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ENFERMIDADES DE PLANTAS ASSOCIADAS A ORGANISMOS DO TIPO MICOPLASMA Elliot W. Kitajima Departamento de Biologia Celular, Universidade de Brasília, 70919-970 Brasília, DF, Brasil RESUMO É feita uma atualização sobre as enfermidades de plantas associadas a organismos do tipo micoplasma (OTMS) no Brasil. Discutem-se as metodologias tradicionais para determinar a associação dos OTMs com as enfermidades do tipo amarelo (sintomatologia e microscopia de luzleletrônica) e a introdução recente de métodos imunológicos e moleculares na detecção de OTMs no material infetado. Em particular, os métodos moleculares tem sido úteis não só na detecção e suas implicações na diagnose e epidemiologia, como também nas tentativas de se classificar este grupo de patógenos de plantas. SUMMARY PLANT DISEASES ASSOCIATED WITH MYCOPLASMALIKE ORGANISMS A brief review is made on the present status of the knowledge on the plant diseases associated with mycoplasmalike organisms (MLO) in Brazil. Comments are made on the traditional methods to associate MLOs with yellows type plant diseases by symptomatology and microscopy (light and electron), and the introduction of novel and more sensitive techniques as serology and DNA detection. It is emphasized, in particular, the use of molecular techniques to deal with MLOs' DNA for the detection of MLOs in infected samples, with consequences for diagnosis and epidemiology, and also serving for the attempts to classify this type of organism by genomic comparison. INTRODUÇÃO Já se passaram mais de um quarto de século, desde que o professor Y. Doi e seus colegas da Universidade de Tóquio publicaram os clássicos trabalhos, apresentando pela primeira vez, evidências morfológicas e de sensibilidade a antibióticos, de que muitas das enfermidades de plantas até então conhecidas como do “tipo amarelo” (“yellows”) e consideradas de etiologia viral, estariam associadas à presença de procariotas desprovidos de parede celular, similares a micoplasma (Doi et al., 1967; Ishie et al., 1967). Estes trabalhos pioneiros envolveram 4 enfermidades: superbrotamento do kiri, amarelo da rainha margarida, superbrotamento da batata e nanismo da amoreira. Por enfermidades do tipo amarelo entendem-se anomalias de plantas reconhecidas por um ou vários dos seguintes sintomas: clorose generalizada, encurtamento dos entrenós e proliferação lateral exagerada (sintomas do tipo envassouramento), folhas pequenas, flores aberrantes (esverdeadas ou com ramos no seu interior) (Figura 1). Vetores, quando conhecidos, eram cigarrinhas (exceto no caso do superbrotamento do kiri, cujo vetor é um percevejo). O agente circula no floema e é termosensível, transmitindo-se por enxertia ou pela Cuscuta, mas não mecanicamente. A lista inicial de 4 moléstias do tipo amarelo, associadas a organismos do tipo micoplasma (OTM), de Doi et al. foi rapidamente ampliada e, hoje, comporta várias centenas envolvendo quase 100 famílias, em todo o mundo (McCoy et al., 1989). Algumas delas tem sido bastante destrutivas como o amarelo letal do coqueiro no Caribe, o "spike disease" do sândalo na India, o “mal azul” e o “stolbur” do tomateiro, na Europa, e o “peach X disease” nos EUA. O caso do amarelo letal do coqueiro foi tão notório que mereceu urna reportagem na revista National Geographic Magazine (McCoy, 1988). Os corpúsculos pleomórfico originalmente detectados por Doi et al. (1967) em suas amostras, apareceram consistentemente nos vasos crivados de plantas com sintomas, com diâmetro variando de 0,2 a 1,0 (m. São providos por apenas uma membrana e contém ribossomas e fibras de DNA sendo essencialmente similares aos micoplasmas e aos acholeplasmas. Corpúsculos similares têm sido descritos também em vários órgãos de cigarrinhas vetoras virulíferas, mas, até hoje não se logrou cultivar tais corpúsculos in vitro (Lee & Davis, 1986). Não tendo sido possível completar o postulado de Koch, convencionou-se denominá-los como OTMS. Outra linha de evidência de que tais corpúsculos representariam o presumível patógeno resulta dos experimentos de sua sensibilidade a antibióticos do grupo tetraciclina, como inicialmente demonstrado por Ishie et al. (1967). A aplicação de tetraciclina pode induzir a remissão de sintomas e mesmo a cura, mas raramente tem sido usada como método de controle pelo seu custo, pelos problemas de efeito residual e pelas possibilidades de criar formas resistentes. Figura 1. Rainha margarida (Callistephus chinensis) com sintomas de clorose e de virescência nas flores. Existem vários artigos de revisão sobre OTMs (Niehaus & Sikora, 1979; Bové, 1984; Lee & Davis, 1986; Maramorosch & Raychaudhuri, 1981; McCoy et al., 1989; Maniloff et al., 1992, etc.). Assim, este artigo não visa fazer uma cobertura extensa sobre o assunto, mas fazer uma atualização da uma revisão feita em 1970 sobre este grupo de patógenos no Brasil (Kitajima & Costa, 1970a) e chamar atenção às aplicações de novas metodologias, em especial às moleculares, e suas perspectivas na detecção e taxonomia dos OTMS. ESTUDOS SOBRE OTMs NO BRASIL No Brasil, enfermidades do tipo amarelo já haviam sido descritas em mandioca (Silberschmidt & Campos, 1944), tomateiro (Costa, 1949) e Erigeron bonariensis (Costa, 1954), mas a primeira constatação da associação com organismo do tipo micoplasma foi feita com o cálice gigante do tomateiro (Kitajima & Costa, 1968), por microscopia eletrônica. Desde então, o número de enfermidades do tipo amarelo associadas a OTMs tem crescido constantemente e, hoje, há relatos em mais de 30 espécies, pertencentes a 15 famílias (Tabela 1). A maioria dessas enfermidades ocorre esporadicamente e, mesmo nas plantas cultivadas, raramente causam preocupações. Contudo, duas delas podem ser consideradas de importância econômica: o “irizado” do chuchuzeiro, no estado do Rio de Janeiro (tanto na zona serrana como na baixada fluminense) (Kitajima et al., 1981), e o superbrotamento do maracujazeiro (Kitajima et al., 1981; Lima No. et al., 1983). Ambas têm induzido perdas consideráveis e, em alguns casos, impedido o desenvolvimento destas culturas em certas regiões. Além disso, dada a continuidade territorial da América Central à América do Sul, existem possibilidades de o amarelecimento letal das palmeiras atingir o Brasil e vir a causar sérios danos às diversas culturas de palmáceas. MÉTODOS DE DETECÇÃO DOS OTMs MICROSCOPIA DE LUZ E ELETRÔNICA Desde os trabalhos iniciais de Doi et al. (1967), a associação de numerosas enfermidades com OTMs tem sido baseada essencialmente na detecção de corpúsculos pleomórficos, similares a bactérias, mas desprovidos de parede celular, nos vasos crivados das plantas afetadas, ao microscópio eletrônico de transmissão (Figura 2). Também os OTMs podem ser visualizados ao microscópio eletrônico de varredura, em tecidos fraturados, Tabela 1. Enfermidades de plantas associadas a organismos do tipo micoplasma descritas no Brasil Planta e sintomas Estado Referência Aizoaceae Espinafre de Nova Zelândia, Tetragonia expansa Kitajima & Costa, 1971a superbrotamento SP Amaranthaceae Crista-de-galo, Celosia sp. Kitajima, comunicação pessoal superbrotamento MG Apocynaceae Boa-noite, Catharanthus roseus Kitajima & Costa, 1979 superbrotamento, folhas pequenas SP, DF, PE, RN Kitajima, comunicação pessoal Oliveira et al., 1993 Asclepiadaceae Gomphocarpus sp. Kitajima & Costa, 1979 superbrotamento SP, DF Compositae Arnica-do-campo, Solidago microgiossa Kitajima& Costa, 1971a envassouramento SP, RJ Kitajima et al., 1984 Catinga-de-bode, Ageratum conyzoides, Kitajima et al., 1984 A. fastigiatum superbrotamento RJ, DF Erigeron bonariensis Kitajima & Costa, 1971a envassouramento SP Margaridinha, Crystanthemum parthenium Kitajima & Costa, 1975 virescência DF Picão, Bidens pilosa Vega et al., 1981 superbrotamento PR, SP Kitajima, comunicação pessoal Rainha margarida, Callistephus chinensis Kitajima & Costa, 1979 virescência Sempre-viva, Helychrisia bracteatum Kitajima & Carvalho, 1992 superbrotamento MG Convulvulaceae Batata-doce, Ipomea batata Kitajima, 1988 superbrotamento DF Cucurbitaceae Aboboreira, Cucurbita pepo Kitajima et al., 1984 superbrotamento RJ Chuchuzeiro, Sechium edulis Kitajima et al., 1981 irizado, superbrotamento RJ, PE, ES Costa et al., 1983 Melão-de-S.Caetano, Momordica charanta superbrotamento RJ Ebenaceae Caquizeiro, Diospirus caki Matsuoka & Carvalho, 1987 Declínio MG Eupborbiaceae Mandioca, Manihot esculenta Kitajima & Costa, 1971b superbrotamento SP, DF, PE, CE Mariano et al., 1991 antólise BA Gramineae Milho, Zea mays enfezarnento vermelho SP, PR Kitajima & Costa, 1970 Leguminosae Centrosema brasilianum Kitajima et al., 1987, 1991 superbrotamento DF, MS Crotalária, Crotalaria juncea, C. paulinea Kitajima & Costa, 1975 superbrotamento SP Desmodium intortum Porto et al., 1979 envassouramento RS Desmodium leiocarpum, D. pabulare Chagas & Oliveira, 1986a superbrotamento SP Continuação Tabela 1 Planta e sintomas Estado Referência Fedegoso, Cassia occidentalis Kitajima & Costa, 1971a envassouramento SP Feijoeiro, Phaseolus vulgaris Kitajima et al., 1979 superbrotamento DF Soja, Glycine max Kitajima & Costa, 1979 superbrotamento SP Malvaceae Guanxuma, Sido cordifolia Kitajima & Costa, 1971a envassouramento SP Mimo-de-Venus, Hibiscus rosa sinensis Vicente et al., 1974 superbrotamento SP, RJ Kitajima et al., 1984 Passifloraceae Maracujazeiro, Passiflora edulis f. flavicarpa Kitajima et al., 1981 superbrotamento PE, RJ, SP, PR, MG Lima No. et al., 1983 Chagas & Oliveira, 1986b Costa et al., 1993 Solanaceae Aegiphila sp. SP Chagas et al., 1985 Berinjela, Solanum melongena cálice gigante SP, DF Boiteux et al., 1992 Fruta-do-lobo, Solanum lycocarpum superbrotamento SP Chagas et al., 1985 Tomateiro, Lycopersicon esculentum cálice gigante SP Kitajima & Costa, 1968 Sterculiaceae Douradinho-do-campo, Waltheria indica Kitajima & Costa, 1971a envassouramento SP Tiliaceae Guaxima, Triumpheta bartramia Kitajima & Costa, 1971a envassouramento SP Figura 1. Micrografia eletrônica de seção ultrafina da região vascular de folha de douradinho-do-campo (Waltheria indica) com sintomas de superbrotamento. Observar no lumen dos vasos crivados (VC) grande número de corpúsculos do tipo micoplasma. pc - placa crivada. expondo a região vascular (Petzold et al., 1977; Haggis & Sinha, 1978; Kitajima et al., 1993) (Figura 3). Os OTMs dificilmente são visualizados ao microscópio de luz, mas é possível detectá-los usando métodos de coloração de ác. nucleico (Deeley et al., 1979; Cousin & Jouy, 1984; Douglas, 1986; Hiruki, 1988; Overman et al., 1992). Os OTMs acumulados nos vasos crivados podem ser identificados pelo seu DNA, já que em vasos crivados de plantas sadias não ocorrem estruturas contendo DNA. Contudo, além de requerer equipamentos caros, o preparo e o exame de amostras para microscopia eletrônica, tanto de transmissão como de varredura, representam processos que consomem muito tempo. As técnicas de microscopia de luz são mais rápidas e econômicas, mas, dada a distribuição desuniforme dos OTMs na planta infetada, os resultados não são confiáveis. No Brasil, todos os trabalhos que levaram à associação de OTMs com plantas exibindo sintomas do tipo superbrotamento, virescência, folhas pequenas e cloróticas, etc. (Tabela 1) foram feitos através de microscopia eletrônica de transmissão, não havendo relatos de uso do microscópio de luz para tal finalidade. MÉTODOS IMUNOLÓGICOS Apesar de inúmeras tentativas, os OTMs não puderam ser cultivados até hoje. Existem algumas publicações esparsas, contudo nunca puderam ser confirmadas. Como menciona Maramorosch (1973), um microrganismo só é aceito como tendo sido cultivado quando a cultura pura é depositada em uma coleção reconhecida como o da American Type Culture Collection (ATCC). Assim, a priori, o uso de métodos imunológicos ou moleculares pareceriam ser problemáticos. Contudo, tem sido possível produzir preparações razoavelmente purificadas de alguns OTMS, a partir das quais produziram-se anticorpos policlonais, utilizáveis em testes como ELISA, Dot-ELISA ou “tissue blot”, após absorção apropriada com proteínas normais (Sinha & Chiykowski, 1984; Kirkpatrick & Garrot, 1984; Lin et al., 1990). Outra estratégia utilizada tem sido a produção de anticorpos monoclonais, também com resultados satisfatórios (Lin & Chen, 1985; Chen & Jiang, 1988; Schwartz et al., 1989; Hsu et al., 1990; Fos et al., 1992; Shen & Lin, 1993). No Brasil, não há informações de produção de anticorpos, mono ou policlonais, contra OTMS, ou seu uso na detecção dos OTMS. Na Argentina, há informações de que o grupo do Instituto de Fitopatologia e Fisiologia Vegetal, do INTA/Córdoba, produziu anticorpo policlonal contra o OTM associado ao superbrotamento do cinamomo (Conci, L.R., comunicação pessoal). Figura 3. Micrografia eletrônica de varredura de um vaso crivado exposto por fratura da região vascular da folha de boa noite (Catharanthus roseus). Corpúsculos esferoidais ou alongados, muitas vezes encadeados, podem ser vistas no lumen do vaso. O material fibrilar também presente (seta) provavelmente é a proteína P. MÉTODOS MOLECULARES A partir da metade da década dos 80, com os trabalhos pioneiros de Davis et al. (1988), no Molecular Plant Pathology Laboratory, do USDA, foram introduzidas técnicas moleculares na detecção dos OTMS. A metodologia utilizada foi basicamente a de extrair DNA de plantas infectadas com OTMS, cortá-los em fragmentos com enzimas de restrição, ligá-los a plasmídeos adequados, igualmente tratados com as mesmas endonucleases, e utilizar estes plasmídeos para transformar Escherichia coli. O rendimento de DNAs do OTM foi melhorado, usando uma técnica que permitia o isolamento dos vasos do floema (Lee & Davis, 1983). Selecionaram-se, a seguir, pedaços de DNAs clonados e marcados (radiativamente ou não), que hibridizavam apenas com DNAs de plantas infetadas, e que serviram como sondas em teste de “dot-hybridízation”. Foi desenvolvido um protocolo para extrair DNAs de tecido infectado e aplicá-los em membrana de nitrocelulose onde se processa o ensaio de hibridização. Os trabalhos iniciais foram feitos com OTMs associados ao “aster yellows” e ao “elm yellows”, produzindo-se sondas específicas para cada um destes OTMs (Davis et al., 1988). Uma aplicação ampla deste sistema permitiu identificar cerca de 10 conjuntos distintos, referidos por Davis como “clusters”, tendo-se desenvolvido sondas que são “cluster” -específicos, ou que abrangem certo número de “clusters”. P.ex., DNAs extraídos de algumas amostras de plantas afetadas por enfermidades do tipo amarelo encontradas no Brasil, testados com sondas preparadas para detectar “aster yellows” (AY) e “elm yellows” (EY), respectivamente, hibridizaram com sondas para AY, masnão para EY (Davis et al., 1989), Podem-se refinar os estudos com os DNAs clonados, estudando-se seu polimorfismo linear, após digestão com endonucleases e eletroforese. Mäurer et al. (1993) e Lee et al. (1993b), p.ex., determinaram o relacionamento genético entre OTMs infectando freixo (Fraxinus sp.), álamo (Alnus spp.) e olmo (Ulmus spp.) nos continentes americano e europeu, através desta metodologia. Similar trabalho foi feito por Deng & Hiruki (1991), comparando os OTMs do “clover phyllody”, do “clover proliferation”, do AY e do “hydrangea virescence”. Já Kuske & Kirkpatrick (1992) investigaram a distribuição de uma estirpe do OTM do AY numa planta de Catharanthus roseus infectada, enquanto Chen et al. (1992a,b) observaram variações sazonais na ocorrência de OTMs em nogueiras, através da hibridização do DNA extraído com sondas adequadas, mostrando outros tipos de aplicações das sondas. Para o amarelecimento letal das palmeiras, uma ameaça para a sua cultura no Brasil, já existem sondas de DNA disponíveis, graças aos trabalhos de Harrison et al. (1992). Contudo, outra estratégia de detecção de DNA de OTMs tem sido utilizada recentemente. Baseia-se na amplificação, através da técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) de cerca de 80 % da seqüência do rDNA 16S, usando “primers” adequados e, a seguir, analisando o polimorfismo linear desta seqüência através da digestão da seqüência “pescada” e amplificada, com diferentes endonucleases (Ahrens & Seemüller, 1992; Lee & Davis, 1993; Davis & Lee, 1993; Firrao et al., 1993). A produção de “primers” adequados foi possível após ter sido conhecida a seqüência do rDNA 16S de micoplasmas (Lim & Sears, 1989). Incidentalmente, este trabalho de Lim & Sears (1989), comparando seqüências de rDNAs 16S, mostrou que os micoplasmas animais e os OTMs de plantas seriam evolucionariamente diferentes. Um trabalho extenso usando 40 amostras de DNAs de OTMs procedentes da América do Norte, da Europa e da Ásia, mostrou que os diferentes OTMs poderiam ser agrupados, sendo que essencialmente os grupos determinados coincidiam com os “clusters” discriminados pelo uso de sondas, obtidas aleatoriamente dos DNAs de diferentes OTMs (Lee et al., 1993a). A separação dos grupos foi feita através do “coeficiente de similaridade” (F), comparando-se os números de fragmentos produzidos pelos DNAs de 2 amostras diferentes, quando submetidos à digestão com 15 endonucleases distintas. Pode-se, ainda, se necessário, determinar a identidade de algumas destas bandas, usando-se sondas apropriadas, após Southem blotting (ver esquema geral da detecção de DNA de OTMs na Figura 4). O par de “primer” desenvolvido (designados por Davis de F2/R2) permitiu a “pescagem” do rDNA 16S de todas as amostras até agora testadas (Lee & Davis, 1993a). Os grupos até agora reconhecidos acham-se indicados na Figura 5. Trabalhos preliminares feitos com amostras de OTMs procedentes de diferentes partes do Brasil, encontradas em diferentes plantas e analisadas pelo método da amplificação com PCR, e a análise do polimorfismo linear sugerem que todas as 5 amostras, sem exceção, poderiam ser incluídas no grupo do “X-disease”, possivelmente formando um novo subgrupo, além do “western X disease” e do “clover yellow edge” (Davis, R.E., comunicação pessoal). O resultado é surpreendente e aguarda confirmações. Esta técnica também tem permitido revelar que infecções simultâneas por 2 ou mais OTMs numa mesma planta não são raras, e que síndromes similares podem ser causadas por OTMs distintos. P.ex., a enfermidade de videira conhecida como “flavescence dorée” estaria associada a diferentes OTMs como EY, AY e do grupo do X-disease, às vezes, ocorrendo simultaneamente. Como cada um dos componentes da mistura pode reagir de maneira diferente às condições ambientais, eles podem variar quanto à sua concentração em diferentes estações do ano, refletindo-se isto na sintomatologia e nos resultados dos testes de detecção (Davis, R.E., comunicação pessoal). A amplificação de DNA do OTM pela técnica do PCR é suficientemente sensível para detectar este organismo em insetos, vetores ou não (Vega et al., 1993), podendo, Figura 4. Detecção e identificação de organismos tipo micoplasmas (OTMs) através de seu DNA. Figura 5. Dendograma de análise de “cluster” baseado em coeficiente de similaridade, e obtida pela análise do RFLP (polimorfismo linear de fragmentos de enzimas de restrição) de rDNA de 40 organismos do tipo micoplasma (OTMs). A escala refere-se ao índice de similaridade. MIAY-Michigan aster yellows; AY1-Maryland aster yellows; DAY-dwarf aster yellows; SAY2-severe aster yellows; TLAY2-Tulelake aster yellows 2; OKAY- Oklahoma aster yellows 1; CY2-chrysantemum yellows; NYAY-N.York aster yellows; SL5-periwinkle yellows; HyPh1-Hydrangea phyllody; IObW1-Ipomoea obscurra witches’ broom; PaWB-Paulownia witches’ broom; BB-tomato big bud; OKAY2- Oklahoma aster yellows 2; AY27-Alberta strain of aster yellows; CN13-periwinkle little leaf; CN1-periwinkle little leaf; NJAY-New Jersey aster yellows; NAY-Eastern strain aster yellows; SL1-periwinkle yellows; BBS1-blueberry stunt; CPh-clover phyllody; PnWB-peanut witches’ broom; RBCWB-red bird cactus witches’ broom; UD1-undesignated MLO; CX-Canada peach X; WX-western X-disease; CYE-clover yellow edge; LY3-palm lethal yellowing; EY2-elm yellow 2; EYIta-clover yellow edge; CP-clover proliferation; SPWB-sweet potato witches’ broom; VR-beet leafhopper transmitted virescence agent; AshY-ash yellows; LfWB-Luffa witches’ broom; PPWB-pigeon pea witches’ broom. Do artigo de Lee et al. (1993a); copyright de Phytopathology. assim, oferecer dados importantes à epidemiologia dos OTMS. Atualmente, procura-se obter pares de “primers” específicos, se possível para cada “cluster” ou para grupos de “clusters” (designados de “multiplex”) facilitando a detecção individual dos diferentes OTMs e usando o método da amplificação de seus DNAs com PCR (Davis, R.E., comunicação pessoal). COMENTÁRIOS FINAIS Estas técnicas moleculares, usando sondas específicas e/ou a amplificação pelo uso de PCR, estão sendo implantadas na Universidade de Brasília, como conseqüência de um curso intensivo ministrado pelo Dr. Robert E. Davis, do Plant Molecular Pathology Laboratory, do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA), de Beltsville, Maryland, em fevereiro de 1994. Espera-se que a divulgação destas metodologias, acompanhada de treinamentos adequados, permita a intensificação do estudo de OTMs no Brasil, contribuindo p.ex., para a melhor indexação de plantas propagadas vegetativamente, em especial de fruteiras de clima temperado e de videiras. Deve-se lembrar, contudo, que outro aspecto da pesquisa com OTMs inteiramente negligenciado no Brasil refere-se ao estudo dos vetores, o qual também poderá vir a ser beneficiada com estas modernas técnicas de detecção. LITERATURA CITADA AHRENS, U. & SEEMLLER, E. 1992. Detection of DNA of plant pathogenic mycoplasma-like organisms by a polymerase chain reaction that amplifies a sequence of the 16S RRNA gene. Phytopathology 82:828-32. BOITEUX, L.S. & KITAJIMA, E.W. 1992. Superbrotamento da berinjela associada a organismos do tipo micoplasma no Distrito Federal. Fitopatol. Bras. 17:196 (res.). BOV, J.M. 1984. Wall-less prokaryotes of plants. Annu. Rev. Phytopathol. 22:361-96. 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