Replicação de DNA

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REPLICAÇÃO DE DNA
MAPA DO CROMOSSOMA DE E.coli
TERMINOLOGIA
Regras básicas para a designação de genes e proteínas:
Genes bacterianos – 3 letras minúsculas em itálico que reflectem
a sua função aparente
Ex: dna (replicação do DNA), uvr (resistência à lesão por 
radiação UV), rec (recombinação)
Quando vários genes afectam o mesmo processo, acrescenta-se 
as letras A, B, C, etc, que reflectem a ordem de descoberta.
Proteínas bacterianas – geralmente a mesma designação do gene 
que as codifica; 3 letras não-itálicas, a 1ª maiúscula
Ex: DnaA, RecA
Conceito de Molde
Watson e Crick:
uma cadeia é o 
complemento da outra
REGRAS BÁSICAS PARA 
A REPLICAÇÃO DO DNA
EXPERIÊNCIA DE MESELSON - STAHL
Questões levantadas:
” As cadeias parentais desenrolam-se 
completamente antes da replicação?
” O início da replicação é aleatório ou não?
” Após o início da replicação num 
determinado ponto, a replicação prossegue 
numa direcção ou em ambas?
REPLICAÇÃO DO DNA
Regiões 
ricas em 
pares A = T
INÍCIO DA REPLICAÇÃO
¾A replicação inicia-se nas ORIGENS DE 
REPLICAÇÃO, que são sequências 
específicas muito ricas em pares A=T
E.coli - 1 origem de replicação
Eucariotas - múltiplas origens de replicação 
localizadas ao longo do cromossoma
¾REPLICÃO - unidade de replicação
porção de DNA que sofre um processo 
individual de replicação
QUAL O SENTIDO DA REPLICAÇÃO?
DEFINIÇÃO DAS CADEIAS DE DNA 
NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
A síntese de DNA dá-se na direcção 5’→ 3’
e é semi-descontínua
A REPLICAÇÃO É SEMI-DESCONTÍNUA
CONTÍNUA
DESCONTÍNUA
Fragmentos de Okazaki : 
Eucariotas: 100-200 nucleótidos
E. coli : 1000-2000 nucleótidos
POLIMERIZAÇÃO DE NUCLEÓTIDOS
FORMAÇÃO DA LIGAÇÃO FOSFODIÉSTER
(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi
Mg2+
Polimerase
Enzima de 3 substratos:
¾ cadeia de DNA que é copiada
¾ cadeia neo-sintetizada ou cadeia em crescimento
¾ 2’-desoxirribonucleótido-5’-trifosfato incorporado
ELONGAÇÃO DA CADEIA DE DNA
PROPRIEDADES DAS DNA POLIMERASES
¾ ACTIVIDADE POLIMERÁSICA 5’→ 3’
¾ NECESSIDADE DE UM MOLDE
A cadeia molde complementar é copiada no sentido 3’→ 5’
¾ NECESSIDADE DE UM PRIMER
¾ ACTIVIDADE EXONUCLEÁSICA 3’→ 5’ E 5’→ 3’
¾ PROCESSIVIDADE 
Número de nucleótidos adicionados antes que a enzima se 
dissocie do molde. Esta propriedade pode ser potenciada por 
proteínas associadas.
FIDELIDADE DA REPLICAÇÃO
¾ COMPLEMENTARIDADE DE BASES
Geometria das bases
Formas tautoméricas das bases
¾ ACTIVIDADE CORRECTORA DAS
DNA POLIMERASES
Actividade exonucleásica 3’→ 5’
A GEOMETRIA DAS BASES CONTRIBUI
PARA A FIDELIDADE DA REPLICAÇÃO
FORMAS TAUTOMÉRICAS DO URACILO
CORRECÇÃO DE ERROS
PELA ACTIVIDADE 3’→5’
EXONUCLEÁSICA DA
DNA POLIMERASE I
DNA polimerase I não é a responsável pela 
replicação do cromossoma de E.coli:
Œ Velocidade de polimerização demasiado baixa
ΠProcessividade baixa
Œ Estudos genéticos demonstraram que a DNA 
polimerase I não actua sòzinha
ΠEm 1969 John Cairns isolou uma estirpe que 
produzia uma DNA polimerase I inactiva
DNA polimerases IV e V identificadas em 1999
Envolvidas numa forma específica de reparação de DNA
FRAGMENTO KLENOW DA DNA POLIMERASE I
ANÁLISE POR DIFRACÇÃO DE RAIOS-X
Fragmento KlenowFrag. pequeno
N C
Tripsina
5’→ 3’
exonuclease
3’→ 5’
exonuclease Polimerase
MODELO PARA A ESTRUTURA DO COMPLEXO
DNA POLIMERASE I – DNA
DNA POLIMERASE III
¾ Enzima responsável pela replicação de DNA 
em E.coli
¾ In vivo Pol III é uma holo-enzima constituída 
por, pelo menos, 10 sub-unidades:
ƒ α, ε e θ formam o núcleo da enzima
ƒ τ liga dois núcleos da polimerase
ƒ γ2δδ’χψ associam-se para formar um 
complexo que posiciona o anel (β2)
ƒ β dimeriza para formar um anel em torno do 
molde de DNA
A sub-unidade β da DNA Polimerase III forma uma
estrutura em anel à volta do DNA 
e é responsável pela sua elevada
processividade (> 500.000 nucleótidos) 
REPLICAÇÃO EM E.coli
Replissoma - complexo de enzimas e proteínas 
necessários para a replicação
¾ Polimerases
¾ Helicases
¾ Topo-isomerases
¾ Proteínas de ligação ao DNA (DNA binding proteins)
¾ Primases
¾ Ligases
ETAPAS DA REPLICAÇÃO
1. ETAPA DE INICIAÇÃO (controlo da replicação)
• Reconhecimento das origens de replicação por um 
complexo proteico
• Abertura localizada da dupla cadeia de DNA pela 
DNA helicase
• Síntese do primer
2. ETAPA DE ELONGAÇÃO
• Síntese contínua na cadeia leading
• Síntese descontínua na cadeia lagging
3. ETAPA DE TERMINAÇÃO
• Reconhecimento de sequências, sobre as quais se 
fixam proteínas, bloqueando o movimento de 
progressão da forquilha de replicação
REPLICAÇÃO EM E.coli
INICIAÇÃO
1. Reconhecimento de sequências na 
origem da replicação por uma única 
proteína que se fixa sobre estas mesmas 
sequências
2. Abertura da dupla cadeia de DNA a nível 
da região rica em pares A=T, junto ou no 
seio da origem de replicação
3. Organização do complexo de replicação
na região aberta do DNA
oriC
ORIGEM DE REPLICAÇÃO EM E.coli
ARRANJO DAS SEQUÊNCIAS CONSERVADAS
REPLICAÇÃO EM E.coli
INICIAÇÃO
COMPLEXO DE INICIAÇÃO
ORISSOMA
¾ Conjunto de proteínas que intervêm na 
etapa de iniciação
¾ Algumas proteínas ligam-se ao DNA, 
especificamente (DnaA)
¾ Outras participam no orissoma através 
do reconhecimento de proteínas já
presentes (DnaB)
MODELO PARA 
INICIAÇÃO
DA REPLICAÇÃO 
NA ORIGEM
DE E.coli, oriC
CONTROLO DA ETAPA DE INICIAÇÃO
¾ Permitir que a iniciação se faça no momento 
adequado do ciclo de divisão
¾ Impedir que o cromossoma se replique mais 
do que uma vez por cada ciclo
ªMecanismo de sequestração
Metilação de OriC, nas sequências GATC, pela DNA-
adenina-metiltransferase (Dam-metilase)
Após replicação, o DNA semi-metilado liga-se à
membrana bacteriana, ficando as origens de 
replicação inacessíveis
METILAÇÃO DO DNA E
INICIAÇÃO DA REPLICAÇÃO
REPLICAÇÃO EM E.coli
REGULAÇÃO DA INICIAÇÃO
REPLICAÇÃO EM E.coli
ELONGAÇÃO
¾ Síntese contínua da cadeia leading
¾ Síntese descontínua da cadeia lagging em 
fragmentos de Okazaki
ª Coordenação da síntese das duas cadeias:
- Ambas as cadeias são sintetizadas por 
uma única DNA polimerase assimétrica
- O looping do DNA da cadeia lagging junta 
os dois pontos de polimerização 
SÍNTESE DOS FRAGMENTOS DE OKAZAKI
SÍNTESE SEMI-DESCONTÍNUA DO DNA
PROBLEMA PRINCIPAL
SÍNTESE DE DNA NAS CADEIAS LEADING E LAGGING
CADEIA LAGGING - REMOÇÃO DE RNA PRIMER
E SUBSTITUIÇÃO POR DNA
NICK TRANSLATION
ACTIVIDADES
5’→3’ EXONUCLEÁSICA 
E
POLIMERÁSICA 
DA
DNA POLIMERASE I
MECANISMO DA REACÇÃO DE LIGAÇÃO DO DNA
REPLICAÇÃO EM E.coli
TERMINAÇÃO
REPLICAÇÃO EM E.coli
TERMINAÇÃO
REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS
¾ A replicação é um acontecimento 
muito mais raro nos eucariotas do 
que nos procariotas. A iniciação da 
replicação é fortemente regulada
¾ O DNA não se encontra nu na célula, 
mas sob a forma de cromatina. Esta 
encontra-se organizada sob a forma 
de nucleossomas. Nível superior de 
organização implica complexidade 
maior para a replicação
CONTROLO DA REPLICAÇÃO PELO CICLO CELULAR
¾ A síntese de DNA tem início, em muitas origens diferentes, 
durante a fase S
¾ A replicação produz uma única cópia de cada molécula. 
Bloqueio da iniciação da replicação até ao próximo ciclo
celular
¾ A replicação do genoma inteiro deve estar concluída antes da
passagem à fase G2
DNA POLIMERASES EUCARIÓTICAS
¾ α - 4 sub-unidades: 180 kDa (actividade 
polimerásica), 60 kDa + 50kDa (actividade primase) e 
72 kDa (?). Fracamente processiva, sem actividade 
exonucleásica 3’→ 5’
¾ δ - 2sub-unidades: 125 kDa (actividade polimerásica
e exonucleásica 3’→ 5’) e 50 kDa (?). Moderadamente 
processiva quando só; elevada processividade
quando associada ao PCNA (Proliferating Cell
Nuclear Antigen)
¾ ε - enzima multimérico: 256-258 kDa (actividade 
polimerásica e exonucleásica 3’ → 5’); o nº de outras 
sub-unidades varia em função da espécie; elevada 
processividade na ausência de PCNA
DNA POLIMERASES EUCARIÓTICAS
¾ γ - Actividade polimerásica e exonucleásica 3’ → 5’. 
Responsável pela replicação do DNA mitocondrial, 
processo autónomo sob o ponto de vista cronológico 
e enzimático
¾ β - enzima monomérico (40 kDa); pouco processiva e 
sem actividade exonucleásica 3’ → 5’. Não parece ter 
papel na replicação mas intervém nos processos de 
reparação por excisão de bases erradas 
HOMOTRÍMERO DE PCNA 
ESTRUTURA
Notar a semelhança desta estrutura com
com o dímero β2 da DNA Polimerase III de E.coli
REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS
INICIAÇÃO
¾ A replicação inicia-se em múltiplas origens.
Porquê?
O movimento da forquilha de replicação é ~20x mais lento 
nos eucariotas do que nos procariotas (50 nt/seg). A esta 
velocidade a replicação de um cromossoma humano de 
tamanho médio levaria 500 horas
¾ As origens de replicação ou sequências de 
replicação autónoma (Autonomously Replicating
Sequence ou ARS) foram identificadas e 
estudadas na levedura. Existem cerca de 400 
ARS no genoma da levedura
CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS ARS
¾ Identificaram-se 400 ARS no genoma da levedura. A 
maioria, mas não a totalidade, constitui origens de 
replicação
¾ As origens encontram-se espaçadas a intervalos 
irregulares ao longo do cromossoma. O intervalo 
médio é cerca de 40 kb
¾ As ARS são constituídas por sequências 
conservadas: 5’ (A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(T/A) 3’
¾ O complexo de reconhecimento da origem (ORC), 
constituído por pelo menos 6 polipéptidos, liga-se 
àquelas sequências conservadas
¾ A ligação de ORC induz modificação conformacional
no DNA, necessária para a replicação e transcrição
MECANISMO DE REPLICAÇÃO NOS EUCARIOTAS
PCNA
RFC
RPA
Helicase
Primase
RNase H
DNA ligase
Pol δ
Pol α
Pol δ
= SSB
(remove RNA primers)
• Pol α / primase - síntese de 
RNA-DNA primers para
iniciação da replicação; 
baixa processividade
• Pol δ / PCNA - funções
complexas na replicação de 
ambas as cadeias; elevada
processividade
REPLICAÇÃO DE DNA LINEAR
+
5’ 3’
3’ 5’
Síntese da cadeia leading
5’ 3’
3’ 5’
RNA 
primer
Síntese da cadeia lagging
3’ 5’
5’ 3’
Replicação
+
5’ 3’
Cadeia filha completa
5’ 3’
Cadeia filha incompleta
3’ 5’
Remoção do
RNA primer
REPLICAÇÃO NOS TELÓMEROS
As extremidades dos cromossomas são estabilizadas pelos telómeros, 
requerendo uma transcriptase reversa para a sua replicação
Os telómeros humanos consistem em 1000-1500 cópias de TxGy
OUTRAS PROTEÍNAS 
IMPLICADAS NA REPLICAÇÃO
¾ PROTEÍNAS COM ACTIVIDADE ENZIMÁTICA
Topo-isomerase tipo I
Topo-isomerase tipo II
RNase H
3 DNA ligases
DNA helicase
¾ PROTEÍNAS COM PAPEL ESTRUTURAL
PCNA
RFC 
RPA
¾ PROTEÍNAS MODULADORAS