Questões da prova Controle Microbiológico

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Questões P1 Controle Microbiológico
1-Quais são as pricipais fontes de contaminação da água? Ou a origem dos microorganismos que contaminam os alimentos?
Solo, Plantas, Utensílios, Trato Gastro Intestinal do homem e dos animais, Manipuladores, Ração animal (consumida tanto pelos animais diretamente, quanto indiretamente pelo ser humano), Produtos dos animais (leite, carne), Ar e pó.
2- Quais os grupos considerados de risco?
Crianças de até 2 anos, idosos, imunocomprometidos ou imunodeprimidos (pessoas doentes), grávidas, recém-transplantados, fetos e neonatos.
3- Classificação dos seres vivos:
Reino, Filo, Classe, Ordem, Família, Gênero, Espécie.
Ex: Lactobacillus casei shirota
 Gênero espécie subespécie
Se não soubermos a espécie utiliza-se: Lactobacillus sp.
Se forem mais de 1 espécie usa-se : Lactobacillus spp.
4- Como são produzidas as aminas biogênicas? Deem exemplos.
 Através da descarboxilação do aminoácido produzidas por determinados microorganismos. Exemplos : Putrescina, cadaverina, histamina, tiramina.
 As bactérias produtoras do ácido láctico (Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Enterococcus e Pediococcus) tem um gene capaz de codificar a enzima descarboxilase que promove a descarboxilação do aminoácido produzindo assim as aminas biogênicas. 
 Podem estar presentes no vinho, iogurte, leite, produtos cárneos, sucos de fruta, cerveja, chocolate, café, queijo e etc.
5-Fenômeno do Networking bacteriano ou quorum sense:
 Mecanismo molecular do microorganismo que quando em determinado local exsuda algumas substâncias que influenciam ou produzem efeito na outra bactéria, inibindo ou estimulando o crescimento.
6- Principal grupo de microorganismos que causa DTA: Vírus
 Os principais vírus são: Norovírus, Rotavírus, Vírus que pode causar hepatite A e Vírus causador da hepatite E.
7- Principal forma de contaminação de vírus em alimentos ou por qual via o vírus alcança os alimentos?
Através de manipuladores de alimentos (principal) ou solo. Via fecal-oral.
8- Dê exemplos de membros da família Enterobacteriaceae.
 Escherichia coli, Salmonella, Protheus, Shigella, Klebsiella.
9- Descreva passo a passo um método utilizado para análise de alimentos.
- pulverizar álcool 70% no alimento e esperar evaporar, além de cortar e pesar a amostra desejada.
- homogeneizar o alimento.
- retirar uma alíquota do alimento homogeneizado. 
- colocar em 9 partes do diluente no erlenmeyer.
 Ex: 1g de alimento / 9 mL de diluente.
 Padrão no laboratório= 25g de alimento/ 225 mL de diluente.
- Lembrando que o diluente mais indicado é a água peptonada (0,1% peptonada).
 Água destilada + Peptona extraída da carne purificada (em pó).
 1 litro de água destilada misturada 1 g de peptona em pó.
- Depois fazer diluições seriadas com o objetivo de separar as UFC’s para que se possa estabelecer a contagem.
-Após diluí-la até 10 -4, plaqueia -se em determinado meio de cultura, e em seguida usa-se uma alça bacteriológica para riscá-la.
10- Dê um exemplo de uma diluição seriada até uma diluição de 10-4. Calcule quantas bactérias crescem a 77 ° C tomando como parâmetro a diluição de 10-4 e sabendo que foram encontradas 8 UFC’s. 
 25g de alimento 1 mL 1mL 1 mL
 225 mL de diluente 9 mL 9 mL 9 mL
Diluições 10-1 10-2 10-3 10-4 
Cálculo: 8X 10 elevado a 4 UFC´s.
11- Relacione gênero e espécie com a micotoxina que o produz.
Ácido Bissoclâmico – Gênero Byssochlamys spp.
Citrinina e Patulina – Gênero Penicilium spp.
Ocratoxina A- Gênero de fungo Aspergillus ochraceus
Aflatoxina – Aspergillus spp.
Fumonisina - Fusarium spp.
Zearalenona – Fusarium spp.
Podem estar presentes em vinhos, sucos, vegetais...
12- Diferenciem surto e caso.
Surto- Quando no mesmo local tivermos mais de 1 pessoa manifestando o mesmo sintoma.
Caso- Quando só uma pessoa manifesta o sintoma.
13- Defina bacteriocinas.
 São substâncias produzidas por algumas bactérias que inibem o crescimento de outras bactérias (peptídeos antimicrobianos).
 Bactérias produtoras do ácido láctico produzem tanto bacteriocinas quanto aminas biogênicas.
14- Exemplos de bactérias gram-negativas e gram-positivas.
Gram-negativa: Família Enterobacteriaceae: Salmonella, Escherichia coli, Protheus.
Gram-positiva: Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes.
15- Quais os principais grupos que são deteriorantes de produtos cárneos?
 Alguns membros da família Enterobacteriaceae: E.coli, Protheus, Salmonella.
Grupo do Gênero Pseudomonas spp.
Bactérias produtoras do ácido láctico: Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Lactococcus. Este último é o principal.
16- Qual o grupo de deteriorantes é benéfico aos vegetais?
As bactérias produtoras do ácido láctico nos vegetais não é considerado um grupo deteriorante, pois são responsáveis pela fermentação de produtos vegetais, sendo esta uma característica de interesse ou desejada em determinados produtos. 
17- Quais são as técnicas utilizadas em placas? Diferencie-as.
a) Spread Plate (espalhamento ou técnica de superfície)
b) Pour plate (sobrecamada)
c) Streak Plate (riscar)
Colocar uma alíquota contendo a bactéria na placa de petri e em seguida espalhar com a alça de Drigalski (por ser de metal é pior para trabalhar, pois na flambagem tende a esquentar) ou alça bacteriológica.
Colocar uma alíquota contendo a bactéria ou do microoganismo na placa, e em seguida colocar um Agar por cima do meio de cultura, depois fazer os movimentos para homogeneização (movimento em forma de 8 para a direita e depois para a esquerda por 8 vezes). Quando a UFC crescer será na superfície e no meio de cultura. Também chamado de sobrecamada pois envolve um meio sólido + microorganismo + meio sólido. As bactérias que crescem bem são as bactérias produtoras do ácido láctico (microaerofílico- exige baixas concentrações de O2).
Semeia-se ou risca-se com alça bacteriológica com a intenção de separar uma colônia da outra para ver se irá crescer um único tipo de bactéria, se crescer um tipo com coloração diferente significa que houve contaminação, ou seja, é uma técnica para verificar o grau de pureza.
18- Quais as utilidades de riscar a placa?
 Para obtenção de colônias isoladas, ou seja, separar uma colônia da outra para ver se vai crescer um único tipo de bactéria. Se crescer uma bactéria com coloração diferente e o meio é específico para colônias verdes significa que está contaminado. 
 Portanto, a técnica é para separar colônias e verificar se a cultura está pura.
 
19- Descreva o método de Kirby e Bauer ou de difusão em disco (teste de sensibilidade antimicrobiana). 
 Primeiramente crescer numa placa de Petri pela técnica spread plate ou Streak plate (espalhamento ou riscar) a cepa padrão que pode ser E. coli ou Staphylococcus aureus, normalmente utilizamos os dois porque uma é gram positiva e outra é gram negativa. 
 Com alça bacteriológica em platina devidamente flambada e resfriada tocar na colônia recente, ou seja, dentro da cabine após crescer a bactéria por spread plate ou riscar numa placa, separar as colônias para obter a colônia isolada.
 Para iniciar o teste de sensibilidade temos que ligar a cabine de segurança, ligar a UV, pulverizar o álcool 70% após desligar UV (para não queimar a retina), após 24 hs retirar 2 a 3 colônias puras da cepa padrão e resuspender as colônias em solução salina estéril (autoclavado com concentração de NaCl 0,85).
 Num tubo colocamos as 2 a 3 colônias puras da cepa padrão e no outro compramos um tubo contendo a escala de Mac Farland já contendo a turvação para olharmos contra a luz e compararmos com o tubo feito, se tiver +/- a mesma turvação significa que temos aproximadamente 1,5x 10 elevado a 8 células.Depois embeber uma swab estéril na solução bacteriana e fazer a técnica do espalhamento na placa, ou seja, temos de semear e aguardar até 15 minutos a superfície do Agar secar.
 Em seguida flambar a pinça e colocar os diferentes antibióticos fixos nos discos (impregnados na concentração adequada fixa no disco). Incubar a placa com disco por 24 hs.
*A flambagem logo após pegar os discos de antibiótico é necessária para não misturar os antibióticos e ocasionar em erro o resultado do teste.
 Depois incubar a placa com disco por 24 hs que é o tempo necessário para crescimento da bactéria. E com o auxilio de uma régua, paquímetro ou outro instrumento preciso, medir o diâmetro dos halos inibitórios semelhantes e consultar a tabela (CLSI).
 Deve-se verificar a tabela padrão ATCC e a medição do diâmetro do halo de inibição para o antibiótico utilizado que para determinada bactéria padrão ATCC apresentará um valor específico na tabela. Em seguida comparar sua experiência com os dados da tabela e avaliar se a bactéria é resistente, suscetível ou intermediária. Quanto maior foi o halo mais sensível a bactéria e vice-e-versa.
20- Qual é a cepa de referência do método de Kirby e Bauer.
As cepas padrão ou ATCC utilizadas no método são de E.coli e S.aureus (Gram negativo e Gram positivo). Mas podem ser bactérias, vírus ou fungos.
21- Quantas células ou UFC/ mL , há na escala 0,5 de Mac Farland?
1,5x 10 elevado a 8 células.
22- Qual a tabela utilizada neste método? A tabela utilizada é a CSLI.
23- Qual a relação entre halo e bactéria? 
Quanto maior o halo de inibição do crescimento bacteriano mais resistente é a bactéria, e quanto menor o halo de inibição mais sensível é a bactéria ao antibiótico utilizado no teste.
25- Quais os fatores que afetam o desenvolvimento microbiano? Descreva-os.
Fatores intrísecos e fatores extrínsecos. 
F.I.: Atividade água, potencial hidrogênionico –pH (acidez), potencial de oxi-redução – Eh, composição química, presença de fatores antimicrobianos naturais, interações entre os microrganismos presentes nos alimentos. 
1. Atividade água: mede a disponibilidade de água. É a quantidade de “água disponível” que se encontra em um alimento. 
Aa= Psoluto (alimento) / Po solvente (água)
É o teor de água livre, que é a relação entre a pressão de vapor do alimento e a pressão de água pura na mesma temperatura. Quanto maior a Aa, maior vai ser o desenvolvimento microbiano. E quanto menor Aa menor será o desenvolvimento microbiano. 
Efeitos na variação da Aa = crescimento microbiano; deterioração química; deterioração de consistência; Aa varia de zero a um.
Redução na Aa no alimento: adição de sal e/ou açúcar; desidratação; congelamento (modifica a água já que coloca ela no estado sólido, diminuindo a atividade microbiana); 
Normalmente bactérias tem maior Aa. Ex: Bactérias halofílicas = 0,75 – se desenvolvem em altas concentrações de sal. 
Nutrientes e temperaturas são interdependentes, em condições ideais ampliam a faixa de Aa para a multiplicação de M.O.
Quanto menor a Aa maior será a validade do produto.
2. Potencial Hidrogênionico (pH): acidificou = inibe a multiplicação da grande maioria dos microrganismos. = Não existe risco zero.
pH superior a 4,5 – baixa acidez. ph 4,0-4,5 – ácidos pH inferior a 4,0 – muito ácido 
Classificação dos alimentos baseada no pH mínimo para a multiplicação e produção da toxina do Clostridium botulinum. 
OBS: Bolores e leveduras são os primeiros microrganismos possíveis a crescerem em pH muito ácidos. 
3. Potencial de oxi-redução (Eh): É a facilidade com que determinado substrato ganha ou perde elétrons. Essa transferência de elétrons estabelece uma diferença de potencial que pode ser medida por equipamentos, em volts ou milivolts. 
Perda de elétrons = oxidar = Eh positivo = presença de Oxigênio
Ganho de elétrons = reduzir = Eh negativo = sem oxigênio.
*se lembrar, dê exemplos de M.O. nos casos anaerobiose, aerobiose e etc.
M.O. microaerofílicos – se multiplicam em uma quantidade reduzida de oxigênio, são aeróbicos. Ex: Lactobacilos, estreptococos. 
M.O. anaerobicos facultativos crescem tanto em condições de anaerobiose quanto em aerobiose. Ex: Família Enterobacteriaceae
Ex de M.O aeróbios: 
Ex de M.O. anaeróbios:
4. Composição Química: Quanto maior a concentração de micro e macronutrientes no alimento, maior vai ser o crescimento bacteriano. Deteriorantes são menos exigentes enquanto os patogênicos são mais exigentes nutricionalmente. A multiplicação microbiana necessita de nutrientes. 
Ex: M.O. proteolíticos – degradam a carne. M.O. lipolíticos – degradam a gordura. (Pseudomonas, Achromobacter, Micrococus)
5. Fatores Antimicrobianos Naturais: São substâncias naturalmente ou intencionalmente presentes nos alimentos com a capacidade de retardar ou impedir a multiplicação microbiana. 
Ex: Eugenol – canela; Alicina – alho; Timol e Isotimol – orégano; clara do ovo (pH 9,0-10,0) e lisozima; 
Conservantes adicionados: Nitrato e nitrito; ácido cítrico e cloreto de sódio; 
*óleos essenciais podem ser adicionados aos alimentos. 
6. Interações entre os Microrganismos: É a produção de metabólitos que podem afetar a capacidade de sobrevivência e multiplicação de outros M.O. 
Ex: Bactérias Lácticas – pH que impede o crescimento de outros m.o.
Bacteriocinas – são substâncias com atividade bacteriocida, produzidas por alguns m.o., como as colicinas produzidas por cepas de E.coli e quanto ativa vai contra a E.coli.
F.E.: Umidade ambiental, Temperatura ambiental, Composição química da atm que envolve o alimento – embalagem. 
1. Temperatura ambiental: A temperatura é o fator ambiental mais importante no crescimento microbiano. Os microrganismos podem se multiplicar em uma grande faixa de temperatura. 
Psicotrófilos, psicotróficos, mesófilos, termófilos. 
Ex: Listeria monocytogenes – mesófila (crescem bem a 37ºC) que cresce bem a 4°C.
2. Umidade Relativa do ambiente: alimentos conservados em ambientes com u.r. superior a sua Aa tenderão a absorver umidade deste ambiente e assim aumentar sua Aa. Ex: Maturar o vinho. 
Umidade relativa < a Aa do alimento: perdem água. Ex: queijo minas aberto na geladeira, perde água e desidrata. 
Relação entre Aa e a umidade relativa do ambiente:
 UR=Aa x 100 UR> Aa: absorção UR< Aa: perda. 
3.Composição Gasosa do Ambiente: atm modificada; determina os tipos de microrganismos que poderão predominar.
A composição gasosa do ambiente em que um alimento for conservado pode selecionar os tipos de microrganismos que irão predominar no alimento. Microrganismos aeróbios se multiplicam napresença de oxigênio enquanto microrganismos anaeróbios se multiplicam na ausência de oxigênio.
Recursos tecnológicos que levam a modificações na composição gasosa do ambiente são muito utilizados, já que essas modificações são capazes de causar alterações nos microrganismos que vivem e se multiplicam em um alimento. A atmosfera modificada é um destes recursos, onde o oxigênio é parcialmente ou totalmente substituído por outros gases, outros exemplos são: embalagens contendo combinações entre oxigênio, nitrogênio e gás carbônico, embalagens a vácuo e atmosferas contendo CO2, que são bastante empregadas para prolongar o armazenamento de frutas e de carnes vermelhas.
26- Qual a importância deles?
Prever a vida de prateleira; Estabilidade microbiológica; 
Se todos os fatores (Aa, pH, Eh, temperatura e conservador químico) contribuir igualmente
no crescimento microbiano, esse crescimento é bloqueado e o alimento é estável e seguro.
- Apenas o fatores (Aa,pH,Eh e conservador químico) conseguem garantir a estabilidade microbiana.
- Um único fator intrínseco (Aa) pode ser suficiente para garatir a estabilidade.
- Se o alimento já possuir uma carga microbiana elevada, os quatro fatores serão insuficientes
para controlar o crescimento microbiano.
- Se o alimento for enriquecido com nutrientes,o que causa um elevado crescimento microbiano, a intensidade dos fatores(obstáculos) deve ser aumentada.
- Se o metabolismo microbiano já estiver afetado menos obstáculos são necessários.
- Se os obstáculos agirem sinergicamente o efeito final será o mais eficiente.
27- Descreva o processo de extração do DNA.
O 1° passo é quebrar a parede ou membrana do microorganismo alvo da extração. Para isso pode ser utilizado um método físico ou químico. O físico consiste no uso de nitrogênio líquido ou de bolas de aço para promover a quebra da parede do alimento e consequentemente do microorganismo alvo presente no alimento. O químico consiste no uso de detergentes SDS e CTAB.
 Na segunda etapa teremos o processo de estabilização do DNA liberado após a quebra da membrana. Esse processo é necessário levando em consideração que a célula tem um mecanismo molecular capaz de promover a degradação do DNA : as enzimas Nucleases. Para que esse fenômeno não ocorra acrescenta-se solução de Ca, Mg e EDTA (solução alcalina por isso adiciona-se 3- HCl para abaixar o pH em torno de 7,5) que ajuda a estabilizar o DNA pela neutralização de seu pH. 
 Além disso, adiciona-se um pouco de sal para remover as histonas, neutralizar a carga negativa do DNA e facilita a precipitação em álcool (aglomeração do DNA).
 Em seguida retirar o DNA e colocar para secar o álcool. Após resuspender o DNA em água pH 7,5- 8,0, destilada, estéril (autoclavada) para não contaminar.
28- Quais detergentes são utilizados?
SDS e CTAB são utilizados para promover a quebra da membrana ou parede da célula.
29- Quais enzimas são inibidas e por quê?
As enzimas nucleases, porque elas degradam o DNA. 
30- O que é adicionado à solução para proteger o DNA?
É adicionado a solução de cálcio, magnésio e EDTA (por se uma solução alcalina acrescenta-se 3-HCl para torná-lo mais neutro) para estabilizar o DNA neutralizando seu pH. 
31- Qual a função / efeito do NaCl nessa extração de DNA?
O NaCl remove as histonas deixando o DNA relaxado, neutraliza a carga do DNA que é carregada negativamente, facilita a precipitação em álcool (aglomeração do DNA).
32- Como podemos verificar a pureza?
Fazer primeiro a leitura da D.O. a 260 nm com o espectrofotômetro , depois tira a cubeta, joga fora o conteúdo e lavar, depois colocar o branco de novo e analisar a concentração do DNA a 280 nm. O resultado do cálculo tem que dar em torno de 1,8 para atestar pureza. Se der 1,9 ou 2,0 está contaminado provavelmente com proteína, se for 1,5 RNA.
Através do cálculo 260 nm/ 280 nm= X/Y = 1,8 para determinar a pureza.
 33- Qual a concentração de absorbância e a de pureza?
Concentração de absorbância = 260nm e de pureza = 280nm
34- Quanto equivale 1 D.O. (Densidade ótica)?
1 D.O. = 50 microgramas /mL de solução.
35- Qual é o valor do DNA puro. Demonstre seu cálculo.
Para ter só DNA faz primeiro a leitura em 260nm encontrando um valor x. E depois analisa em 280 nm encontrando valor y. Dividindo x/y encontra se um valor que indica ser DNA puro quando este é igual a 1,8. 
36- Porque se adiciona álcool e qual é o seu efeito quando gelado. 
Quanto mais gelado o álcool mais precipita o DNA, mais rápido. 
37- Os ovos devem ser lavados? Justifique sua resposta.
Não devem ser lavados, 1º porque os ovos vendidos que apresentam o selo SIF já foram higienizados na indústria e 2º como o ovo tem uma casca porosa, caso tenha algum tipo de contaminação na casca a lavagem contribuirá para internalização dos microorganismos (caso não haja cocção). 
38- O que é mais vantajoso pesquisar E.coli e Família Enterobacteriaceae ou Coliformes Totais e Termotolerante?
 O mais vantajoso é pesquisar E.coli e Família Enterobacteriaceae, pois a pesquisa Coliforme total não abrange todos os membros da família Enterobacteriaceae, se restringe apenas a alguns membros da família, enquanto pesquisar a Família Enterobacteriaceae abrangerá uma série de membros (pois o meio de cultura permite crescer uma série de membros). Já o coliforme termotolerante abrange apenas 90% da espécie Escherichia coli, enquanto a pesquisa E.coli abrange todos os membros do gênero.
39- Quais os melhores microorganismos indicadores?
 E. coli e Família Enterobacteriaceae.
40- O que é pesquisado na legislação brasileira para verificar a qualidade higiênico-sanitária? 
Coliforme total (35C°) e Coliforme termotolerante (45C°).
41- Descreva sobre a corrida eletroforética de DNA em gel de agarose.
 Gel de eletroforese para o DNA é para separar fragmentos de DNA. Ex: no final da extração de DNA temos o DNA suspendido na água e para verificar se ele está muito quebrado na água fazemos essa corrida eletroforética.
 Na corrida eletroforética como o DNA é carregado negativamente colocamos na corrida eletroforética o DNA no polo negativo para que ele possa correr, assim no momento que passarmos a voltagem a tendência dele será correr para o lado positivo. 
 Para essa corrida preparamos o gel de agarose com o tampão TAE (tris, ácido acético e EDTA) ou TBE (tris, ácido bórico e EDTA). Gel 1% de agarose -1g / 100mL colocar no micro-ondas, espera esfriar e utiliza no processo. Colocamos corante para corar o DNA que vai ser colocado no gel que é o brometo de etídeo, além de açúcar para dar peso e fazer o DNA ficar mais denso e cair no poço, isso será visualizado quando incidirmos a luz ultravioleta (azul).
 Quanto mais agarose colocarmos no gel mais duro ele fica e mais lentamente o DNA vai passar, e quanto menos diluído a agarose mais mole fica e mais rápido o DNA vai passar (muitos buracos). Quanto maior o fragmento de DNA mais devagar ele corre e quanto menor mais rápido, por isso o ideal é um gel menos concentrado para um fragmento maior e mais concentrado para um fragmento menor.
 Depois que se prepara o gel e solidificar coloca-se na cama, depois faz-se os poços (buracos com dimensões padronizadas) com o pente no gel e em seguida colocar a cama na cuba com a região dos poços voltada para o lado negativo para colocar as amostras contendo DNA. O lado negativo tem uma coloração vermelha e o lado negativo tem uma coloração preta. 
 Utilizaremos uma cuba onde colocaremos a cama com o gel de agarose e uma fonte de onde obteremos a voltagem. E aplicaremos as amostras de DNA com auxílio da micropipeta no poço (buraco) feito com um pente no gel de agarose no lado negativo (fosfato do DNA tem carga negativa), pois quando ligarmos a corrente eletroforética todos os fragmentos de DNA vão atravessar o gel de agarose.
 Quanto mais quebrado o DNA terá fragmentos menores e mais distante do poço presente exclusivamente no lado negativo, e quanto menos quebrado ele fica mais próximo do lado oposto (correr para o lado oposto). Para se ter uma noção do tamanho do fragmento de DNA usa-se o padrão de peso molecular conhecido que bandas com diferentes tamanhos de DNA (de 1000 a 50 pares de base).