic virus), PNMV (pepper mild mottle virus), TMGMV (tobacco mild green mosaic virus), PLRV (potato leafrollvirus), TSWV (tomato spotted wilt virus), INSV (Impatiens necrotic spot virus), WMV II (water mellon mosaic virus II), Zuchini yellow mosaic virus), PVS (potato virus S), SMV (soybean mosaic virus), BMV (brome mosaic virus), CaMV (cauliflower mosaic virus), CyRSV (cymbindium ringspot virus). capsídeo em plantas transgênicas. A acumulação da proteína da capa confere resistência à infecção ou ao desenvolvimento da doença causada pelo vírus do qual o gene foi originado, assim como contra viroses relacionadas. A produção de plantas transgênicas resistentes a infecções viróticas requer conhecimento prévio da organização genômica do vírus como também conhecimento da epidemiologia da doença. Também é de crítica importância que técnicas de transformação e de regeneração in vitro sejam desenvolvidas para as espécies de planta escolhidas para serem transformadas geneticamente. Até o momento, não existe um modelo definitivo para o mecanismo de proteção pelo uso do gene que codifica a proteína da capa protéica. A literatura disponível desde 1986 (Wilson, 1993; Fitchen & Beachy, 1993) mostra muitos pontos específicos para cada interação vírus- planta-CP e mesmo algumas características comuns a vários tipos de viroses. No entanto, os resultados devem ser interpretados com cautela em relação ao tipo de gene utilizado na construção das plantas transgênicas, à posição do transgene na planta, ao número de cópias do gene integradas no genoma e à atividade de transcrição. Também devem-se considerar outros fatores, como: grau de interferência, sítio de inibição da replicação viral, transporte do vírus na planta, efeitos secundários dos genes introduzidos no metabolismo das plantas hospedeiras, e respostas da planta à infecção viral. Após relacionar todos estes fatores, pode-se entender qual o mecanismo de proteção propiciado pela capa protéica, ou mesmo por qualquer outro tipo de gene utilizado. Os primeiros experimentos envolvendo o uso da capa protéica como forma de proteção foram baseados na produção de RNA transcritos da fita “sense” do gene que codifica para a proteína do capsídeo, freqüentemente contendo a seqüência terminal 3' do genoma viral (Baulcombe et al., 1987; Beachy, 1988; Beachy et al., 1990). Parece existir uma correlação direta entre a quantidade de proteína da capa protéica funcional produzida em plantas transgênicas e a eficiência da proteção obtida. No entanto, altas concentrações de vírus no inóculo, ou mesmo o uso de RNA não-encapsidado, parecem quebrar esta resistência. Porém, a teoria da necessidade da presença de proteína intacta para a obtenção de resistência, como verificado para TMV, para “tobacco rattle virus” (TRV), para “tobacco streak vírus” (TSV) ou para “alfalfa mosaic virus” (AIMV) em fumo (Powell Abel et al., 1986; Loesch-Fries et al., 1987; Van Dun et al., 1987) não foi verificada para os vírus “cucumber mosaic vírus” (CMV), “potato vírus X” (PVX), “potato vírus S” (PVS) onde o m- RNA “antisense” do gene da proteína do capsídeo protegeu as plantas contra a infecção viral (Cuozzo et al., 1988; Hemenway et al., 1988; MacKenzie & Tremaine, 1990). Novos exemplos estão surgindo como “potato vírus Y” (PVY), PLRV e TSWV, onde RNA “antisense” e “open reading frames” (ORFs) truncados (onde AUG foi deletado ou mutado) foram utilizados para a transformação de plantas, produzindo proteção contra os vírus, ou mesmo imunidade (Lindbo & Dougherty, 1992a,b; Fang & Gruinet, 1993). Experimentos de campo de várias linhagens de plantas transgênicas transformadas com RNA não-traduzível de “tobacco etch virus” (TEV) (Lindbo & Dougherty, 1992a,b) mostraram elevados índices de resistência, mesmo sob alta pressão de inóculo. Nestes casos, parece ocorrer alguma forma de interação direta RNA-RNA entre as linhagens transgênicas e o vírus. Entretanto, os mesmos autores observaram, também, no caso de TEV contendo a proteína truncada, que as folhas inoculadas apresentavam sintomas e concentrações de vírus semelhantes ao controle, porém as plantas transgênicas apresentavam, em fase mais tardia, uma recuperação dos sintomas da doença. Estes resultados sugerem um mecanismo de interferência na translocação do vírus no interior da planta e algumas evidências mostram o envolvimento da região C-terminal da proteína da capa protéica do TEV neste provável mecanismo. A proteção de plantas transgênicas baseada na produção da proteína funcional da capa protéica sugere a interferência no processo de decapsidação do vírus. Entretanto, alguns resultados também indicaram a interferência em eventos mais tardios do processo de infecção viral (Osbourn et al., 1989; Wisniewski et al., 1990), principalmente nos casos em que a proteção ocorreu quando apenas o RNA viral foi utilizado como inóculo (Hemenway et al., 1988; MacKenzie & Tremaine, 1990). A ocorrência de múltiplos mecanismos de interferência dependerá da natureza das interações vírus-planta, incluindo a especificidade das células e dos tecidos onde a proteína da capa protéica é expressada, o local de replicação do vírus, e como o vírus é translocado de célula para célula e a longas distâncias no interior da planta. Utilizando-se promotores específicos para expressão da capa protéica do TMV, demonstrou- se que o nível da CP proteína nas células epidérmicas de fumo é determinante para obtenção de proteção contra o vírus inoculado mecanicamente (Clark et al., 1990; Reimann-Philipp & Beachy, 1993). Em geral, a proteção baseada no uso da capa protéica é bastante efetiva contra vírus estreitamente relacionados (Van Dun & Boi, 1988). Utilizando-se grande número de isolados do grupo Tobamovirus, foi encontrada proteção quando as proteínas da capa protéica apresentavam uma homologia na seqüência de aminoácidos superior a 60 % (Nejidat & Beachy, 1990). Por outro lado, tais percentagens podem ser bastante variáveis, como no caso de tospoviroses, onde isolados com até 80 % de homologia no nucleocapsídeo quebraram a resistência (De Haan et al., 1992). Proteção cruzada entre vírus não relacionados foi relatada em plantas transgênicas, expressando o gene da capa protéica de viroses como “zucchini yellow mosaic virus”, TMV, AIMV, “soybean mosaic virus” (SMV) ou CMV (Fang & Grumet, 1993; Anderson et al., 1989; Stark & Beachy, 1989; Nakajima et al., 1993). É possível que outros mecanismos, além da capa protéica, estejam envolvidos no fenômeno de proteção. Vários experimentos com diferentes viroses têm tentado desvendar os mecanismos envolvidos na proteção de plantas baseada no uso da capa protéica. Tais experimentos concentram-se principalmente na construção de mutantes (contendo deleções ou substituição de aminoácidos no gene do capsídeo), analisando os efeitos destas mutações no nível de proteção obtido (Fitchen & Beachy 1993). Porém, até o momento, uma indicação conclusiva do tipo de mecanismo envolvido não foi conseguida. ESTRATÉGIA DOS RNAS “ANTISENSES” Como demonstrado, os resultados obtidos de plantas transgênicas transformadas com mRNA “antisense” da capa protéica dos vírus CMV, PVX ou TMV (Powell-Abel et al., 1990; Cuozzo et ai., 1988; Hemenway et ai., 1988), mostraram apenas uma proteção limitada, quando comparada com a proteção obtida pela expressão da proteína. Estes RNAs “antisense” continham também parte (PVX), ou toda a seqüência (CMV, TMV), do terminal 3’, fato que poderia contribuir para o mecanismo de proteção, através da hibridização com seqüências sinais específicas de replicação do vírus invasor. Até recentemente, a proteção obtida através do uso de RNA “antisense” não foi definitivamente provada. Entretanto,resultados recentes de plantas transgênicas transformadas com RNA “antisense” da capa protéica de diversos potyvirus, luteovirus e tospovirus demonstraram que este tipo de proteção realmente ocorre (Van der Vlugt et al., 1992; Linbdo & Dougherty, 1992a,b; Fang & Grumet, 1993; De Haan et al., 1992). O uso de seqüências intercistrónicas de BMV RNA3 (Huntley & Hall, 1993) também demonstrou ser eficiente para a obtenção de proteção, interferindo com a replicação do vírus em protoplastos infectados. PROTEÇÃO MEDIADA PELO USO DE PROTEÍNAS DE REPLICAÇÃO E DE OUTRAS PROTEÍNAS NÃO-ESTRUTURAIS Grande número de estratégias envolvendo a transformação de plantas com diferentes porções do genoma viral tem sido empregado no sentido de produzir plantas resistentes a fitoviroses. A resistência tem sido conseguida utilizando-se a proteína da capa protéica como foi discutido anteriormente (Powell-Abel et al., 1986; Beachy et al., 1990; Fitchen & Beachy, 1993; Wilson, 1993), RNAs satélites (Gerlach et al., 1987; Harrison et al., 1987), RNAs “antisense” (Cuozzo et al., 1988; Hemenway et al., 1988, De Haan, et al., 1992) e mais recentemente, genes que codificam proteínas não-estruturais (Golemboski et al., 1990; Lomonossof, 1992). Golembosky et al., (1990) demonstraram que plantas transgênicas transformadas, com proteína 54 K, correspondente à parte da proteína de replicação 183 K, foram altamente resistentes à inoculação de isolados de TMV. Tal resistência estava associada a uma redução drástica na concentração do vírus em todos os estádios de replicação (Carr & Zaitlin, 1991). Apesar de a proteína 54 K não ser detectada nas plantas transgênicas, estudos empregando-se mutagênesis sugerem que a presença da proteína, e não do RNA transcrito, é essencial para o fenômeno de proteção (Carr et al., 1992; Carr & Zaitlin. 1991; Lomonossoff, 1992). Em Nicotiana benthamiana, transformada com uma seqüência equivalente (a proteína 54 K) à proteína 201 K de replicação do “pea early browning virus” mostrou ser resistente à infecção de PEBV e a duas outras viroses relacionadas (MacFarlane & Davies, 1992). Também neste caso experimentos envolvendo mutações demonstraram a necessidade da presença da proteína completa. Até onde estes dados refletem a funcionalidade dos fragmentos de polipeptídeos, ou simplesmente a sua estabilidade in vivo, ainda necessita de investigações adicionais. Recentemente, foi demonstrado que uma forma defectiva da proteína 97 K do CMV com provável função de replicação protegeu plantas transgênicas contra o isolado homólogo e também contra outros isolados de cucumovirus pertencentes ao subgrupo I (Anderson et al., 1992), porém não foi verificada proteção contra isolados do grupo II. Esta proteína corresponde à região 54 K da proteína do TMV e do PEBV. Em contraste, plantas transgênicas de fumo expressando proteínas funcionais de replicação P1 e P2 de AIMV RNAs l e 2 não apresentaram resistência ao vírus (Van Dun et al., 1988; Van der Kuyl et al., 1991). Resultado semelhante foi verificado para protoplastos expressando a proteína codificada pelo RNA 2 do “brome mosaic vírus” (BMV) (Mori et al., 1992). Entretanto, a resistência obtida nestes casos é relativamente específica, sendo restrita aos isolados homólogos ou aos estreitamente relacionados (Golemboscki et al., 1990; Braun & Hemenway, 1992; MacFarlane & Davies 1992; Anderson et al., 1992; Longstaff et al., 1993). Em geral, plantas transformadas com seqüências gênicas correspondentes a partes da proteína de replicação viral (replicase) parecem ser bastante promissoras e ainda mais efetivas quando a proteína expressada é não-funcional. Devido às replicases serem mais conservadas entre os isolados virais, estas podem se constituir em fonte mais eficiente e duradoura de resistência a fitoviroses. Exemplos, como os mencionados, de plantas transformadas com a proteína 54 K (parte de replicase) do TMV (Golemboski et al., 1990) do “pea early browning vírus” (PEBV) (MacFarlane & Davies, 1992), de plantas contendo a replicase truncada do CMV (Anderson et al., 1992) ou PVX (Braun & Hemenway 1992) ou de plantas transformadas com a replicase mutada também do PVX (Longstaff et al., 1993) reforçam esta hipótese. Em contrapartida, plantas transgênicas expressando replicases funcionais do AIMV (Van Dun et al., 1988), BMV (Mori et al., 1992) e alguns isolados de PVX (Longstaff et al., 1993) foram suscetíveis à infecção viral, indicando que os mecanismos envolvidos parecem complexos. Recentemente, Donson et al. (1993) demonstraram que plantas de fumo contendo a replicase completa do TMV (proteína 183 K) foram suscetíveis ou apresentaram pequena resistência contra a infecção do vírus. Estes mesmos autores, porém, demonstraram que plantas transgênicas contendo as mesmas seqüências gênicas, mas com uma inserção de nucleotídeos proveniente de uma bactéria que interrompia a ORF, foram altamente resistentes ao TMV e também a um grande número de tobamoviroses (Donson et al., 1993). Este fenômeno está sendo agora estudado para elucidar os mecanismos envolvidos no processo de proteção. USO DE PROTEÍNAS DE TRANSPORTE Uma função única dos vírus de planta é a produção de proteínas especializadas em “abrir” as conexões citoplasmáticas intercelulares da célula (plasmodosmata), entre células vizinhas, para permitir o transporte das partículas virais e, consequentemente, a disseminação da infecção. Provavelmente, o vírus é transmitido na forma de complexos de ribonucleoproteínas e não na forma de vírus completo (Wolf et al., 1989; Ding et al., 1992). A proteína 30 K do TMV é um exemplo de proteína de transporte e foi demonstrado que ela tem atividade de ligação a RNAs de fita simples (Citovsky et al., 1992). Plantas transformadas com um mutante termosensível do gene 30 K mostraram uma redução na concentração de vírus, de 15 ug/g de folha, na temperatura de 24 ºC, para 1.5 pg/g de folha, a temperatura de 33 ºC, a temperatura não-permissiva (Malyshenko et al., 1993). Interações de compatibilidade entre proteínas de transporte (MPs) codificadas pelos vírus e entre proteínas de plantas hospedeiras têm sido apontadas como responsáveis pela gama de hospedeiras das diversas viroses. Deste modo, a proteína 30 K do TMV não poderia inibir o transporte do TMV em trigo ou em cevada. Contrariamente ao que se poderia esperar, a expressão da proteína de transporte 32 K do BMV em plantas transgênicas de fumo, onde ela não é funcional, pode reduzir a translocação de um outro isolado de TMV. Recentemente, foi relatado que a expressão em plantas transgênicas de um gene mutante da proteína de transporte de um isolado de TMV (incapaz de ser transportado de célula a célula) foi efetiva, não só na proteção contra vários isolados de TMV, como também interferiu na translocação de todos os tobamovirus (Fitchen & Beachy, 1993), Proteínas de transporte recombinantes ou quiméricas, de 2 geminivirus, “tomato golden mosaic” (TGMV) e “African cassava mosaic virus” (ACMV), mostraram-se promissoras no sentido de serem usadas como genes de resistência através da produção de plantas transgênicas (Von Arnin & Stanley, 1992). O vírus do mosaico da couve-flor (CAMV) e a maioria dos potyvirus são transmitidos por insetos (afídeos), através de um mecanismo no qual os vírus se ligam ao estilete do vetor por intermédio de uma proteína bifuncional codificada pelo vírus. Acredita-se que esta proteína tem a função de reconhecer a proteína da capa protéica e a superfície receptora no vetor. Mutações nestas proteínas, denominadas “Helper component”, ou em fatoresde transmissão de afídeos mostraram ter efeito de inteferência com a transmissão normal de alguns vírus em experimentos com dietas artificiais (Blanc et al., 1993). Portanto, parece possível prevenir a propagação de viroses transmitidas por insetos, por fungos ou por nematóides, através da produção de plantas transgênicas expressa PROTEÇÃO MEDIADA PELO USO DE VÍRUS SATÉLITES E DE RNAs DEFECTIVOS INTERFERENTES A capacidade de alguns vírus satélites de atenuarem os sintoma causados pelos seus vírus, denominados como “helpers” possibilitou o uso daqueles em inoculações em casa de vegetação e em culturas no campo. Plantas transgênicas expressando vírus satélites de CMV ou “tobacco ringspot virus” (TRSV), produziram resistência contra os sintomas severos dos respectivos vírus e inibiram a replicação viral (Baulcombe et al., 1986; Harrison et al., 1987; Jacquemond et al., 1988; Gerlach et al., 1987). O vírus satélite do CMV protegeu também contra os sintomas causados pelo “tomato aspermy virus”, porém sem causar redução na replicação deste vírus. Portanto, a redução na replicação parece não ser o único mecanismo de proteção propiciado pelos satélites. Os vírus satélites de TRSV também interferem na replicação e nos sintomas causados por outro nepovírus, “cherry leafroll virus”, apesar de este vírus não agir como “helper” para o satélite do TRSV (Ponz et al., 1987). O mecanismo de atenuação de sintomas através do uso de vírus satélite ainda não está esclarecido. O risco de mutações para um vírus satélite mais severo (uma simples modificação de nucleotídeo seria suficiente) e a limitada ocorrência na natureza, bem como possíveis mudanças na relação “helper”- satélite, limitam o uso de plantas transgênicas expressando estes tipos de moléculas. Os RNAs defectivos interferentes, comuns em vírus que infectam animais, ocorrem naturalmente em membros dos grupos Tombovirus, Carmovirus e Tospovirus (Hillman et al., 1987, Burgyan et al., 1989; Li et al., 1989; Resende et al., 1991, 1992). Como os vírus satélites, estas moléculas de RNA defectivo atenuam acentuadamente os sintomas causados pelos vírus. Esta atenuação ocorre principalmente devido à interferência destes RNAs na replicação dos vírus nos quais foram originados. Recentemente, foi demonstrado em protoplastos de cevada que mutantes deletados de BMV RNA 2 agem como DI artificiais (Marsh et al., 1991a,b). A interferência na replicação foi demonstrada também com RNAs “antisense” transcritos da região intercistrônica do RNA 3 do BMV (Huntley & Hall, 1993), que possui função de regulação. A primeira demonstração do uso de DIs naturais na atenuação de sintomas em plantas transgênicas foi conseguida com o RNA subgenômico ssDNA do componente B do vírus ACMV geminivirus (Frischmuth & Stanley, 1991), o qual interferiu na replicação dos componentes A e B, mas não interferiu com outro geminivirus “tomato golden mosaic virus”. Os DI RNAs originados do segmento L do TSWV foram recentemente caracterizados, mostrando que tais moléculas causam marcante atenuação de sintomas (Resende et al., 1991, 1992). As plantas transgênicas de fumo expressando uma molécula destes RNAs interferentes mostraram ser resistentes à infecção do TSWV e o provável mecanismo envolvido parece ser baseado na estratégia do RNA “antisense” (Resende, 1993). USO DE RIBOZIMAS Ribozimas são pequenas moléculas de RNA derivadas do vírus satélite do TRSV, ou de alguns viróides, os quais apresentam atividade catalítica de clivagem de moléculas de RNA (Symons, 1989; Edington & Nelson, 1992). Esta clivagem pode ser direcionada no sentido de um RNA específico. Devido à esta propriedade, os ribozimas têm sido expressados em plantas transgênicas, porém, em níveis ainda muito baixos. Para os vírus de plantas esta estratégia talvez possa ser bastante efetiva para auxiliar a clássica proteção cruzada, fazendo com que as estirpes fracas expressem ribozimas na forma de RNA subgenômico ativo contra outro vírus severo. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS O emprego de plantas transgênicas expressando genes de organismos fitopatogênicos, como fungos, bactérias e principalmente viroses, constituem-se, sem dúvida, numa alternativa promissora para o controle efetivo destes fitopatógenos. Apesar das muitas indagações que ainda permanecem, principalmente aquelas relacionadas à especificidade da resistência, aos mecanismos envolvidos e à durabilidade desta resistência em condições de campo, os resultados de pesquisa têm demonstrado que a resistência transgênica é uma realidade. Cabe agora aos pesquisadores elucidar as várias perguntas ainda sem resposta. No caso específico de fitoviroses, o uso de plantas transgênicas, combinado sempre com genes naturais de resistência, constituirão as estratégias utilizadas na busca de proteção contra estes patógenos. Dados estatísticos de mais de 393 campos experimentais, envolvendo plantas transgênicas (de mais de 25 espécies), entre os anos de 1986-1991 (em 21 países), mostraram que, em pelo menos 50 delas, foi obtida resistência de campo, variando desde o retardamento no aparecimento de sintomas até a completa imunidade (Wilson, 1993). Porém, em experimentos de campo, a resistência parece não se manifestar de maneira previsível, como nos experimentos de casa de vegetação, provavelmente devido à ação de fatores ambientais. No entanto, variedades resistentes têm sido selecionadas e novos resultados estão surgindo baseados nesta estratégia. Por outro lado, algumas características da resistência transgênica a infecções virais permanecem sem resposta, como o efeito do número de cópias e a posição de inserção no genoma vegetal do gene transferido, o nível de expressão e a estabilidade genética deste gene, efeitos pleiotrópicos causados pelo transgene e a ocorrência de variações somaclonais durante o processo de transformação genética (Dale et al., 1993). Outro fator de extrema importância é a necessidade de se avaliar a resistência transgênica em diferentes condições ambientais. Os genótipos transgênicos resistentes devem ser testados a nível de campo, em contato com os vetores de viroses, no sentido de avaliar-se com precisão o comportamento da resistência obtida, em condições normais de cultivo. Para isto, é necessário que se estabeleçam legislações ambientais compatíveis para monitorar estes experimentos, bem como, que se atue no sentido da liberação dos possíveis genótipos resistentes a serem comercializados. O entendimento dos mecanismos que atuam na interação vírus- hospedeiro resultando em resistência a infecções virais, certamente permitirão que seja feita uma avaliação mais precisa dos riscos causados pela liberação destas plantas modificadas em condições de campo. Alguns riscos potenciais tem sido levantados como a possibilidade de ocorrência de transencapsidação ou encapsidação heteróloga entre viroses (Tepfer, 1993) e recombinação entre os transgenes produzidos pela planta e o genoma viral (Greene & Allison, 1994; Falk & Bruening, 1994). A questão da liberação de plantas transgênicas no campo vem sendo amplamente debatida no sentido de criar normatizações que possam ser seguidas nos diversos países onde organismos transgênicos tem sido produzidos e testados. A avaliação dos riscos destas liberações de campo deve ser feita com critério envolvendo membros da comunidade científica e organizações governamentais visando evitar o uso indiscriminado destes organismos (Dale et al., 1993). Novas estratégias para obtenção de resistência a fitoviroses tem sido desenvolvidas, combinando o uso de múltiplosgenes da capa protéica (dois ou três genes clonados em um único vetor de expressão) para transformação de plantas (De Haan, P., comunicação pessoal), assim como, plantas transgênicas transformadas com seqüências conservadas do gene da polimerase, no sentido de conferir resistência mais ampla e duradoura. Novas combinações contendo promotores específicos para diversos tipos de tecidos vegetais (ex.: floema-específico) têm sido empregadas visando expressar seletivamente genes que codificam proteínas de transporte e de transmissão por vetores. Múltiplas construções, empregando-se simultaneamente transgenes da capa protéica e proteínas de transporte (defectivas ou disfuncionais), parecem ser extremamente efetivas, podendo conferir resistência a múltiplas viroses simultaneamente (Beachy, R., comunicação pessoal). Em última instância, plantas transgênicas resistentes a fitoviroses poderão ser utilizadas como fonte de genes de resistência para os programas de melhoramento, contornando problemas de transferência gênica e de incompatibilidade interespecífica. Além disso, a expressão de proteínas virais em plantas transgênicas poderá contribuir para a elucidação dos diversos eventos que ocorrem durante o processo de infecção causado por e estes patógenos. No Brasil, a estratégia de produção de plantas transgênicas visando obtenção de resistência está sendo implantada em vários programas de pesquisa, principalmente, devido ao treinamento de pesquisadores brasileiros em grandes centros de pesquisa onde esta tecnologia vem sendo desenvolvida. Alguns programas já foram implementados em empresas de pesquisa do sistema EMBRAPA e em algumas universidades, como a de Brasília (UnB) e a do Rio de Janeiro (URFJ). 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