Bombardeamento de Particulas e Implicações Praticas da sua utilização em patologia de Plantas

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BOMBARDEAMENTO DE PARTÍCULAS E 
IMPLICAÇÕES PRÁTICAS DA SUA 
UTILIZAÇÃO EM PATOLOGIA DE PLANTAS 
 
Luiz Gonzaga Esteves Vieira 
IAPAP, Caixa Postal 1331, 86001-970 Londrina, PR, Brasil 
 
 
RESUMO 
 
Esta revisão tem como objetivo dar uma perspectiva do 
bombardeamento de partículas como um método de transformação e, também, 
descrever algumas de suas aplicações em patologia de plantas. Recentemente, 
foram publicadas diversas revisões sobre o desenvolvimento, a operação e a 
otimização do bombardeamento para uso em pesquisas básicas e engenharia 
genética. Portanto, estes tópicos não serão cobertos de maneira exaustiva; 
entretanto, será abordado o potencial do bombardeamento de partículas para a 
transformação de plantas, e de outros organismos, como uma ferramenta para 
estudar a manipulação controlada de genes envolvidos nas relações patógeno-
hospedeiro. Embora a transformação genética mediada pela aceleração de 
micropartículas seja somente um dos muitos métodos de transformação 
disponíveis para a obtenção de organismos transgênicos, as diversas 
características distintas deste sistema podem ajudar na aplicação das novas 
estratégias de controle de doenças, como também permitir o entendimento de 
aspectos básicos da biologia de plantas e da genética de patógenos. 
 
 
SUMMARY 
 
PERSPECTIVES OF APPLICATIONS OF PARTICLE 
BOMBARDMENT IN PLANT PATHOLOGY 
This review is intended as a perspective on particle bombardment 
mediated transformation and its special applications in plant pathology. Since 
several recent reviews have dealt with the development, operation and 
optimization of this system for both basic research and genetic engineering, 
these topics will not be covered comprehensively. Rather, the potential of 
particle bombardment for transformation of plants and other organisms as a 
tool for the controlled manipulation of genes involved in the pathogen-host 
relationships will be explained. Although particle-mediated genetic 
transformation is only one of the many transformation methods available to 
obtain transgenic organisms, several unique characteristics of this system may 
help using new disease control strategies and provide means to better 
understand basic plant biology and pathogen genetics. 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
Os progressos proporcionados pela aplicação dos métodos 
biotecnológicos têm influenciado dramaticamente os avanços científicos 
ocorridos nos últimos anos. As ferramentas da biologia molecular oferecem 
novas oportunidades para patologistas de plantas através do estudo dos 
mecanismos de regulação e expressão gênica, da estrutura e da função de 
proteínas, culminando no entendimento dos aspectos fisiológicos e 
bioquímicos da resistência de plantas as doenças. 
O rápido desenvolvimento da engenharia genética depende de 
alguns importantes requisitos, entre os quais destaca-se a disponibilidade de 
sistemas para transferência de genes confiáveis e eficientes. A transferência 
genética através do uso das técnicas do DNA recombinante é de importância 
fundamental para a manipulação controlada de genes. Transformação pode ser 
definida como a introdução de genes em células, tecidos ou órgãos, direta ou 
indiretamente, usando-se os métodos desenvolvidos pela biologia celular e 
molecular. Em plantas, além do seu papel primordial que é a incorporação de 
novas características, tais como resistência a pragas e doenças, tolerância a 
estresses ambientais, melhoria da qualidade nutricional, entre outras, a 
aplicação das técnicas de transformação permite estudos básicos e/ou 
aplicados visando responder questões fundamentais sobre a relação entre 
estrutura e função dos genes. Também, constante progresso tem sido 
observado no entendimento dos processos de introdução, de expressão 
transitória e de integração estável do DNA através do desenvolvimento de 
métodos de transformação. Diferentes técnicas têm sido usadas para 
transformar plantas. Estas técnicas podem ser agrupadas em métodos diretos 
de transferência de DNA e em métodos que tiram proveito de vetores 
biológicos para a introdução de DNA no genoma recipiente. 
No atual estádio de desenvolvimento do processo de transformação 
de plantas, o sistema mais usado é o da transferência de DNA via 
Agrobacterium. Sem dúvida, este método é o que tem apresentado os 
melhores resultados até o momento e, por isso, tem sido usado rotineiramente 
para a transformação de muitas espécies. Entretanto, há limitações no sistema, 
principalmente aquelas relacionadas às interações inter e intra-específicas 
entre bactéria e planta, à necessidade de protocolos de cultura de tecidos mais 
elaborados é a utilização de vetores mais complexos. 
Tendo em vista estas limitações, grandes investimentos foram feitos 
no aprimoramento e no desenvolvimento de outros métodos de transferência 
direta de genes, tais como: eletroporação, bombardeamento de partículas, 
 
eletroforese, micro e macroinjeção, liposomos e sonicação, entre outros. Com 
exceção dos dois primeiros, estes métodos ainda não estão bem aperfeiçoados 
e mais estudos são necessários para confirmar a sua validade. 
Atualmente, o sistema de bombardeamento de partículas (biolística, 
balística, aceleração de partículas, bombardeamento de microprojéteis) é o 
que tem recebido maior atenção devido à facilidade, praticidade e rapidez nas 
operações, além da relativa independência quanto ao uso de genótipos e de 
protocolos específicos de cultura de tecidos. 
A atratividade deste método deve-se não somente à possibilidade 
de obter plantas transgênicas de espécies anteriormente consideradas 
recalcitrantes, como também à demonstração que o bombardeamento de 
partículas permite a transformação de fungos, de bactérias, de animais e de 
organelas. 
Como todos os outros métodos de transformação conhecidos 
apresentam algumas limitações, seria imprudente julgar que o bombardeamento 
de partículas pudesse ser considerado o método “universal”. Porém, algumas 
de suas vantagens tornam-no o método de escolha para estudos de fatores 
ambiente/tecido-específicos que controlam a expressão gênica. 
Embora o bombardeamento de partículas seja somente mais um 
dentre os vários métodos de transformação, algumas de suas características 
tornam este sistema adequado para ajudar na interpretação de processos 
fundamentais em patologia de plantas. Esta revisão pretende dar uma 
perspectiva da transformação através do bombardeamento de partículas como 
um instrumento para estudar a manipulação controlada de genes envolvidos 
nas interações patógeno-hospedeiro, indo, portanto, além do simples processo 
de obtenção de plantas transgênicas. Levando-se em conta as várias revisões 
recentes que abordam os equipamentos utilizados e as variáveis que afetam a 
eficiência do método (Sautter et al., 1991; Kikkert, 1993; McCabe & Christou, 
1993; Vain et al., 1993a; Sanford et al., 1993), estes tópicos não serão 
cobertos de forma exaustiva. Entretanto, alguns dos parâmetros básicos serão 
discutidos para melhor entendimento do potencial do método, e de como a 
aplicação do bombardeamento de partículas pode contribuir para que novas 
estratégias de controle de patógenos possam ser mais rapidamente 
incorporadas aos programas integrados de proteção de plantas. 
 
 
 
PRINCÍPIOS BÁSICOS DO BOMBARDEAMENTO DE 
PARTÍCULAS 
 
O bombardeamento de partículas é um método físico para a 
introdução de ácidos nucléicos ou de outras substâncias em células/tecidos 
intactos, através da utilização de micropartículas de metal aceleradas a alta 
velocidade. Este conceito foi primeiramente descrito por Sanford et al. (1987) 
como meio de incorporar genesao genoma nuclear de plantas. Comparado 
com outras técnicas de transformação, o bombardeamento de partículas pode 
ser considerado como o sistema que demonstra a menor especificidade quanto 
ao genótipo, permitindo trabalhar com espécies e com variedades antes 
julgadas de difícil transformação. Também, este método prescinde de 
protocolos complicados de cultura de tecidos para a regeneração de plantas. 
Ainda, é possível utilizar como explante-alvo vários tipos de células e de 
tecidos, tais como: suspensões celulares, calos, meristemas, embriões 
zigóticos e somáticos, micrósporos, pólen etc., demonstrando que qualquer 
tipo de tecido capaz de ser regenerado ou micropropagado in vitro pode ser 
transformado por meio desta técnica. 
Além de sua utilização básica na transformação, o bombardeamento 
mostra-se importante em experimentos de expressão transiente para a análise 
funcional de seqüências promotoras que regulam fatores tecido/ambiente-
específicos e também para estudos de seqüências regulatórias codificando 
genes que atuam em trans (Goff et al., 1990). 
Apesar das vantagens acima citadas, o bombardeamento de 
partículas mostra-se altamente dependente de alguns parâmetros físicos, 
ambientais e biológicos, que necessitam de permanente controle para evitar a 
alta variabilidade comumente observada no sistema (Birch & Franks, 1991). 
 
Equipamento 
 
Até pouco tempo atrás, um dos fatores mais limitantes à ampla 
utilização do bombardeamento de partículas era o alto custo e a complexidade 
do único equipamento comercializado. As exigências excessivas dos detentores 
da patente para utilização desse equipamento motivou diversos grupos a 
desenvolverem seus próprios protótipos. Foram criados inúmeros modelos que 
variam não somente quanto à facilidade de operação, como também quanto 
aos custos de fabricação e de manutenção. 
O primeiro equipamento desenvolvido utiliza pólvora para acelerar 
as partículas de metal. Estas partículas, cobertas de DNA, são colocadas em 
um macroprojétil de nylon que é acelerado, através de uma explosão, dentro 
de um tubo, até atingir um anteparo de impacto. Somente as partículas 
continuam sua trajetória através de uma pequena abertura no anteparo, 
atingindo o explante-alvo. Todo esse processo ocorre dentro de um recipiente 
sob vácuo parcial. Este modelo básico não permite o controle da velocidade 
das partículas e, devido às variações na quantidade de pólvora em cada 
macroprojétil, verifica-se um alto grau de variabilidade (Franks & Birch, 
1991). Pela concentração de partículas no centro da área-alvo e pelo choque 
acústico, este sistema causa dano apreciável aos explantes; o uso de peneiras 
 
entre o anteparo de impacto e o explante minimiza o dano às células e melhora 
o perfil de distribuição das partículas (Gordon-Kamm et al., 1990). 
Em um esforço para obter maior controle de velocidade, de 
dispersão e de penetração de partículas e para diminuir os danos causados aos 
explantes-alvos, novos sistemas de aceleração foram criados. Sanford et al. 
(1991) desenvolveu um sistema de bombardeamento onde uma pressão 
controlada do gás hélio acelera uma membrana de plástico carregada de 
partículas; após percorrer curta distância, a membrana carreadora é 
desacelerada pelo impacto em uma tela fixa e somente as partículas continuam 
o seu percurso até atingir o explante-alvo sob vácuo parcial. A pressão é 
controlada por um disco de ruptura, que pode apresentar diferentes espessuras, 
de acordo com a pressão desejada. A distância entre o disco de ruptura e a 
membrana carreadora pode ser modificada, permitindo variar a velocidade das 
partículas conforme o tipo de explante-alvo usado. 
Morikawa et al. (1989) utilizou um sistema semelhante, mas com 
nitrogênio. O mesmo grupo (Iida et al., 1990) também desenvolveu um 
equipamento pneumático de aceleração de partículas. O protótipo é bastante 
similar àquele que emprega pólvora, mas o agente propelente é o ar 
comprimido, o que permite controlar a velocidade das partículas. Um 
equipamento mais prático, de baixo custo e de fácil construção foi 
desenvolvido por Finer et al. (1992), empregando um filtro para seringas de 
ácido inoxidável, adaptado a um tubo ligado à fonte de gás pressurizado. As 
partículas são colocadas sobre o filtro, o qual recebe um pulso de gás hélio 
controlado por uma válvula solenóide conectada a um “timer”. Uma versão 
deste modelo, ainda mais simplificada, pode ser construída em qualquer 
laboratório a partir de componentes facilmente encontrados em casas de 
ferragens e em empresas de equipamentos técnico-científicos (Gray et al., 
dados não publicados). 
McCabe et al. (1988) transformou tecidos meristemáticos de soja 
com um equipamento que utiliza descargas elétricas. A aceleração das 
partículas é conseguida por um capacitor de alta voltagem que vaporiza uma 
pequena gota de água, criando, assim, uma explosão que impulsiona uma 
membrana que carrega as partículas recobertas de DNA. 
“Micro-targeting” é a denominação do sistema de bombardeamento 
de partículas criado por Sautter et al. (1991). Neste sistema, o DNA não é 
precipitado em partículas de metal, mas uma mistura combinando esses dois 
componentes é vaporizada e, em seguida, acelerada por um pulso de gás em 
um tubo capilar. Com a ajuda de microscopia, o tubo capilar é direcionado 
para o explante-alvo. Como o nome indica, este sistema foi desenvolvido para 
permitir o bombardeamento de tecidos com diâmetro inferior a 0.15 mm, 
podendo ser regulado para a penetração das partículas em camadas celulares 
específicas. Isto significa um grande avanço no que diz respeito à 
transformação de tecidos meristemáticos. 
 
Parâmetros físicos e biológicos 
 
Atualmente, a maior limitação técnica ao bombardeamento de 
partículas é a variabilidade inerente ao sistema. As observações de diversos 
grupos de pesquisa apontam a inconsistência dos resultados, embora a 
repetibilidade mostre-se satisfatória. Para a obtenção de plantas transgênicas, 
esta variabilidade não assume papel restritivo se o protocolo de cultura de 
tecidos propiciar altas taxas de regeneração e de multiplicação do explante-
alvo. Por outro lado, em estudos quantitativos de regulação e expressão gênica 
transiente, é necessária a elaboração de experimentos compostos de grande 
número de repetições, além de controles internos para otimizar os diversos 
parâmetros físicos e biológicos que afetam a eficiência do bombardeamento 
de partículas. A expressão transiente com o gene indicador GUS medido 
através de ensaio histoquímico e fluorimétrico (Jefferson et al., 1987) tem sido 
a metodologia mais empregada para determinar as melhores condições de 
bombardeamento para cada tipo de experimento envolvendo transformação. 
Os principais parâmetros físicos incluem o tamanho e o tipo de 
partículas, a pressão, a distância percorrida pela partícula até o explante alvo e 
a quantidade de partículas utilizadas em cada bombardeamento. 
O tamanho ótimo das partículas depende, em grande parte, do tipo 
do explante-alvo. Klein et al. (1988b) determinou que, para células de 
suspensão de milho, as partículas com tamanho médio de 1,25 m eram mais 
eficientes do que as de 2,4 e de 0,6 m. Resultados similares foram descritos 
por Duchesne & Charest (1991) e Wang et al. (1988) em Picea mariana e em 
Triticum monococcum, respectivamente. Em fungos, tamanho de partículas 
variando entre 0,5-0,65 m (1/10 do tamanho das células) mostram resultados 
superiores (Armaleo et al., 1990); também foi possível a transformação de 
mitocôndria de levedura através do uso de partículas de l m, tamanho este 
comparável ao da própria organela (Johnston et al.,1988). 
O tungstênio e o ouro são os dois tipos de metais utilizados para a 
produção das partículas. Devido ao menor custo e à disponibilidade em vários 
tamanhos, partículas de tungstênio têm sido as mais empregadas, apesar de 
apresentarem problemas de toxicidade para alguns tipos de explantes, de 
maior oxidação interferindo na precipitação de DNA na superfície da partícula 
e de aglutinação das partículas, provocando maiores danos aos explantes-alvos 
pela má-dispersão (Vieira, dados não publicados). Por serem mais uniformes 
no tamanho, mais esféricas e de fácil preparação através de sais de ouro e de 
reagentes usados na revelação de fotografias (Sautter et al., 1991), as 
partículas de ouro têm sido preferidas em certos protocolos de transformação. 
Outros tipos de partículas foram descritos (Sanford et al., 1993), entretanto 
mais estudos são necessários para confirmar a validade do uso destas 
alternativas. 
 
Nos equipamentos que empregam gases pressurizados para acelerar 
as partículas, a repetibilidade do sistema é afetada pela pressão usada em 
associação com o vácuo aplicado, pela distância percorrida pela partícula e 
pelo tipo de tecido a ser transformado (Klein et al., 1992; Russell et al., 
1992b; Pereira, 1993). De modo geral, a alta pressão (1000 a 2000 psi) causa 
aumento na transformação transiente, mas o dano causado no explante-alvo 
aumenta devido às injúrias motivadas pelo choque acústico e pelo gás. Para a 
maioria das situações, a pressão de 400 a 1200 psi proporciona os melhores 
resultados, sendo que para a transformação de tecidos compostos de várias 
camadas celulares podem ser utilizadas pressões maiores. 
Quanto maior a distância percorrida pelas partículas até atingir o 
explante-alvo menores serão o impacto e a penetração nas células. Porém, a 
dispersão será melhor e, como conseqüência, as injúrias resultantes do choque 
acústico serão reduzidas. Logicamente, este fator está correlacionado com a 
pressão utilizada e o com o vácuo. Ye et al. (1990) demonstrou claramente a 
importância da interação entre pressão e distância na transformação de 
cloroplastos em células em suspensão de tabaco. 
A precipitação do DNA nas partículas constitui-se na maior causa 
da inconsistência que afeta o bombardeamento de partículas, sendo que 
ocorrem flutuações na eficiência, dependendo do operador e mesmo do dia da 
preparação (Sanford et al., 1993). A quantidade de DNA que recobre as 
partículas também tem influência no número de bombardeamentos/explante. 
Enquanto alguns estudos mostram que mais de um bombardeamento aumenta 
as injúrias no tecido (Reggiardo et al., 1991; Kartha et al., 1989) outros 
descrevem uma associação positiva entre expressão transiente e número de 
bombardeamentos, sem que esse aumento signifique maior dano aos 
explantes-alvos (Wang et al., 1988; Klein et al., 1988a; Pereira, 1993). 
Aparentemente, as injúrias estão mais relacionadas com o equipamento usado, 
com a velocidade e dispersão de partículas e com o tipo de tecido. O uso de 
filtros, de peneiras e de outras formas de cobertura para o explante-alvo pode 
ajudar a diminuir o dano às células e ocasionar a melhor distribuição de 
partículas, aumentando, assim, a expressão transiente. 
Vários parâmetros biológicos que interferem com a eficiência do 
bombardeamento de partículas já foram identificados, incluindo o tipo e a 
qualidade do explante-alvo, os vetores, os tratamentos pré- e pós-
bombardeamento, entre outros. 
De modo geral, a incubação dos explantes-alvos em meio de cultura 
com reguladores de crescimento, alguns dias antes do bombardeamento, torna 
as células mais receptivas à transformação (Seki et al., 1991; Serres et al., 
1992; Basdeo & Vieira, dados não publicados). Em embriões somáticos, 
diferenças na eficiência de transformação são observadas conforme o estádio 
de desenvolvimento (Ellis et al., 1993). Evidências também indicam que a 
eficiência do bombardeamento é altamente dependente da freqüência da 
subcultura do explante-alvo. Isto significa que há uma faixa ótima de dias para 
o bombardeamento, após o início da subcultura (Duchesne & Charest, 1991), 
e que decorrido este período a expressão transiente cai dramaticamente (Vasil 
et al., 1991). 
Em Bacillus megaterium, células no início da fase logarítimica 
foram transformadas com mais eficiência (Shark et al., 1991), enquanto que 
nenhuma diferença foi verificada entre as células de Escherichia coli em 
várias fases de desenvolvimento (Smith et al., 1992). 
Pelo acima exposto, pode-se verificar que inexiste definição clara 
do período ótimo para bombardeamento, mas, de modo geral, percebe-se que 
as células que se dividem ativamente são mais competentes para 
transformação, ou então que, em certas fases de desenvolvimento, as células 
conseguem resistir mais às injúrias causadas pelo processo de 
bombardeamento. 
Pré- e pós-condicionamento osmótico das células/tecidos pode 
aumentar as taxas de transformação, além de diminuir a variabilidade do 
sistema entre experimentos. Acredita-se que o aumento da osmolaridade evita 
a extrusão do protoplasma pela plasmólise das células (Vain et al., 1993b; 
Russell et al., 1992a). Os benefícios da introdução dos fatores osmóticos no 
meio de cultura (manitol, sorbitol etc.) também são observados em bactérias e 
em fungos (Armaleo et al., 1990; Sanford et al., 1993). O dessecamento das 
células antes do bombardeamento e o uso de frascos/placas de cultura que 
permitem trocas gasosas são outros artifícios usados para aumentar a 
eficiência do sistema (Vain et al., 1993b). Estes resultados mostram que a 
alteração das condições fisiológicas das células provoca profundas 
modificações na eficiência do bombardeamento. Sem dúvida, maior esforço é 
necessário para estabelecer quais as variáveis que tornam as células mais ou 
menos receptivas à transformação através de bombardeamento. 
Naturalmente, é necessário contar com vetores adequados para 
otimizar os protocolos de transformação e para introduzir as seqüências de 
interesse de forma estável. É óbvio que a expressão de genes heterólogos em 
um organismo requer elementos estruturais que sejam reconhecidos pelo 
sistema de transcrição daquele organismo (tais como promotores, “enhancers”, 
sinais de terminação e poliadenilação), além de genes marcadores e/ou 
indicadores apropriados. 
O efeito de diferentes promotores tem sido bastante estudado em 
bombardeamento de partículas através de análise da expressão transiente de 
genes indicadores (GUS, antocianina, luciferase etc.). Em plantas, os 
promotores constitutivos derivados do CAMV 35S, com ou sem seqüências 
intensificadoras de expressão (“enhancers”) são os mais utilizados (Franche et 
al., 1991; Warkentin et al., 1992; Charest et al., 1993). Dependendo da 
espécie estudada, do tecido/órgão e do estádio de desenvolvimento do 
explante-alvo, vetores construídos com promotores de outros genes tais como 
 
o do cloroplasto de ervilha - psbA (Daniell et al., 1991), o da antera de tomate 
- LAT 52 (Nishihara et al., 1993), o da metionina de trigo induzido por ABA - 
Em (Robertson et al., 1992), o da enzima álcool dehidrogenase 1 de milho - 
Adh 1 (Somers et al., 1992), entre outros, podem apresentar maior eficiência 
tanto na expressão transiente como também na transformação estável de 
plantas. 
Para a obtenção de plantas transgênicas, é fundamental a escolha de 
genes mercadores apropriados. Os genes para resistência a antibióticos, como 
neomicina fosfotransferase II (NPT II) e higromicina B fosfotransferase (hpt) 
têm sido mais freqüentemente usados para selecionar plantas transgênicas. 
Os genes que conferem resistência a herbicidas (EPSPS- glifosato; 
ALS - sulfonilureias; bxn - bromoxinil; bar - bialaphos) são alternativas para a 
seleção, especialmente em gramíneas, as quais apresentam alta resistência 
natural aos antibióticos aminoglicosídicos. 
Em relação a fungos e a bactérias, não há ainda resultados 
suficientes para mostrar o efeito de diferentes elementos estruturais dos 
vetores na eficiência de transformação através do bombardeamento de 
partículas. Normalmente, são utilizados vetores com replicação autônoma 
(Smith et al., 1992), apesar de, em fungos, vetores integrativos proporcionarem 
alta eficiência de transformação (Armaleo et al., 1990). Os genes indicadores 
que têm sido descritos para transformação de fungos são agrupados em dois 
tipos. Os primeiros são baseados em resistência a drogas, como higromicina B 
fosfotransferase (Burland et al., 1991). O segundo grupo inclui genes que 
codificam enzimas que podem ser colorimetricamente analisadas, tais como 
Adh 1 (Santangelo et al., 1988), lac Z (Van Gorcom et al., 1986) e GUS 
(Bunkers, 1991). Obviamente, estes mesmos genes indicadores são apropriados 
para utilização em experimentos de bombardeamento de partículas. 
 
 
TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS 
 
Comparado com os outros métodos de transformação de plantas 
atualmente disponíveis, o bombardeamento de partículas é insuperável em 
estudos da expressão transiente de genes em diferentes tecidos/órgão, estádios 
específicos de desenvolvimento da planta, ambientes e constituição genética 
diversas (Potrykus, 1991). A expressão transiente pode ser definida como a 
expressão de genes não integrados após a sua introdução nas células e/ou nos 
tecidos. Normalmente ela é medida após alguns dias da introdução do gene, 
mas pode ser detectada até muito tempo depois (Ellis et al., 1993). Embora a 
obtenção de plantas transgênicas seja fundamental para os estudos da 
regulação gênica em plantas (Maniatis et al., 1987), a expressão transiente 
constitui-se em valioso sistema experimental devido a sua rapidez e à 
facilidade de utilização. 
A análise da expressão transiente permite identificar e caracterizar 
seqüências de DNA que atuam como elementos reguladores tanto em cis como 
em trans. A fusão destes elementos com genes indicadores de fácil detecção e 
quantificação permite entender os mecanismos envolvidos na expressão 
temporal e/ou espacial de genes e suas respostas a elicitores intra e 
extracelulares. Para tanto, é fundamental que as células/tecidos de interesse 
sejam transformados. 
A introdução do DNA em protoplastos, promovida por polietileno-
glicol (PEG) ou por eletroporação, pode ser considerada como o sistema 
modelo para estes tipos de estudos (Dhir et al., 1991). Apesar de ser uma das 
técnicas mais eficientes e confiáveis de transferência direta de genes, a 
maioria dos sistemas experimentais para a cultura de protoplastos depende da 
capacidade de regenerar plantas, o que não é facilmente conseguido para 
algumas espécies e genótipos dentro de espécies (Vasil, 1988). Além disso, as 
células cultivadas in vitro nem sempre representam o mesmo padrão de 
expressão gênica do tecido que lhes deu origem. 
O bombardeamento de partículas proporciona uma maneira de 
eliminar essas barreiras em estudos de expressão transiente, sendo que os 
genes podem ser introduzidos em praticamente qualquer espécie, tecido ou 
célula, dependendo apenas da otimização dos parâmetros de bombardeamento 
e do tipo de vetor. Devido a essas vantagens, o bombardeamento vem sendo 
utilizado para estudar seqüências de DNA envolvidas na regulação de genes 
do fitocromo (Dehesh et. al., 1990), de genes envolvidos na biossíntese de 
antocianina (Goff et al., 1990; Ludwig et al., 1990), de genes pólen-
específicos (Nishirara et al., 1993; Twell et al., 1989) e endosperma-
específicos (Lee et al., 1991). Estes estudos representam a aplicação imediata 
do bombardeamento para investigar os mecanismos da expressão gênica. 
Também, a simplicidade do sistema oferece uma oportunidade 
única para verificar se determinado vetor será expresso da maneira esperada, 
aumentando, assim, a probabilidade de que o objetivo final - obtenção de 
plantas transgênicas - tenha maiores chances de sucesso. As condições de 
bombardeamento apresentando os mais altos valores para a expressão 
transiente são normalmente utilizadas como referencial básico para determinar 
quais os parâmetros que permitem aumentar a probabilidade de obter 
transformantes estáveis (Birch & Franks, 1991; Serres et al., 1992; Ellis et al., 
1993; Aragão et al., 1993). A demonstração de que 90 % da atividade 
transiente é detectada em células que receberam o gene em seu núcleo após o 
bombardeamento, o que facilitaria a sua integração no DNA cromossômico, 
vem em suporte desse procedimento (Yamashita et al., 1991). Entretanto, é 
mais seguro e recomendável estabelecer experimentos para otimizar os 
parâmetros de bombardeamento que maximizem a transformação estável, pois 
nem sempre o alto nível de expressão transiente está correlacionado com a 
 
recuperação de plantas transgênicas (McCabe & Christou, 1993). 
Apesar de notáveis progressos, o desenvolvimento de processos 
eficientes e efetivos para a obtenção de plantas transformadas de maneira 
estável ainda continua sendo prioritário. A conjugação desta técnica com o 
poder analítico das metodologias do DNA recombinante abre novas 
possibilidades para estudos básicos de biologia como, também, para a 
produção de organismos transgênicos com valor comercial. Neste contexto, o 
bombardeamento de partículas apresenta certas vantagens que podem permitir 
a produção de plantas transgênicas de virtualmente qualquer espécie. A 
regeneração de transformantes estáveis através de bombardeamento já foi 
conseguida em inúmeras espécies de interesse econômico. Entre as espécies 
de maior importância podem ser citadas: soja (McCabe et al., 1988; Finer & 
McMullen, 1991), algodão (Finer & McMullen, 1990; McCabe & Martinelli, 
1993), milho (Gordon-Kamm et al., 1990), feijão (Russell et al., 1993), cana-
de-açúcar (Gambley et al., 1993), trigo (Vasil et al., 1992; Weeks et al., 1993) 
e arroz (Christon et al., 1991). 
Das espécies acima mencionadas, merecem destaque as 
monocotiledôneas. Pela sua importância econômica, a possibilidade de criar 
cereais transgênicos fácil e rapidamente traria enorme vantagem para o 
melhoramento. Com a impossibilidade de usar Agrobacterium tumefasciens 
para introduzir DNA em cereais, o método mais promissor parecia, 
inicialmente, ser o uso de protoplastos. Entretanto, excluído o arroz, a 
transformação de protoplastos tem sido menos efetiva que o esperado. Assim, 
até o momento, o único método apresentando altos níveis de sucesso é a 
transformação através do bombardeamento de plantas. 
O amplo espectro de espécies transformadas através dessa técnica 
aponta para uma de suas principais características, que é a possibilidade de 
utilizar diversos tipos de células/tecidos vegetais. Células em suspensão, calos 
embriogênicos, seções foliares e de caule, meristemas, embriões somáticos e 
zigóticos são alguns dos explantes usados como alvo para a obtenção de 
transformantes. 
Obviamente, a escolha do explante tem impacto pronunciado nos 
protocolos de regeneração e de seleção de plantas transgênicas. A não 
aplicação de agentes seletivos durante o processo de regeneração de plantas 
pode produzir grande número de quimeras e de escapes (Bower & Birch, 
1992; Christou et al., 1990), entretanto também é possível produzir plantas 
transgênicas via bombardeamento sem usar qualquer tipo de seleção (Chee & 
Slinghton, 1992; Russell et al., 1993). Geralmente, a exposição dos explantes 
aos agentesseletivos inicia-se alguns dias após o bombardeamento. Isto 
permite que as células atingidas pelas partículas tenham possibilidade de se 
recuperarem do trauma sofrido, porém a proliferação do explante por um 
período muito longo sem seleção pode aumentar demasiadamente o número de 
plantas não-transgênicas (Fromm et al., 1990). É claro que a seleção do agente 
seletivo varia de acordo com o sistema utilizado. De modo geral, a dose ideal 
do agente seletivo é aquela que suprime o desenvolvimento das células não 
transformadas, não chegando entretanto a matá-las. Isto porque possíveis 
substâncias tóxicas liberadas pelo tecido morto poderiam inibir o crescimento 
das células transformadas. 
Da mesma maneira que os outros métodos de transformação direta, 
a integração de genes ao genoma das plantas transformadas por 
bombardeamento de partículas mostra padrões complexos. É comum 
encontrar várias cópias (intactas ou rearranjadas) de genes inseridos em uma 
única ou em múltiplas regiões do genoma (Klein et al., 1988c; Finer & 
McMullen, 1991). Podem ocorrer truncação, rearranjos e concatenação do 
DNA antes ou durante a integração, embora a observação de que diferentes 
genes em diferentes plasmídeos, que são precipitados para a transformação 
conjunta, estejam freqüentemente ligados no genoma recipiente mostre que o 
modo pré-integrativo é mais freqüente (Gordon-Kamm et al., 1990; Spencer et 
al., 1990). Isto torna possível a introdução de características não-
selecionáveis, através da co-transformação com um gene marcador. A seleção 
baseada na expressão deste último gene permite a seleção indireta do gene de 
interesse. 
 
 
TRANSFORMAÇÃO DE ORGANELAS 
 
Métodos que possibilitem a transformação de organelas são 
essenciais para o melhor entendimento do funcionamento dos genes dessas 
estruturas subcelulares. Cloroplastos e mitocôndrias possuem genomas 
relativamente pequenos, quando comparados com o núcleo. Este genoma 
codifica não mais que 10 % do polipeptídeo necessário para assegurar o 
funcionamento dessas organelas, sendo que o restante é produzido por genes 
nucleares e importados através das membranas das organelas. Portanto, 
modificações em algumas das características dessas organelas podem ser 
conseguidas através de mudanças no genoma nuclear. Em alguns casos, é 
possível a transferência de proteínas para cloroplastos ou mitocôndrias, 
através da fusão de uma seqüência codificando um peptídeo de trânsito ao 
gene de interesse antes da transformação nuclear. Algumas características de 
importância agronômica são codificadas diretamente pelo genoma das 
organelas e/ou são resultado da interação destes com os produtos dos genes 
nucleares. Portanto, métodos que permitam a manipulação controlada dos 
genomas de organelas têm sido intensamente buscados. 
Comparada com a transformação de genes nucleares, a falta de 
métodos eficientes para introduzir genes em cloroplastos e em mitocondrias é 
notável. O bombardeamento de partículas oferece a possibilidade de transferir 
DNA a essas organelas suplantando algumas barreiras, tais como a possível 
 
impermeabilidade ao DNA das membranas duplas e a dificuldade de detectar 
cópias únicas do gene introduzido em células contendo numerosas organelas. 
Provavelmente, a capacidade das partículas de penetrarem as membranas 
duplas e de introduzirem várias cópias do gene de interesse em organelas, 
cada qual contendo múltiplas cópias do genoma, é a razão dos bons resultados 
já obtidos em mitocôndria de leveduras (Fox et al., 1988; Johnston et al., 
1988) e em cloroplasto de Chlamydomonas (Boynton et al., 1988; Blowers et 
al., 1989) através do bombardeamento de partículas. 
Nos dois casos, a identificação de transformantes foi realizada 
através de seleção para complementação de uma mutação específica. A 
utilização deste procedimento deve-se ao fato de que poucas mutações que 
eliminam a função de genes de cloroplastos, e principalmente de mitocôndrias, 
são conhecidas, fazendo com que a procura de novas alternativas de genes 
mercadores para a seleção de organelas transformadas seja considerada de alta 
prioridade. 
A transformação de cloroplastos de plantas através de 
bombardeamento de partículas foi primeiramente demonstrada por Daniell et 
al. (1990), através da expressão transiente do gene da enzima cloramfenicol 
acetiltransferase (CAT). Algumas das condições para a otimização dos 
protocolos de transformação desta organela também foram estudadas (Ye et 
al., 1990). 
A transformação estável de cloroplastos foi conseguida em 
Nicotiana tabacum, usando-se um sistema de seleção para a resistência à 
spectinomicina, tanto para identificar calos resistentes como para a 
subseqüente regeneração de plantas (Svab et al., 1990). 
Em mitocôndria, transformantes foram selecionados através da 
complementação de mutações que redundam em deficiências respiratórias. 
Johnston et al. (1988) trabalhou com uma cepa de levedura portadora de 
mutação em gene nuclear resultando em auxotrofia, associada a uma mutação 
de gene mitocondrial que exige o uso de uma fonte de carbono fermentável 
para o crescimento. Através do co-bombardeamento com DNA capaz de 
complementar ambas as mutações foi possível a produção de l (um) 
transformante mitocondrial para cada 1000-2000 transformantes nucleares. 
Usando uma estratégia similar, Fox et al. (1988) foram capazes de transferir o 
gene oxil, envolvido na respiração, para mitocôndria de uma cepa de levedura 
mutante caracterizada pela completa ausência de DNA mitocondrial (rho). 
É interessante destacar que em todos os experimentos onde a 
transformação integrativa de organelas foi observada, a incorporação do DNA 
no genoma deu-se por recombinação homóloga, que não é a maneira mais 
comum para a transformação de genes nucleares. 
Maiores informações ainda devem ser buscadas para aumentar a 
eficiência da transformação de organelas através de bombardeamento de 
partículas. Há falta de genes marcadores específicos para organelas que 
otimizem os processos de seleção. Também, a transformação de organeIas é 
complicada, pois cada célula contém inúmeras organelas com múltiplos 
genomas, exigindo, portanto, certos procedimentos que permitam a 
dominância do genoma transformado ou, então, o estabelecimento de 
estratégias envolvendo um replicon independente nas organelas. Deve-se, 
ainda, assegurar que o DNA inserido não afete as funções dos genes existentes 
nas organelas. O mapeamento de uma região do DNA das organelas onde os 
genes marcadores possam ser inseridos é uma área de investigação que deve 
ser perseguida (Haring & De Black, 1990). 
Apesar dos problemas acima mencionados, o entendimento da 
regulação gênica em mitocôndria e em cloroplasto, em áreas como a 
modulação dos genes de organelas sob diferentes condições ambientais e a 
coordenação da expressão de genes nucleares e de organelas, seria aumentada 
substancialmente pelo uso do bombardeamento para a transformação. 
 
 
TRANSFORMAÇÃO DE MICRORGANISMOS 
 
Em comparação com plantas e com animais, as informações a 
respeito da transformação de microrganismos são bastante limitadas. No caso 
de bactérias, isto deve-se provavelmente à facilidade com que a maioria das 
espécies pode ser transformada. Apesar disto, o desenvolvimento de métodos 
simples e eficientes para a transformação de algumas espécies bacterianas que 
se apresentam recalcitrantes aos protocolos normalmente utilizados ainda é 
relevante. 
A eletroporação é atualmente o método de escolha para a 
transformação de espécies recalcitrantes (Calvin & Hanawalt, 1988; Bhowmik 
& Steele, 1993). Entretanto, em alguns casos, a complexidade dos pré-tratamentos necessários e a obrigatoriedade da utilização de plasmídeos de 
pequeno tamanho tornam a otimização do protocolo de eletro-transformação 
um processo bastante laborioso. A demonstração que o bombardeamento de 
partículas também pode ser utilizado para a transformação de bactérias 
ampliou o número de opções à disposição dos pesquisadores (Shark et al., 
1991). Através da otimização dos parâmetros de bombardeamento foi possível 
introduzir DNA em Erwinia amylovora, em Erwinia stewartii, em 
Agrobacterium tumefaciens e em Pseudomonas syringae pv. syringae, 
ampliando-se, assim, o número de espécies passíveis de serem transformadas 
sem grande esforço (Smith et al., 1992). 
Contrastando com as bactérias, a transformação genética de fungos, 
principalmente os fitopatogênicos, foi possível somente em alguns gêneros. 
Como a preparação de protoplastos já foi conseguida em fungos que 
representam os maiores grupos taxonômicos, este tem sido o método preferido 
para a transformação. Entretanto, a obtenção de protoplastos é influenciada 
 
por grande número de fatores, incluindo condições de crescimento e idade da 
cultura, concentração do estabilizador osmótico, pré-tratamento das células e 
enzimas. Estas variáveis não permitem o desenvolvimento de um protocolo 
considerado universal, e diferenças podem ser observadas mesmo para 
diferentes isolados de uma mesma espécie. Devido a essas dificuldades, seria 
natural verificar a aplicabilidade do bombardeamento de partículas para a 
transformação de fungos, o que foi demonstrado por Armaleo et al. (1990). 
Mais recentemente, fungos utilizados em controle biológico foram 
transformados através desta técnica, usando-se tanto plasmídeos como DNA 
genômico (Lorito et al., 1993). Estes casos mostram que o bombardeamento é 
uma alternativa ímpar para a transformação de fungos, abrindo a possibilidade 
de analisar a expressão gênica, a estrutura e a organização do genoma, o que 
não é possível através da genética mendeliana. 
 
 
UTILIZAÇÃO DO BOMBARDEAMENTO EM 
PATOLOGIA DE PLANTAS 
 
As bases moleculares da patogenicidade ou da resistência foram, 
até o momento, definidas de maneira inequívoca somente para poucas doenças 
de plantas. Grande parte do problema deve-se à falta de ferramentas 
adequadas para conduzir a experimentação. O desenvolvimento das técnicas 
de biologia molecular nas últimas duas décadas abre nova perspectiva para 
estudos mais detalhados de alguns dos complexos problemas encontrados em 
patologia de plantas. O exame da literatura indica claramente que o uso destas 
técnicas tem revolucionado os padrões pelos quais as questões relativas às 
interações plantas-patógenos são analisadas. É possível clonar genes, 
identificar seus produtos e confirmar as atividades destes. Além disso, genes 
relacionados, direta ou indiretamente, com processos de resistência ou de 
patogenicidade podem ser clonados e testados para verificar seus efeitos após 
a reintrodução em plantas suscetíveis ou em raças avirulentas de patógenos. 
É óbvio que as tecnologias para transferência de genes constituem-
se ponto vital para estudar como a expressão desses genes é controlada 
durante o processo de infecção. Devido às necessidades e às limitações de 
cada sistema experimental, grande variedade de métodos de transferência tem 
sido desenvolvidas, permitindo, assim, a transformação rotineira de plantas, de 
fungos e de bactérias. Algumas dessas metodologias mostram-se bastante 
ineficientes, dispendiosas e de difícil aplicabilidade a certas espécies e/ou 
tecidos (Leong, 1988; Potrykus, 1991; Sawahel & Cove, 1992), sendo, 
portanto, fundamental saber definir aquela que mais se ajusta a um programa 
experimental específico. Muitos dos métodos de transformação descritos já 
foram utilizados para obter plantas transgênicas resistentes a doenças e para 
investigar as interações entre plantas e patógenos. 
Neste contexto, o bombardeamento de partículas pode ser 
considerado apenas mais um dos métodos atualmente disponíveis para auxiliar 
na manipulação genética de plantas e de microrganismos. Porém, devido às 
suas peculiaridades anteriormente mencionadas, aumentam as possibilidades 
de aplicar alguns dos novos conceitos da biologia molecular para a obtenção 
de plantas resistentes e para a análise dos mecanismos de respostas das plantas 
aos patógenos. 
Por ser um dos métodos de mais recente desenvolvimento, a maior 
parte dos estudos em patologia de plantas envolvendo manipulação genética 
utilizou outras técnicas de transformação. Através do emprego do 
bombardeamento de partículas, estas estratégias - desde a incorporação de 
genes de resistência em plantas até a clonagem de genes - poderão ser 
ampliadas e/ou conduzidas com maior facilidade. Considerando o acima 
exposto, serão discutidos, a seguir, alguns exemplos de utilização do processo 
de transferência de genes em patologia de plantas, principalmente aqueles 
sistemas onde o bombardeamento possa contribuir. 
 
 
 
Produção de plantas transgênicas resistentes a patógenos 
 
Logicamente, a utilização básica do bombardeamento de partículas 
é como um veículo para a transformação genética rotineira de espécies 
vegetais de interesse agronômico, procurando obter plantas resistentes a vírus, 
a fungos e a bactérias. 
A produção de plantas transgênicas resistentes a vírus pode ser 
considerada a aplicação de maior sucesso da engenharia genética de plantas. 
Nos últimos anos, uma variedade de estratégias moleculares tem sido 
empregada para o controle de viroses. De modo geral, o objetivo final é obter 
uma planta transgênica resistente que expresse uma parte do genoma viral que 
interfira com algum aspecto do ciclo de multiplicação do vírus. Algumas 
dessas estratégias ainda estão sob investigação, enquanto outras já chegaram 
ao estágio de teste a campo. A que parece mais promissora é a estratégia da 
“Proteção Através da Expressão do Capsídeo Viral” (CPMP, em inglês). 
Desde 1986, data da primeira publicação descrevendo a estratégia CPMP 
(Powell et al., 1986), o uso desta tem se mostrado eficiente para grande 
número de vírus e de plantas hospedeiras (Beachy et al., 1990). Na maioria 
destes trabalhos, a transformação mediada por Agrobacterium foi o método 
utilizado para produzir as plantas transgênicas resistentes. O bombardeamento 
de genes está começando a ser explorado como alternativa em alguns casos 
(Fitch et al., 1992). 
A expressão de RNA complementar a uma parte do genoma viral 
 
(antisenso) é outra estratégia tentada para obter plantas resistentes a vírus. 
Esta técnica pode se mostrar especialmente vantajosa para vírus que são 
restritos a um tecido específico e para aqueles transmitidos por afídeos 
(Bejarano & Lichtenstein, 1992). 
Outro mecanismo para conferir proteção contra vírus é a indução da 
expressão de RNAs satélites. Esta estratégia foi aplicada em tomate (Tien & 
Wu, 1991), mas a sua plena utilização é ainda matéria de controvérsia. Como 
nem todos os RNAs satélites causam atenuação de sintomas e, algumas vezes, 
podem até causar necroses severas (Jaegle et al., 1990), prováveis riscos de 
mutação têm limitado o uso de RNAs satélites até que mais estudos 
demonstrem a estabilidade deste sistema. Recentemente, demonstrou-se que a 
transformação de plantas com genes não-estruturais (replicase) oferece altos 
níveis de proteção contra os danos causados por vírus (Carr et al., 1992). 
Além dos sistemas acima descritos, existe enorme potencial para o 
desenvolvimento de novas estratégias, apesar da falta de conhecimento mais 
preciso da bioquímica de resistência a vírus nas plantas. Algumas destas 
estratégias emergentes incluemo uso de ribozimas (RNA de pequeno tamanho 
com propriedades catalíticas), a ativação de genes tóxicos em plantas 
transgênicas, causada pela infecção viral, os mutantes dominantes negativos, a 
superexpressão de proteínas virais de movimento e a expressão de anticorpos 
específicos para proteínas virais (Scholthof et al., 1993). 
Nos últimos cinco anos houve considerável progresso na 
compreensão dos aspectos bioquímicos e moleculares envolvendo as respostas 
das plantas a fungos fitopatogênicos. A extensão desse conhecimento evoluiu 
para o desenvolvimento de várias estratégias para superar os problemas 
causados pelas doenças fúngicas. Uma das linhas de investigação que tem 
recebido maior atenção é a transformação de plantas com enzimas capazes de 
alterar os polissacarídeos presentes na parede celular de fungos. Através da 
expressão constitutiva desses genes (que normalmente são expressos somente 
através da indução pelo patógeno), é possível obter plantas resistentes às 
doenças fúngicas. Entre as enzimas com potencial antimicrobiano, podem ser 
destacadas: quitinases, quitina de acetilase, quitosanases e -1,3-glucanases. 
Plantas transgênicas com maior resistência a fungos fitopatogênicos já foram 
obtidas através da expressão destas enzimas, isoladamente ou em combinação 
(Broglie et al., 1991; Melchers et al., 1993). 
As “Proteínas Inativadoras de Ribossomos” (RIP, em inglês) 
inibem a síntese de proteínas pela modificação específica do 28S rRNA. As 
RIPs não causam a inativação dos ribossomos da própria planta, mas agem em 
ribossomos de outras espécies, incluindo fungos (Stirpe et al., 1992). A 
expressão da RIP de cevada em tabaco, sob controle de um promotor induzido 
por traumas, conferiu proteção contra Rhizoctonia solani (Longemann et al., 
1992). 
Outras proteínas envolvidas direta ou indiretamente na resistência a 
fungos fitopatogênicos são as chamadas “Proteínas Relacionadas com 
Patogênese” (proteínas PR, em inglês), que são proteínas expressas pela planta 
hospedeira após indução pelo patógeno ou por outra forma de estresse 
(Woloshuck et al., 1991). Uma estratégia seria testar a superexpressão dessas 
proteínas em plantas transgênicas. Outra, seria a expressão desses genes, de 
maneira constitutiva ou não, em sistemas heterólogos para verificar se a 
adição de proteínas com características distintas daquelas já presentes 
aumentaria o nível de resistência. 
A compreensão de como patógeno e hospedeiro interagem é 
fundamental para estabelecer novas alternativas para produzir plantas 
resistentes a fungos, usando-se genes clonados de resistência e de virulência. 
Baseado no conceito da interação específica gene-a-gene, de Wit (1992) 
postulou um modelo que propõe a introdução de genes de avirulência (avr) 
sob controle de promotores induzidos por uma ampla gama de patógenos e de 
maneira localizada em plantas contendo o gene de resistência correspondente 
(res). Dessa forma, a expressão do gene avr provocaria uma reação de 
hipersensibilidade, causada pela interação entre a proteína elicitora e o gene 
de resistência. O sistema avr-res poderia ser transferido em conjunto para 
plantas que não possuem o gene de resistência, ou até para outras espécies. 
Logicamente, o teste desse modelo depende da clonagem de genes de 
resistência e de avirulência, da disponibilidade de promotores específicos e 
das técnicas de transferência de genes eficientes e independentes de genótipo 
e/ou de espécie. É neste último ponto que o bombardeamento de partículas, 
por suas características, pode auxiliar sobremaneira na verificação das 
hipóteses acima mencionadas. 
A biossíntese e a acumulação de fitoalexinas envolvem a expressão 
de grande número de genes, o que torna a manipulação genética destes fatores 
mais difícil. Porém, a demonstração de que a patogenicidade de certos fungos 
depende da desintoxicação das fitoalexinas de plantas hospedeiras sugere que 
plantas transgênicas que produzem fitoalexinas modificadas de espécies não-
hospedeiras podem contribuir para a resistência a certos patógenos (Hain et 
al., 1990). Presume-se que a resistência a doenças conseguida pela produção 
de substâncias tóxicas é limitada às raças sensíveis, envolvendo interações 
específicas entre patógenos e hospedeiro. Apesar das dificuldades, o 
isolamento e a clonagem dos genes envolvidos nestas complexas rotas 
metabólicas são os primeiros passos para a manipulação desta característica 
em plantas transgênicas. 
O controle de doenças bacterianas, principalmente em países 
tropicais, apresenta-se como um desafio considerável. A inadequabilidade dos 
métodos de controle existentes, em conjunto com fatores ambientais e 
econômicos, tem estimulado a busca de outras formas de aumentar a 
resistência das plantas a esses patógenos. A introdução de genes responsáveis 
 
pela desintoxicação de toxinas produzidas por bactérias fitopatogênicas é uma 
dessas novas estratégias. Anzai et al. (1989) transferiram o gene da 
acetyltransferase (ttr) isolado de P. syringae pv. tabaci, que confere 
resistência a tabtoxina, para plantas de tabaco. As plantas transgênicas obtidas 
mostraram alto nível de expressão do gene ttr e nenhum sintoma após a 
infecção com o patógeno. 
Genes que codificam proteínas com atividade antibacteriana 
também têm sido buscados em genomas de insetos e de outros animais para 
serem utilizados em plantas. As lisozimas são as que têm apresentado as 
melhores perspectivas de utilização (Asselin, 1993), sendo que já foram 
obtidas plantas transgênicas de tabaco expressando lisozimas isoladas da clara 
do ovo de galinha (Trudel et al., 1992). A alta capacidade antibacteriana das 
cecropinas (pequenos polipeptídeos básicos isolados da hemolinfa de insetos) 
tornam-nas candidatas ao controle de bactérias fitopatogênicas através da sua 
incorporação em plantas (Nordeen & Owens, 1992). 
 
Clonagem de genes 
 
Um dos fatores que tem limitado a compreensão da interação entre 
patógenos e hospedeiros é a impossibilidade de se determinar a contribuição 
dos vários componentes envolvidos na resistência aos patógenos. Os 
mecanismos de defesa das plantas são ativados de maneira coordenada por 
patógenos e por elicitores; portanto, para que haja progressos significativos na 
investigação desses mecanismos, é fundamental considerar o isolamento de 
genes específicos que governam a resistência, a avirulência e a 
patogenicidade. Uma das estratégias bastante usadas para a clonagem de genes 
em fungos, na qual o bombardeamento de partículas poderá atuar como 
facilitador, é a complementação de genes. Este método nada mais é que a 
introdução de uma livraria genômica completa em um organismo recipiente 
geneticamente marcado, e a seleção para a complementação do defeito 
genético. Colônias transformadas, crescendo em condições seletivas, 
provavelmente, terão adquirido um plasmídeo que carrega um gene necessário 
para complementar o mutante. 
Esta metodologia, utilizando-se E. coli como recipiente devido à 
facilidade de transformação, foi usada para clonar os primeiros genes de 
fungos (Vapnek et al., 1977). Entretanto, a maioria dos genes de fungos não se 
expressa em E. coli, por problemas associados com o reconhecimento de 
promotores e de introns. O sistema ideal seria o uso de outros fungos como 
recipientes. Para que isto ocorra, o pré-requisito básico é a disponibilidade de 
um sistema eficiente de transformação. É neste contexto que o bombardeamento 
de partículas, por suas características, poderá contribuir na tarefa de clonar e 
de caracterizar os genes envolvidos na patogenicidade. 
Além disso, devido a sua eficiência na transformação transiente e 
estável,o bombardeamento seria de grande valia para procurar, no genoma de 
patógenos, promotores e ativadores que influenciam a patogenicidade. Isto é 
feito através da inclusão de um gene seletivo, mas sem promotor, no 
plasmídeo utilizado para clonagem. Quando seqüências são clonadas em tais 
plasmídeos, na região acima do gene sem promotor, e a seleção é feita para os 
transformantes que exibem atividade do gene, os clones selecionados têm alta 
probabilidade de possuírem seqüências promotoras de transcrição (Turgeon et 
al., 1987). 
Outras duas metodologias de clonagem de genes que necessitam de 
transformação são a desorganização de genes e a substituição de genes. A 
desorganização de genes consiste em inserir uma cópia de um marcador 
seletivo no gene clonado sob estudo. Esta construção é usada para transformar 
o mutante, selecionando-se para a não-expressão do marcador (Russell & 
Nurse, 1987). Ao contrário do método acima descrito, o propósito da 
substituição de genes é de reter a atividade do gene, modificando o seu 
produto ou a sua forma de regulação (Fincham, 1989). 
É bastante difícil clonar genes de resistência, pois, na maioria dos 
casos, os produtos destes genes não foram ainda identificados e o único 
genótipo passível de registro é a resposta da planta à inoculação com patógeno 
que carrega o gene de avirulência complementar. As metodologias que já 
foram investigadas, e que envolvem a transformação, são a complementação 
de genes e a marcação com transposons (Ellis et al., 1988). 
À semelhança dos genes envolvidos em patogenicidade, é possível 
clonar genes de resistência em plantas através da complementação funcional. 
A base lógica deste sistema envolve o uso de clones de uma livraria genômica 
de plantas resistentes a determinado patógeno para transformar genótipos que 
não possuem o(s) gene(s) de interesse, que será(ão), então, monitorado(s) para 
detectar a expressão fenotípica desejada (Keen, 1990). Apesar de bastante 
utilizada em microorganismos e também em vertebrados (Frech et al., 1989), 
esta metodologia tem sido ignorada em plantas. O bombardeamento de 
partículas, por ser um sistema perfeitamente ajustado para o estudo da 
expressão transiente em diferentes tecidos vegetais e até em plantas intactas, 
facilita bastante a clonagem por complementação de genes envolvidos nos 
mecanismos de defesa das plantas. 
A demonstração de que elementos de transposição isolados de 
milho são capazes de mover-se quando introduzidos em outras plantas (Baker 
et al., 1987) indica que esta técnica é aplicável a qualquer espécie na qual a 
transformação e a regeneração sejam possíveis. Esta metodologia permitiu o 
isolamento do primeiro gene específico de resistência a fungos, o locus Hm 1, 
em milho, que confere resistência à raça 1 de Helminthosporium carbonum 
(Johal & Briggs, 1992). Certamente, com a ampliação do número de espécies 
que agora podem ser transformadas pelo bombardeamento de partículas, 
surgirão novos exemplos do uso de transposons para a clonagem de genes de 
 
resistência a doenças em plantas. 
 
Análise de mecanismos regulatórios 
 
A possibilidade de isolar um gene de um organismo, de fazer 
alterações específicas e de reintroduzí-lo no mesmo ou noutro organismo 
permite a análise das funções desse gene com uma precisão que não era 
possível previamente, usando-se a genética clássica. 
Através do uso de genes indicadores e de sistema de transformação, 
as células podem ser definidas ao nível molecular pelos genes que elas 
expressam. Por exemplo, a expressão fenotípica de uma proteína indicadora 
pode ser usada para medir a atividade promotora de uma seqüência de DNA 
em fusão transcricional com a região codificadora de um gene indicador. 
Desse modo, a expressão gênica pode ser monitorada dentro de órgão de uma 
única planta e em todo o seu período de vida. Assim, é possível estudar a 
resposta das plantas aos sinais externos, tal como o desenvolvimento de uma 
interação positiva do patógeno com o hospedeiro (Doerner et al., 1990). 
Em patologia de plantas, os problemas com maior premência de 
serem estudados são aqueles relacionados às interações gene-a-gene. Se os 
genes de resistência e de avirulência estiverem clonados, é possível investigar 
as suas funções através da transformação de indivíduos que não carregam 
estes genes. Métodos de transformação eficientes podem auxiliar no 
entendimento dos mecanismos de defesa tanto em hospedeiros como em não-
hospedeiros, por meio da transformação de plantas com vetores carregando 
mutações de genes que podem modificar respostas específicas ao ataque de 
patógenos. 
Uma das questões que poderia ser mais bem elucidada com a ajuda 
de um sistema de transformação como o bombardeamento é aquela 
relacionada com a regulação da expressão de diferentes combinações alélicas 
de vários genes de resistência em uma mesma planta. Embora o melhorista 
possa, separadamente, incorporar estes genes em determinado cultivar, a 
introdução de vários loci de genes de resistência ao mesmo tempo é tarefa 
bastante árdua. Tendo-se clonado um ou mais genes de resistência, estes 
podem ser introduzidos em plantas. Também, vários alelos do mesmo locus 
poderiam ser transferidos para a mesma planta. Uma das conseqüências 
possíveis desta estratégia seria a resistência a várias raças do patógeno, 
existindo ainda a possibilidade de uma planta saturada de alelos de resistência 
tornar-se total e/ou permanentemente resistente a um patógeno específico. 
Da mesma forma, vários genes de patogenicidade e de avirulência 
poderiam ser introduzidos em patógenos para estudar os mecanismos 
envolvidos na infecção, no reconhecimento do hospedeiro e também nos 
processos de desenvolvimento como esporulação, formação de estruturas de 
infecção etc. (Leong, 1988; Crute & Norwood, 1986). 
Genes de avirulência de determinada raça de patógenos podem se 
expressar em diferentes raças (Staskawicz et al., 1985). Isto tem algumas 
implicações para a percepção da resistência de plantas, pois a teoria da 
interação gene-a-gene prevê que plantas hospedeiras que mostrem a mesma 
reação de hipersensibilidade a um patógeno carregando um gene de 
avirulência definido devem, necessariamente, possuir o mesmo gene de 
resistência. Dessa forma, pode-se sugerir que genes de resistência isolados de 
uma planta podem ser funcionais quando transferidos para outra planta ou 
mesmo para outra espécie. Portanto, este conceito pode ser estudado em 
diversos sistemas planta-patógenos através de métodos de transformação, 
como o de bombardeamento de partículas, o qual supera as barreiras de 
incompatibilidade sexual. 
Tal como os postulados de Koch são usados para definir a relação 
de causa-efeito nas relações entre microrganismos e doenças, Falkow (1988) 
propôs uma versão molecular daqueles postulados para determinar se as 
funções específicas dos patógenos contribuem para a virulência. Em resumo, 
os postulados moleculares de Koch estabelecem que uma associação 
epidemiológica deve existir entre a presença da função e a patogenicidade, 
que uma mutação específica seja construída para inibir a função, resultando 
em diminuição da virulência, e, finalmente, que a mutação seja 
complementada em trans somente através de um plasmídeo recombinante 
carregando o alelo selvagem. É nesta última etapa que o acesso a um sistema 
de transformação passa a ser fundamental para o cumprimento dos postulados 
e provar, de maneira definitiva, que determinada característica é um fator de 
virulência. 
O bombardeamento de partículas, por sua capacidade única em 
transformar organelas, oferece a oportunidade de investigar o papel dessas 
estruturas tanto naresistência como na patogenicidade. Por exemplo, 
plasmídeos, ou DNA com características de plasmídeos, localizados em 
mitocôndrias já foram identificados em fungos fitopatogênicos, mas sua 
associação com a patogenicidade não pode ainda ser confirmada de maneira 
incontestável (Hashiba et al., 1984; Kim et al., 1988). Assim, a transformação 
de mitocôndria abre a possibilidade de analisar o papel desses plasmídeos na 
patogenicidade ou em outros processos celulares. 
O bombardeamento de partículas pode também servir para auxiliar 
em algumas outras linhas de investigação que, em futuro próximo, poderão 
tornar-se extremamente importantes para o desenvolvimento de novas opções 
de controle de doenças em plantas. Em particular, pode-se mencionar: a) 
extensão do número de hospedeiros de um patógeno para identificação de 
fatores de virulência e para estudos dos mecanismos de defesa passivos e 
ativos (Schafer et al., 1988); b) estudos do controle de patogenicidade através 
da expressão de genes em diferentes estádios do ciclo de vida do patógeno 
(Bhairi et al., 1988); c) introdução de DNA, de RNAs ou de cDNAs de vírus 
 
em diferentes tecidos/órgãos das plantas para determinação do grau de 
infecção e para análise da expressão gênica (Gilbertson et al., 1991; Creissen 
et al., 1990); d) identificação de genes envolvidos na especialização do 
patógeno a determinado tecido; e) aumento da competividade de 
microrganismos inibidores de patógenos; f) obtenção de microrganismos 
transgênicos com capacidade de destruir ou de incapacitar patógenos; g) 
sistemas de seleção in planta através da expressão transiente de genes 
envolvidos na interação patógeno-hospedeiro. 
 
 
 
LITERATURA CITADA 
 
ANZAI, H; YONEYAMA, K. & YAMAGUCHI, I. 1989. Transgenic tobacco 
resistant to a bacterial disease by the detoxification of a pathogenic toxin. 
Mol. Gen. Genet. 219:492-4. 
ARAGÃO, F.J.L.; GROSSI - DE - SÁ, M.F.; DAVEY, M.R.; BRASILEIRO, 
A.C.M.; FARIA, J.C. & RECH, E.L. 1993. Factors influencing transient 
gene expression in bean (Phaseolus vulgaris L.) using an electrical 
particle acceleration devive. Plant Cell Rep. 12:483-90. 
ARMALEO, D.; YE, G.N.; KLEIN, T.M.; SHAH, K.B.; SANFORD, J.C. & 
JOHNSTON, S.A. 1990. Biolostic nuclear transformation of 
Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Curr. Genet. 17:98-103. 
ASSELIN, A. 1993. Quelques enzymes végétales à potentiel antimicrobien. 
Phytoprotection 74:3-18. 
BAKER, B.; COUPLAND, G.; FEDOROFF, N.; STARLENGER, P. & 
SCHELL, J. 1987. Phenotypic assay for excision of the maize controlling 
element Ac in tobacco. EMBO J. 6:1547-54. 
BEACHY, R.N.; LOESCH-FRIES, S. & TUMER, N.E. 1990. Coat protein-
mediated resistance against virus infection. Annu. Rev. Phytopathol. 
28:451-74. 
BEJARANO, E.R. & LICHTENSTEIN, C.P. 1992. Prospects for engineering 
virus resistance in plants with antisense RNA. Trends Biotechnol. 10:383-
8. 
BHAIRI, S.; FREVE, P.; YODER, O.C. & STAPLES, R.C. 1988. Detailed 
characterization of a genomic clone specifically expressed during 
differentiation of bean rust germilings. J. Cell Biochem. Suppl. 12C:276. 
BHOWMIK, T. & STEELE, J.L. 1993. Development of an electroporation 
procedure for gene disruption in Lactobacillus helveticus CNRZ 32. J. 
Gen. Microbiol. 139:1433-9. 
BIRCH, R.G & FRANKS, T. 1991. Development and optimization of 
microprojectile system for plant genetic transformation. Aust. J. Plant 
Physiol. 18:453-69. 
BLOWERS, A.D.; BOGORAD, L.; SHARK, K.B. & SANFORD, J.C. 1989. 
Studies on Chlamydomonas chloroplast transformation: foreign DNA can 
be stably maintained in the chromosome. Plant Cell 1:123-32. 
BOWER, R. & BIRCH, R.G. 1992. Transgenic sugarcane plants via 
microprojectile bombardment. Plant J. 2:409-16. 
BOYNTON, J.E.; GILHAN, N.W.; HARRIS, E.H.; HOSLER, J.P.; JOHNSON, 
A.M.; JONES, A.R.; RANDOLPH-ANDERSON, B.L; ROBERTSON, 
P.; KLEIN, T.M.; SHARK, K.B. & SANFORD, J.C. 1988. Chloroplast 
transformation of Chlamydom onas with high velocity microprojectiles. 
Science 240:1534-7. 
BROGLIE, K.; CHET, I.; HOLLIDAY, M.; CRESSMAN, R.; BIDDLE, P.; 
KNOWLTON, S.; MAUVAIS, C.J. & BROGLIE, R. 1991. Transgenic 
plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia 
solani. Science 254:1194-7 
BUNKERS, G.J. 1991 Expression of the Escherichia coli - glucuronidase 
gene in Pseudocercosporella herpotrichoides. Appl. Env. Microbiol. 
57:2896-900. 
BURLAND, T.G.; PALLOTA, D.; TARDIFF, M.C.; LEMIEUX, G. & 
DOVE, W.F. 1991. Fission yeast promoter-probe vectors based on 
hygromycin. Gene 100:241-5. 
CALVIN, N.M. & HANAWALT, P.C. 1988. High efficiency transformation 
of bacterial cells by electroporation. J. Bacteriol. 170:2796-801. 
CARR, J.P.; MARSH, L.E.; LOMONOSSOFF, G.P.; SEKIYA, M.E. & 
ZAITLIN, M. 1992. Resistance to tobacco mosaic virus induced by the 
54-KDa gene sequence requires expression of the 54-KDa protein. Mol. 
 
Plant-Microbe Interact. 5:397-404. 
CHAREST, P.J.; CALERO, N.; LACHANCE, D.; DATTLA, R.S.S.; 
DUCHESNE, L.C. & TSANG, E.W.T. 1993. Microprojectile-DNA 
delivery in conifer species: factors affecting assessment of transient gene 
expression using the -glucuronidase reporter gene. Plant Cell Rep. 
12:189-93. 
CHEE, P.P. & SLINGHTON, J.L. 1992. Transformation of cucumber tissue 
by microprojectile bombardment: identification of plants containing 
functional and non-functional transferred genes. Gene 118:255-60. 
CHRISTOU, P.; McCABE, D.E; MARTINELL, B.J. & SWAIN, W.F. 1990. 
Soybean genetic engineering - comercial production of transgenic plants. 
Trends Biotechnol. 8:145-51. 
CHRISTOU, P.; FORD, T.L. & KOFRON, M. 1991. Production of transgenic 
rice (Oryza sativa L.) plants from agronomically important indica and 
japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous 
DNA into immature zygotic embryos. Bio/Technology 9:957-62. 
CREISSEN, G.; SMITH, C.; FRANCIS, R.; REYNOLDS, H. & 
MULLINEAUX, P. 1990. Agrobacterium and microprojectile mediated 
viral DNA delivery into barley microspore-derived cultures. Plant Cell 
Rep. 8:680-3. 
CRUTE, I.R. & NORWOOD, J.M. 1986. Gene-dosage effects on the 
relationships between Bremia lactucae (downy mildew) and Lactuca 
sativa (lettuce): The relevance to a mechanistic understandillg of host-
parasite specificity. Physiol. Mol. Plant Pathol. 29:133-45. 
DANIELL, H.; KRISHNAN, M. & McFADDEN, B.F. 1991. Transient 
expression of -glucuronidase in different cellular compartments 
following biolistic delivery of foreign DNA into wheat leaves and calli. 
Plant Cell Rep. 9:615-9. 
DANIELL, H.; VIVEKANANDA, J.; NIELSEN, B.L.; YE, G.N.; TEWARI, 
K.K. & SANFORD, J.C. 1990. Transient foreign gene expression in 
chloroplast of cultured tobacco cells after biolistic delivery of chloroplast 
vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:88-92. 
DE WIT, P.J.G.M. 1992. Molecular characterization of gene-for-gene systems 
in plant-fungus interactions and the application of avirulence genes in 
control of plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 30:391-418. 
DEHESH, K.; BRUCE, W.B. & QUAIL, P.H. 1990. A transacting factor that 
binds to a GT-motif in a phytochrome gene promoter. Science 250:1397-9. 
DHIR, S.K.; DHIR, S.; HEPBURN, A. & WIDHOLM, J.M. 1991. Factors 
affecting transient gene expression in electroporated Glycine max 
protoplast. Plant Cell Rep. 10:106-10. 
DOERNER, P.W.; STERMER, B.; SCHMID, J.; DIXON, R.A. & LAMB, C.J. 
1990. Plant defense gene promoter and gene fusions in transgenic plants: 
tools for identification of novel inducers. Bio/Technology 8:845-8. 
DUCHESNE, L.C. & CHAREST, P.J. 1991. Transient expression of 
glucuronidase gene in embryogenic callusof Picea mariana following 
microprojection. Plant Cell Rep. 10:191-4. 
ELLIS, D.D.; McCABE, D.E.; McINNIS, S.; RAMACHANDRAN, R.; 
RUSSELL, D.R.; WALLACE, K.M.; MARTINELL, B.J.; RAFFA, K.F. 
& McCOWN, B.H. 1993. Stable transformation of Picea glauca by 
particle acceleration. Bio/Technology 11:84-9. 
ELLIS, J.G.; LAWRENCE, G.J.; PEACOCK, W.J. & PRYOR, A.J. 1988. 
Approaches to clone plant genes conferring resistance to fungal 
pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 26:245-63. 
FALKOW, S. 1988. Molecular Koch's postulates applied to microbial 
pathogenicity. Rev. Infec. Dis. 10:S274-S276. 
FINCHAM, J.R.S. 1989. Tranformation in fungi. Microbiol. Rev. 53:148-70. 
FINER, J.J. & McMULLEN, M.D. 1990. Transformation of cotton 
(Gossypium hirsutum L.) via particle bombardment. Plant Cell Rep. 
8:586-9. 
FINER, J.J. & McMULLEN, M.D. 1991. Transformation of soybean via 
particle bombardment of embryogenic suspension culture tissue. In Vitro 
Cell. Develop. Biol. 27:175-82. 
FINER, J.J.; VAIN, P.; JONES, M.W. & McMULLEN, M.D. 1992. 
Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells. 
Plant Cell Rep. 11:323-8. 
 
FITCH, M.M.M.; MANSHARDT, R.M.; GONSALVES, D.; SLIGHTOM, 
J.L. & SANFORD, J.C. 1992. Virus resistant papaya plants derived from 
tissues bombarded with the coat protein gene of papaya ringspot virus. 
Bio/Technology 10:1466-76. 
FOX, T.D.; SANFORD, J.C. & McMULLEN, T.W. 1988. Plasmids can 
stably transform yeast mitochondria lacking endogenous mt DNA. Proc. 
Natl. Acad. Sci. USA 85:7288-92. 
FRANCHE, C.; BOGUSZ, D.; SCHOPKE, C.; FAUQUET, C. & BEACHY 
R.N. 1991. Transient gene expression in cassava using high-velocity 
microprojectiles. Plant Mol. Biol. 17:493-8. 
FRANKS, T. & BIRCH, R. 1991. Gene transfer into intact sugarcane cells 
using microprojectile bombardment. Aust. J. Plant Physiol. 18:471-80. 
FRECH, G.C.; VANDONGEN, A.M.J.; SCHUSTER, G.; BROWN, A.M. & 
JOHO, R.H. 1989. A novel potassium channel with delayed rectifier 
properties isolated from rat brain by expression cloning. Nature 340:642-
5. 
FROMM, M.E.; MORRISH, F.; ARMSTRONG, C.; WILLIAMS, R; 
THOMAS, J. & KLEIN, T.M. 1990. Inheritance and expression of 
chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants. Bio/Technology 
8:833-9. 
GAMBLEY, R.L.; FORD, R. & SMITH, G.R. 1993. Microprojectile 
transformation of sugarcane meristems and regeneration of shoots 
expressing -glucuronidase. Plant Cell Rep. 12:343-6. 
GILBERTSON, R.L.; FARIA, J.C.; HANSON, S.F.; MORALES, F.J.; 
AHLQUIST, P.; MAXWELL, D.F. & RUSSELL, D.R. 1991. Cloning of 
the complete DNA genomes of four bean-infecting geminivirus and 
determining their infectivity by electric discharge particle acceleration. 
Phytopathology 81:980-5. 
GOFF, S.A.; KLEIN, T.M.; ROTH, B.A.; FROMM, M.E.; CONE, K.C., 
RADICELLA, J.P. & CHANDLER, V.L. 1990. Transactivation of 
anthocyanin biosynthetic genes following transfer of B regulatory genes 
into maize tissues. EMBO J. 9:2517-22. 
GORDON-KAMM, W.J.; SPENCER, T.M.; MANGANO, M.L.; ADAMS, 
T.R.; DAINER, R.J.; START, W.G.; O’BRIEN, J.V.; CHAMBERS, S.A.; 
ADAMS, W.R.; WILLETS, N.G.; RICE, T.B.; McKEY, C.J.; 
KRUEGER, R.W.; KAUSH, A.P. & LEMAUX, P.G. 1990. 
Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic 
plants. Plant Cell 6:603-18. 
HAIN, R.; BIESELER, B.; KINDL, H.; SCRODER, G. & STOCKER, R. 
1990. Expression of a stilbene synthase gene in Nicotiana tabacum 
results in synthesis of the phytoalexin resveratrol. Plant Mol. Biol. 
15:325-35. 
HARING, M.A. & DE BLACK, M. 1990. New roads towards chloroplast 
transformation in higher plantas. Physiol. Plant 79:218-20. 
HASHIBA, T.; HOMMA, Y.; HYKUMACHI, M. & MATSUDA, I. 1984. 
Isolation of a DNA plasmid in the fungus Rhizoctonia solani. J. Gen. 
Microbiol. 130:2067-70. 
IIDA, A.; SEKI, M.; KAMADA, M.; YAMADA, Y. & MORIKAWA, H. 
1990. Gene delivery into cultured plant cells by DNA-coated gold 
particles accelerated by a pneumatic particle gun. Theor. Appl. Genet. 
80:813-6. 
JAEGLE, M.; DEVIC, M.; LONGSTAFF, M. & BAULCOMBE, D. 1990. 
Cucumber mosaic virus satellite RNA (Y strain): analysis of sequences 
which affect mosaic symptoms on tobacco. J. Gen. Virol. 90:1905-12. 
JEFFERSON, R.A.; KAVANAGH, T.A. & BEVAN, M.V. 1987. Gus 
fusions: -glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in 
higher plants. EMBO J. 6:3901-7. 
JOHAL, G.S. & BRIGGS, S.P. 1992. The Hm 1 disease resistance gene in 
maize encodes a reductase activity. Science 258:985-7. 
JOHNSTON, S.A.; ANZIANNO, P.Q.; SHARK, K.; SANFORD, J.C. & 
BUTOWN, R.A. 1988. Mitochondrial transformation in yeast by 
bombardment with microprojectiles. Science 240:1534-41. 
KARTHA, K.K.; CHIBBAR, R.N.; GEORGES, F.; LEUNG, N.; CASWELL, 
K.; KENDALL, E. & QURESHI, J. 1989. Transient expression of 
chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene in barley c cultures and 
immature embryos through microprojectile bombardment. Plant Cell Rep. 
6:429-32. 
 
KEEN, N.T. 1990. Gene-for-gene complementarity in plant-pathogen 
interactions. Annu. Rev. Genet. 24:447-63. 
KIKKERT, J.R. 1993. The biolisticR PDS-1000/He device. Plant Cell, Tissue 
Organ Cult. 33:221-6. 
KIM, W.K.; McNABB, S.A. & KLASSEN, G.R. 1988. A linear plasmid in 
Tilletia controversa, a fungal pathogen of wheat. Can. J. Bot. 66:1098-
100. 
KLEE, H.; HORSCH, R. & ROGERS, S. 1987. Agrobacterium-mediated 
plant transformation and its further applications to plant biology. Annu. 
Rev. Plant Physiol. 38:467-87. 
KLEIN, T.M.; ARENTZEN, R.; LEWIS, P.A. & FITZPATRICK-
McELLIGOT, S.P. 1992. Transformation of microbes, plants and animals 
by particle bombardment. Bio/Technology 10:286-91. 
KLEIN, T.M.; FROMM, M.; WEISSINGER, A.; TOMES, D.; SCHAAF, S.; 
SLETTEN, M. & SANFORD, J.C. 1988a. Transfer of foreign genes into 
intact maize cells with high -velocity microprojectiles. Proc. Natl. Acad. 
Sci. USA. 85:4305-9. 
KLEIN, T.M.; GRADZIEL, T.; FROMM, M.E. & SANFORD, J.C. 1988b. 
Factors influencing gene delivery into Zea mays cells by high velocity 
microprojectiles. Bio/Technology 6:559-63. 
KLEIN, T.M.; HARPER, E.C.; SVAB, Z.; SANFORD, J.C.; FROMM, M.E. 
& MALIGA, P. 1988c. Stable genetic transformation of intact Nicotiana 
cells by the particle bombardment process. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 
85:8502-5. 
KLEIN, T.M.; WOLF, E.D.; WU, R. & SANFORD, J.C. 1987. High-velocity 
microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 
327:70-3. 
LEE, B.T.; MURDOCH, K.; TOPPING, J.; JONES, M.G.K. & KREIS, M. 
1991. Transient expression of foreign genes introduced into barley 
endosperm protoplasts by PEG-mediated transfer or into intact endosperm 
tissue by microprojectile bombardment. Plant Sci. 78:237-46. 
LEONG, S.A. 1988. Recombinant DNA research in phytopathogenic fungi. 
In: Ingram D.S. & William P.H. (Ed.). Advances in plant pathology. 
Genetics of plant pathogenic fungi. New York, Academic Press, v.6, p.1-
26. 
LONGEMANN, J.; JACH, G.;TOMMERUP, H.; MUNDY, J. & SCHELL, J. 
1992. Expression of a barley ribosome-inactivating protein leads to 
increased fungal protection in transgenic tobacco plants. Bio/Technology 
10:305-8. 
LORITO, M.; HAYES, C.K.; DIPIETRO, A. & HARMAN, G.E. 1993. 
Biolistic transformation of Tyichoderma harzianum and Gliocladium 
virens using plasmid and genomic DNA. Curr. Genet. 24:349-56. 
LUDWIG, S.R.; BOWER, B.; BEACH, L. & WESSLER, S.R. 1990. A 
regulatory gene as a novel visible marker for maize transformation. 
Science 247:449-50. 
MANIATIS, T.; GOODBOURN, S. & FISCHER, J.A. 1987. Regulation of 
inducible and tissue specific gene expression. Science 236:1237-45. 
McCABE, D. &