Apostila de Histologia Geral - Ilustrada

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Universidade Federal Rural de Pernambuco 
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal 
Medicina Veterinária 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
HISTOLOGIA GERAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Prof. Dr. Valdemiro Amaro da Silva Júnior 
 
 
Recife (PE), Maio de 2013. 
 
 2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
APOSTILA DE HISTOLOGIA GERAL 
 
 
 
 
Roteiro Didático e Teórico 
Banco de Imagens 
Apresentação Interativa de Práticas Histológicas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 3 
I. INTRODUÇÃO 05 
II. NOÇÕES BÁSICAS DE TÉCNICAS HISTOLÓGICAS 
2.1 Roteiro 06 
2.2 Teoria 08 
III. MICROSCÓPIO E MICROSCOPIA 24 
IV. A CÉLULA 48 
V. O CICLO CELULAR 65 
VI. TECIDO EPITELIAL 
6.1 Aula Tecido Epitelial de Revestimento 68 
6.2 Aula Tecido Epitelial de Secreção 100 
6.3 Roteiro Teórico 117 
6.4 Tecido Epitelial de Revestimento 124 
6.5 Tecido Epitelial de Glandular ou Secretor 136 
VII. TECIDO CONJUNTIVO 
7.1 Aula 141 
7.2 Roteiro Teórico 169 
7.3 Tecido Conjuntivo 172 
VIII. TECIDO CARTILAGINOSO 
8.1 Aula 1 184 
8.2 Aula 2 211 
8.3 Roteiro Teórico 223 
8.4 Tecido Cartilaginoso 227 
IX. TECIDO ÓSSEO 
9.1 Aula 236 
9.2 Roteiro Teórico 273 
9.3 Tecido Ósseo 276 
X. TECIDO ADIPOSO 
10.1 Aula 286 
10.2 Roteiro Teórico 302 
10.3 Tecido Adiposo 304 
XI. SANGUE 
11.1 Aula 314 
11.2 Roteiro Teórico 338 
11.3 Sangue 344 
 4 
XII. HEMOCITOPOIESE 
12.1 Aula 353 
12.2 Roteiro Teórico 370 
12.3 Hemocitopoiese 374 
XIII. TECIDO MUSCULAR 
13.1 Aula 378 
13.2 Roteiro Teórico 403 
13.3 Tecido Muscular 406 
XIV. TECIDO NERVOSO 
14.1 Aula 414 
14.2 Roteiro Teórico 439 
14.3 Tecido Nervoso 441 
XV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 446 
 
 
 
 
 5 
INTRODUÇÃO 
 
 
 A Histologia (grego histós – tecido) é um ramo da Biologia que se destina ao estudo dos 
tecidos e órgãos. 
 
 A palavra tecido entrou em uso anatômico principalmente em virtude do trabalho e das 
obras de Bichat, um jovem e brilhante anatomista francês. Quando dissecava cadáveres, ficou 
impressionado com o fato de que as várias camadas e estruturas que descreveu ou dissecou eram 
de trama ou textura diferentes. Assim idealizou uma classificação destes vários componentes do 
corpo na base de suas diferenças de texturas. Esta primeira classificação dos tecidos foi feita sem 
auxílio do microscópio, porque, embora este já fosse amplamente utilizado na época, Bichat se 
recusava a utilizá-lo. 
 
 Outros anatomistas não compartilhavam das dúvidas de Bichat sobre o valor do 
microscópio e começaram a explorar com ele as várias partes do corpo. Como resultado, foram 
sucessivamente elucidadas as estruturas microscópicas das várias partes do organismo que 
haviam sido antes estudadas apenas a olho nu ou com lentes de aumento. 
 
 O advento do microscópio permitiu uma elevação da Histologia à categoria de disciplina 
científica. Tendo ainda como efeito posterior um aumento das próprias finalidades da Histologia, 
pois demonstrou que a anatomia microscópica de qualquer parte do organismo deve ser explicada 
pelos tecidos que entram em sua composição e pelos modos peculiares de sua disposição e 
combinação para pertencer ao corpo como uma unidade funcional. 
 
 Devido à integração que existe entre a Histologia e outras ciências, como a Citologia, a 
Bioquímica, a Patologia e a Fisiologia; pode-se considerá-la como uma disciplina de grande 
relevância dentro das Ciências Biológicas. Havendo a necessidade de empregá-la, com o auxílio 
do microscópio. 
 
 No que diz respeito ao ensino desta ciência observa-se que a mesma já é estudada nas 
escolas, principalmente no 1º ano do Ensino Médio. No entanto, existe uma dificuldade muito 
grande no que se refere às aulas práticas. Os professores encontram-se limitados, por falta de 
materiais como lâminas histológicas e microscópios. Dessa forma, os alunos aprendem de forma 
monótona e restrita a desenhos esquemáticos, algo que poderia ser mais interessante se fosse 
visto na sua forma real. 
 
 Baseando-se nisso, criou-se um material didático que conseguisse veicular um estudo 
teórico-prático de Histologia, para os professores das escolas de Ensino Médio, das redes 
particular e pública de ensino. Sendo este também destinado aos alunos do Ensino Superior, 
como apoio nos seus estudos referentes à Histologia. 
 
 
 6 
NOÇÕES BÁSICAS DE TÉCNICAS HISTOLÓGICAS 
 
Autor: Prof. Frederico Celso Lyra Maia 
 
 
1. NOÇÕES DE FUNCIONAMENTO E SEGURANÇA DO LABORATÓRIO. 
1.1. Acondicionamento de substâncias químicas (prática). 
1.2. Reconhecimento de vidrarias de laboratório (prática). 
1.3. Reconhecimento de instrumentos usados no laboratório (prática). 
1.4. Reconhecimento de equipamentos usados no laboratório (prática). 
1.5. Noções de funcionamento dos equipamentos (prática). 
 
2. NOÇÕES DE TÉCNICAS DE NECROPSIAS E COLHEITA DE MATERIAL PARA 
EXAME LABORATORIAL. 
 
3. NOÇÕES SOBRE BIÓPSIA, PEÇAS CIRÚRGICAS E PEÇAS DE NECRÓPSIA. 
3.1. Remessa de material ao laboratório. 
3.2. Identificação e registro do material colhido. 
 
4. NOÇÕES SOBRE FIXADORES. 
4.1. Solução de formalina tamponada à 10%. 
4.2. Formol salina à 10%. 
4.3. Solução de Bouin. 
4.4. Solução de Zenker. 
4.5. Carnoy. 
 
5. DESCALCIFICAÇÃO - UTILIZAÇÃO E FÓRMULAS. 
 
6. PREPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS DE USO FREQUENTE NO LABORATÓRIO. 
6.1. Corantes. 
6.1.1. Hematoxilina de Harris. 
6.1.2. Hematoxilina de Mayer. 
6.1.3. Eosina. 
6.2. Formol em solução salina à 10%. 
6.2.1. Solução de formalina tamponada à 10 %. 
6.3. Albumina de Mayer. 
 
7. PROCESSAMENTO DO MATERIAL. 
7.1. Desidratação e diafanização. 
7.2. Banho de parafina e confecção de blocos de parafina (papel e outros). 
7.3. Afiação da navalha. 
7.4. Corte dos blocos em micrótomo e “pescagem” em banho-maria. 
7.5. Secagem da lâmina em estufa. 
7.6. Coloração de rotina (H. E.). 
7.7. Montagem da lâmina. 
 
 7 
8. NOÇÕES BÁSICAS DE ARTEFATOS NO PROCESSAMENTO DOS TECIDOS E NAS 
COLORAÇÕES. 
8.1. Artefatos na preparação de tecidos. 
8.2. Artefatos devidos à impregnação e inclusão. 
8.3. Artefatos provocados pelo corte. 
8.4. Artefatos na coloração de lâminas com H. E. 
8.5. Defeitos de confecção de lâminas. 
 8 
1. NOÇÕES DE FUNCIONAMENTO E SEGURANÇA NO LABORATÓRIO 
 
 O laboratório é um local especial de trabalho. Especial, porque nele, regras essenciais não 
podem jamais deixar de serem observadas, sob pena de graves acidentes. O conhecimento 
mínimo de seu funcionamento, o uso adequado de equipamentos e o acondicionamento e 
manuseio de substâncias químicas nele utilizadas, são fundamentais para sua segurança e saúde e 
a dos outros também. 
 
 Algumas regras básicas e elementares devem ser sempre lembradas: 
 
 Não manuseie equipamentos sem antes receber instruções sobre seu uso. 
 Não manuseie nem armazene substâncias químicas sem conhecimento mínimo de suas 
propriedades, uso e armazenamento adequado. 
 Procure estabelecer normas de segurança e hábitos que devem tornar-se rotina, por 
exemplo: 
o Verificar se os aparelhos foram desligados ou ligados (conforme indicação). 
o Verificar luzes. 
o Verificar torneiras de gás. 
o Verificar o posicionamento de equipamentos e substâncias químicas, etc. 
 Estabeleça normas de procedimentos para suas tarefas diárias. 
 Evite distrair-se ao executá-las. 
 Comuniqueimediatamente ao seu superior (ou responsável), qualquer alteração no 
funcionamento dos equipamentos. 
 Lembre-se que os acidentes de laboratório são fatais ou provocam grandes danos, e que 
por isso, a prevenção é fundamental e essencial. 
 
 
2. NOÇÕES DE TÉCNICAS DE NECRÓPSIA E COLHEITA DE 
MATERIAL PARA EXAME LABORATORIAL 
 
 Na maioria dos laboratórios, parte do material a ser trabalhado advém de pesquisas onde 
se utilizam animais de experimentação. Portanto, torna-se necessário que o técnico em 
laboratório tenha conhecimentos básicos sobre métodos de eutanásia (sacrifício ou abate) e 
colheita de material em pequenos animais usados em experimentação. 
 
Sacrifício 
 
 Depende do animal, do tipo de experimento e do material a ser colhido; entretanto os 
métodos mais utilizados são: 
 Dessensibilização por comoção cerebral e sangria: Em animais de laboratório, um dos 
métodos consiste em dar-se uma pancada na região da nuca do animal na superfície de 
quina de um balcão ou de uma mesa, seguida de sangria por secção (corte) dos vasos do 
pescoço (carótida e jugular). Esse ato requer certa habilidade de quem o executa para que 
provoque a dessensibilização imediata do animal e este não sinta dor. 
 Anestesia profunda por inalação: Neste método utiliza-se um funil com um chumaço de 
algodão embebido em clorofórmio, que deve ser colocado sobre o animal ou sobre o 
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focinho deste, depois de imobilizado. Depois de sacrificado, o animal deverá ser 
necropsiado. Lembramos que congestões de órgãos, principalmente de pulmões, fígado e 
rins, geralmente ocorrem neste método e devem ser consideradas quando da análise dos 
materiais. 
 
 A posição ideal para abertura e colheita do material é o decúbito dorsal, ou seja, o animal 
deve estar de costas para a superfície e de barriga para cima. Se o animal é de tamanho muito 
pequeno pode se utilizar uma tábua com quatro pregos fixados, onde, com uma linha amarrada 
em cada pata, fixa-se o animal. Assim, ele fica imóvel e permite ao operador maior mobilidade 
das mãos. A abertura deve ser feita com bisturi (ou faca afiada) ou ainda com auxílio de tesoura e 
pinça. As técnicas de abertura deverão ser demonstradas em aula prática. Os materiais, a forma e 
o acondicionamento variam de acordo com os exames a serem realizados. 
 
COLHEITA DE MATERIAL PARA EXAME LABORATORIAL 
 
 De modo geral, para exames bacteriológicos e virológicos, os materiais devem ser 
acondicionados em recipientes previamente esterilizados e conservados sob refrigeração ou 
congelamento (só para vírus). Já para o exame histopatológico, os fragmentos de órgãos devem 
ter no máximo 0,5 cm de espessura, não importando o tamanho. Isto irá permitir uma melhor 
penetração do líquido fixador, portanto uma melhor fixação e conservação do material. O 
material a ser colhido deve ser representativo da área a ser estudada ou correspondente às áreas 
lesadas visualizadas macroscopicamente (a olho nú). 
 
 Esse material deve ser acondicionado em vidros de boca larga e o volume do fixador deve 
ser no mínimo 20 vezes maior que o volume das amostras. Após a fixação completa (mínimo 24 
horas) o material deverá ser novamente recortado, para em seguida ser processado. 
 
 
3. NOÇÕES SOBRE BIÓPSIA, PEÇAS CIRÚRGICAS E PEÇAS DE 
NECROPSIA. 
 
 Biópsia: pequeno fragmento de tecido retirado em ato cirúrgico. 
 Peça cirúrgica: tecido lesado, ou órgão, ou parte dele retirada em ato cirúrgico. 
 Peça de necropsia: órgão ou parte dele ou tecido lesado retirado por ocasião da necropsia. 
 
OBS.: O material colhido deverá ser representativo da(s) lesão(ões) que se deseja estudar. O 
fragmento preferencialmente deverá conter parte da área lesada e parte de área normal adjacente 
à lesão. 
 
 
3.1. REMESSA DE MATERIAL AO LABORATÓRIO 
 
 Os materiais colhidos para exame histopatológico devem ser remetidos de tal modo que se 
preserve a estrutura celular, já que será ela o objeto de estudo. 
 
 10 
 Ao remeter-se o material, pode-se lançar mão de um meio conservante ou de uma solução 
fixadora. O ideal é que seja um fixador, uma vez que este último, semelhante a uma fotografia, 
manterá a estrutura celular tal como se encontrava naquele momento, não permitindo ocorrer o 
desenvolvimento de fenômenos autolíticos e/ou putrefativos nas células (que ocorrem 
normalmente após a morte). 
 
 Os meios conservadores ou o meio conservador mais usual é o gelo, já que a baixa 
temperatura diminui a atividade metabólica celular, inibe ou diminui a ação de enzimas e o 
crescimento bacteriano, permitindo a chegada do material ao laboratório. A utilização deste 
recurso apresenta inconvenientes que poderão pôr em risco a finalidade do material a ser 
examinado, tais como: 
 A congelação provoca retração do material, ruptura celular e desagregação tecidual e ao 
descongelamento ocorre a embebição do material pela água (água penetra nas células). Ao 
exame microscópico poderá sugerir ou confundir-se com tumefação celular. 
 O resfriamento expõe o material ao contato com a água, hidratando-o. Ao exame 
microscópico, pode, a exemplo do congelamento confundir-se com tumefação celular. 
 
 
3.2. IDENTIFICAÇÃO E REGISTRO DO MATERIAL COLHIDO 
 
 Os materiais recebidos no laboratório devem ser identificados e registrados imediatamente 
em livro de registro para que não haja confusão ou troca de materiais. 
 
 Após a identificação dos fragmentos, o material deverá receber a numeração deste 
registro, a qual deverá ser anotada num pequeno pedaço de papel retangular com o número 
correspondente anotado em lápis grafite (para não borrar) e acondicionado dentro do frasco. Mais 
uma identificação na tampa ou no próprio vidro é recomendável e facilita a identificação. 
 
 Os dados que devem ser anotados constam da identificação do animal como: espécie, 
idade, sexo, raça, pelagem, bem como identificação do proprietário e remetente. As informações 
devem relatar detalhes sobre região anatômica de onde foi retirado o material, bem como a 
consistência, coloração, aspecto e forma do mesmo e ainda considerações sobre achados de 
necropsia (se o animal foi necropsiado) de importância. 
 
 
4. NOÇÕES SOBRE FIXADORES 
 
SOLUÇÕES FIXADORAS 
 
 As soluções fixadoras são substâncias químicas responsáveis pela preservação do tecido a 
ser examinado, de tal maneira que possa inibir nele as alterações autolíticas, permitindo assim, a 
identificação das modificações dos tecidos e células e, se possível, associar ao(s) agente(s) causal 
(ais). Independente do fixador há sempre uma retração de 20 a 30% do tecido. 
 
As soluções fixadoras mais usadas são: 
 Solução de formalina tamponada à 10%. 
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 Formol em solução salina a 10%. 
 Solução de Bouin. 
 Solução de Zenker. 
 Carnoy. 
 
OBS.: A escolha deve ser definida com base na necessidade de rapidez de fixação. 
 
 
CONSIDERAÇÕES: 
 
 O aldeído fórmico (CH2 0) é um gás, mas é encontrado no comércio sob a forma de 
solução aquosa saturada na proporção de 36 a 40 %, ou seja, formalina à 36-40%, equivale para 
nós na utilização das fórmulas, como sendo formalina 100%. 
 
 Solução de formalina tamponada a 10%. É o fixador ideal e mais utilizado em laboratórios de 
histopatologia; fixa bem os tecidos e tem baixo custo. A elevação de temperatura acelera a 
atividade de fixação (Ex.: temperatura de 50
0 
C 1h). Portanto, caso haja necessidade de 
rapidez de fixação pode-se levar o material à estufa por 1 hora. 
 
OBS: 
o Soluções de formalina que não forem neutralizadas ou tamponadas podem produzir 
pigmentos de hematina, vistos em área do tecido onde haja sangue. Esse pigmento possui 
cor amarronzada e podeser confundido com outros pigmentos como hemossiderina ou 
lipofuscina. 
o Soluções com concentrações mais fortes (solução à 20 % ou mais) tem o inconveniente de 
endurecerem demais os tecidos e apenas são usadas para fixação de tecido nervoso e 
tecido ósseo. 
o Para fixação de tecidos pouco densos como pulmão, pele, próstata etc. pode se utilizar 
solução de formalina neutra a 4 ou 5%. Evita-se o ressecamento (endurecimento) 
excessivo do material. 
o O material pode permanecer neste fixador por meses a anos (10 anos ou mais) sem 
alterações muito significativas nos tecidos. 
 
 Formol em solução salina a 10%. É um fixador de fácil preparação para uso no campo. Possui 
boa fixação e penetração. Pode ser usado como alternativa à solução anterior. 
 
 Solução de Bouin. É um fixador rápido, ideal para glândulas, testículos, pele e corpúsculos 
de inclusões celulares. Como consequência dessa fixação rápida requer lavagens sucessivas 
em vários álcoois a 70% por 4 a 6 horas, para poder retirar o excesso de fixador e só então se 
processar o material. O excesso de fixador provoca o ressecamento e endurecimento do 
material, dificultando seu processamento. O material depois de fixado e devidamente lavado 
em álcoois, deve ser conservado em álcool a 70%. 
 
 Solução de Zenker. É um fixador rápido, de 6 a 24 horas, ideal para fixar medula óssea, baço, 
gânglios linfáticos, hipófise e pâncreas. O material depois de fixado deve ser lavado em 
álcool a 80% e conservado em álcool também a 80%. É pouco usado. 
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 Carnoy: De todos os fixadores é o mais rápido, requer cerca de 3 horas. Constitui-se um meio 
de acelerar a fixação nos casos de urgência. Seu principal problema é a destruição das 
hemácias. É pouco usado. 
 
 Os melhores resultados na fixação serão obtidos mediante a adoção das seguintes 
manipulações e acondicionamentos do material: 
a) Recorte de fragmentos de tecidos com no máximo 0,5 cm de espessura. Isso facilita a 
penetração rápida do fixador. 
b) Os fragmentos de tecidos de animais recém sacrificados ou mortos devem ser colocados 
imediatamente na solução fixadora. 
c) O(s) fragmento(s) deve(m) ser colocado(s) em recipiente no qual foi previamente 
colocado um pouco de algodão para revestir o fundo para evitar que o material adira ao 
recipiente, e esta superfície aderida não receba adequadamente o fixador. 
d) A solução fixadora deve ser 10 a 20 vezes o volume do tecido, e finalmente, deve haver 
algodão recobrindo o material par não permitir a flutuação de certos órgãos (pulmão, por 
exemplo). 
e) O recipiente deve ter boca larga e tampa que feche hermeticamente (sem vazar), evitando 
a evaporação e vazamento do fixador. 
f) Não se deve colocar o recipiente com fixador em resfriamento nem em congelamento. 
 
 
5. DESCALCIFICAÇÃO - UTILIZAÇÃO E FÓRMULA 
 
 Objetiva retirar a parte calcificada, ou seja, o fosfato de cálcio do tecido ósseo, de tumores 
ósseos ou depósitos patológicos de cálcio em tecidos, para serem posteriormente cortados. Este 
processo pode ser realizado por imersão em ácidos ou em compostos quelantes. 
 
 Os compostos ácidos apresentam a desvantagem de alterar os materiais por hidrólise de 
vários de seus elementos. Aparelhos elétricos podem produzir descalcificação, entretanto, seu uso 
não é recomendado por lesarem os tecidos. 
 
 Fórmulas de descalcificadores 
 
A) Método Ácido Fórmico - Citrato de Sódio (para osso): 
 
Solução A 
Citrato de Sódio 50g 
H2O destilada 250ml 
 
Solução B 
Ácido fórmico 125 ml 
H2O destilada 125 ml 
 
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 Colocar os fragmentos de ossos a serem descalcificados em grande quantidade de 
descalcificador, trocando a solução diariamente (para melhor resultado). Após totalmente 
descalcificado, lavar em água corrente durante 4-8 horas, após, seguir processamento de rotina. 
 
 
B) Método Ácido Nítrico (para tumores com osso, tecidos calcificados): 
 
Álcool 80% 95 ml 
Ácido Nítrico concentrado (68-70% densidade 
específica 1,41) 
 
 50 ml 
 
 Terminada a descalcificação, passar diretamente a uma solução aquosa de sulfato de sódio 
a 4%, por 3 horas. 
 Lavar em água corrente por 2 horas ou a noite toda. 
 Desidratar, diafanizar e incluir em parafina. 
 
 
C) Método do EDTA (quelante) 
 
EDTA 5,5 g 
H2O destilada 90 ml 
Formol 10 ml 
 
 Lavar em H2O o material par retirar o excesso de descalcificador. 
 Não usar fragmentos de mais de 3 mm de diâmetro. 
 Usar em média 40 vezes o volume dos tecidos a serem descalcificados. 
 Agitar a solução várias vezes ao dia. 
 Trocar a solução a cada 2 dias. 
 Manter o fragmento de tecido suspenso (usar boneca de gaze). 
 Desidratar e seguir processamento de rotina. 
 
 
6. PREPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS DE USO FREQUENTE NO 
LABORATÓRIO 
 
6.1. HEMATOXILINA 
 
 O método de “rotina” de coloração com a Hematoxilina-Eosina (H.E.) produz excelentes 
resultados, desde que se observem rigorosamente as regras de fixação, idade do corante, etc. 
 
 A hematoxilina mais utilizada é a de Harris. Lavando os cortes em água corrente, por 10 
minutos ou mais, a coloração se mantém estável por muitos anos. Se a lavagem não for bem feita, 
a coloração dos cortes vai enfraquecendo depois de alguns anos. 
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OBS: A duração da coloração dos cortes é dependente de uma série de fatores como: método e 
qualidade da coloração, qualidade dos reagentes e corantes utilizados, forma de utilização e 
armazenamento adequado da lâmina. 
 
 
6.1.1 HEMATOXILINA DE HARRIS 
 
 Hematoxilina cristais 5,0 g 
 Álcool etílico 100% 5 0 ml 
 Alúmen de potássio ou amônio 100,0 g 
 Água destilada 1000,0 ml 
 Óxido vermelho de mercúrio 2,5 g 
 Ácido acético glacial 20 a 30 ml 
 
Método: 
 Dissolver a hematoxilina no álcool. Aquecer a água sem ferver. Dissolver o alúmen na 
água. Misturar as duas substâncias voltando ao fogo, mas deixando ferver rapidamente 
(não ultrapassar 1 min.). Retirar do fogo e acrescentar o óxido vermelho de mercúrio 
agitando com bastão. Aquecer em fogo brando sem deixar ferver (agitando c/ um bastão). 
Deixar resfriar à temperatura ambiente ou resfriar em banho-maria frio com água 
corrente. Colocar de 2 a 4 ml de ácido acético glacial para cada 100 ml da solução. 
 Guardar em local protegido da luz (frasco âmbar). 
 Filtrar em papel de filtro antes de usar a solução. 
 
 
6.1.2. HEMATOXILINA DE MAYER 
 
Hematoxilina de Mayer (solução de estoque) 
Hematoxilina (cristais) 1,0 g 
Água destilada 1000 ml 
Iodato de sódio 0,2 g 
Alúmen de amônio ou potássio 50,0 g 
Ácido cítrico 1,0 g 
Hidrato de cloral 50,0 g 
 
Existem dois métodos de preparar a hematoxilina: 
 
1º método: dissolver o alúmen em água, a frio, juntar hematoxilina, adicionar o iodato de sódio, o 
ácido cítrico e o cloral, agitando-os continuamente até solução completa. A cor final deve ser 
vermelho-violeta. A solução se mantém por meses. Identifica-se o vidro, inclusive a data de 
preparo. 
 
2º método: dissolver o alúmen em 500 ml de água, a quente (não ferver). Dissolver o cloral, ácido 
cítrico e o iodato de sódio nos outros 500 ml de água. Dissolver a hematoxilina em 10 ml de 
álcool absoluto. Misturar as 3 soluções. Guardar em vidro âmbar identificando a solução, 
colocando a data de preparo da hematoxilina. 
 15 
 
 
6.1. 3 EOSINA 
 
Solução alcoólica de eosina a 1% (solução de estoque) 
Eosina Y, hidrossolúvel 1,0 g 
Água destilada 20 ml 
Álcool à 95 % 80 ml 
 
 Dissolver a eosina na água e acrescentar o álcool 95 %. 
 
 
Solução alcoólica de eosina a 1% (solução de uso) 
Eosina (soluçãode estoque) 1 parte 
Álcool 80% 3 partes 
 
 No momento de usar, adicionar 0,5 ml de ácido acético glacial por cada 100ml de 
solução. 
 
 
6. 2. Formol a 10% em solução salina 
 
Água destilada 1 litro 
Cloreto de Sódio 8,0 g 
Formalina a 40 % 100 ml 
 
 Dissolver o cloreto de sódio na água destilada e misturar à formalina. 
 
 
6.2.1 Formol tamponado a 10 % 
 
Água destilada 900,0 ml 
Fosfato de sódio monobásico 4,0 g 
Fosfato de sódio dibásico 6,5 g 
Formalina a 40% 100 ml 
 
 Dissolver totalmente o fosfato de sódio monobásico e o dibásico na água e acrescentar a 
formalina. 
 
 
6.3. Albumina de Mayer 
 
Albumina 50% 
Glicerina líquida 50% 
Colocar 1 pedra de timol para evitar fungos 
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6.3.1 Preparo de álcool à 90 %, 80 %, 70 %, 60 %. 
 
 Material necessário: 
o Proveta de 1000 ou 2000 ml. 
o Alcoômetro. 
 Método: Coloca-se o álcool na proveta e adiciona-se água até a graduação desejada. 
 
Obs.: Se você não dispõe de alcoômetro pode utilizar a tabela abaixo. 
 
 
7. PROCESSAMENTO DO MATERIAL 
 
7.1. Desidratação e diafanização (clarificação) 
 
 Os fragmentos de tecidos a serem incluídos em parafina passam por um processo de 
desidratação (perda de água) e diafanização (clarificação por xilol). Estes processos têm por 
objetivo permitir a penetração da parafina para dar consistência firme e uniforme aos fragmentos, 
para posteriormente, em blocos, serem cortados em micrótomo. 
 
 Existem alguns métodos para desidratação, por exemplo: 
 
- Método 1 (pela acetona): 
 
Álcool absoluto - 30 minutos 
Acetona I - 45 minutos 
Acetona II - 45 minutos 
Xilol I - 1 hora 
Xilol II - 1 hora 
Parafina I - 1 hora 
Parafina II - 1 hora 
 
 
 
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- Método 2 (pelo álcool): 
 
Mais usado, pelas facilidades de obtenção das substâncias e pelo baixo custo. 
 
Álcool 70 % Passar a noite 
Álcool 80 % - 30 minutos 
Álcool 90 % - 30 minutos 
Álcool 100 % I - 30 minutos 
Álcool 100 % II - 30 minutos 
Álcool 100 % III - 30 minutos 
Xilol 1 - 45 minutos 
Xilol 2 - 45 minutos 
Parafina I - 1 hora 
Parafina II - 1 hora 
Inclusão em blocos de parafina 
 
 
Processamento para biópsia (Processamento rápido) 
 
Álcool 100 % - 20 minutos em estufa 
Xilol 1 - 30 minutos fora da estufa 
Parafina 1 - 30 minutos em estufa 
Inclusão em blocos de parafina 
 
 
Processamento para fragmentos maiores (processamento rápido) 
 
Álcool 100 % - 20 minutos em estufa 
Xilol I - 30 minutos fora da estufa 
Xilol II - 30 minutos fora da estufa 
Parafina 1 - 30 minutos em estufa 
Parafina 2 - 30 minutos em estufa 
Inclusão em blocos de parafina 
 
 
7.2. Impregnação pela parafina e confecção de blocos de parafina (papel) 
 
 Após as passagens nas parafinas, faz-se a inclusão nos blocos, como segue abaixo: 
 
a) Construída a caixinha de papel, coloca-se um pouco de parafina fundida a 56-580 C no 
fundo, em seguida coloca-se a superfície de corte de corte do material voltada para o 
fundo da caixinha. 
b) Enche-se a caixinha com parafina fundida a 56 - 580C. 
c) Deixa-se esfriar em temperatura ambiente. 
d) Antes de cortar no micrótomo, aparar o bloco, a fim de deixar as suas superfícies planas e 
paralelas, permitindo assim uma boa fixação do bloco no micrótomo. 
 18 
e) Momento antes do corte coloca-se os blocos sobre o gelo, para que a parafina fique mais 
firme e facilite o corte. 
 
 
7.3. Afiação da navalha 
 
 O mais querido, famoso e, um dos mais competentes presidente dos Estados Unidos da 
América, Abraham Lincoln, certa vez falou: “Se eu dispusesse de 9 horas para cortar uma árvore, 
passaria 6 horas afiando meu machado”. Convém lembrar que o referido presidente antes havia 
sido um simples machadeiro. A essência da frase nos diz que se temos uma missão a fazer 
devemos gastar 2/3 do tempo nos preparando para realizá-la. Esta célebre frase também se aplica 
perfeitamente ao nosso caso. Cortar uma árvore, um fragmento de tecido ou qualquer outra coisa 
implica em dispor-se de um instrumento efetivamente eficiente, sob pena de se ter um enorme 
desgaste para realizar tal função. É, pois, a navalha, a coisa mais importante para realização de 
um corte perfeito. Lógico que a qualidade do micrótomo e a habilidade do técnico influenciam, 
mas não são tão importantes quanto uma boa navalha. É esta que garante a qualidade de um bom 
corte. Manter a navalha sempre amolada e afiada é função e obrigação de um bom técnico. A 
navalha deve ser amolada quando apresentar dentes que são facilmente evidenciáveis nos cortes. 
Para tanto, utiliza-se um amolador de navalhas automático ou amola-se manualmente em pedra 
de amolar adequada. Retirados os “dentes”, passa-se para a etapa de afiação. Esta é realizada em 
um instrumento com superfície de couro. O fio ideal é conseguido depois de certo tempo de 
afiação. A condição ideal é testada nos cortes. Uma vez atingida esta condição ideal, 
recomendamos a manutenção do fio da navalha pela afiação em couro por pelo menos 20 a 30 
minutos diários. É sempre recomendável que cada técnico possua sua navalha e que só ele a 
manuseie. 
 
 Navalhas descartáveis tem sido muito utilizadas e proporcionam excelentes cortes mas 
apresentam a desvantagem do alto custo. São práticas, mas cegam com facilidade. As navalhas 
permanentes se bem afiadas e conservadas tem longa durabilidade. 
 
 
7.4. Corte dos blocos no micrótomo e “pescagem” do material em banho-maria 
 
a) Prepara-se o micrótomo regulando-o para a espessura de corte e coloca-se a navalha. 
b) Trava-se o micrótomo. 
c) Coloca-se o bloco de parafina. 
d) Destrava-se o micrótomo. 
e) Inicia-se os cortes em espessura maior (10 - 15 micras). 
f) Acertada a superfície de corte do bloco, reduz-se a espessura do corte para 3 a 5 micras. 
g) Realiza-se os cortes em tiras ou em fatias separadas, colocando-os em banho-maria 
histológico com a água a 40-45
0 
C, para desenrugá-lo. O estiramento pode ser ajudado 
com o auxílio de uma pinça fina e curva. 
h) Pesca-se os cortes desejados com lâmina, previamente limpa, tratada com adesivo 
(albumina de Mayer), que facilitará a adesão do corte à lâmina. 
 
 
 
 19 
 
7.5. Secagem da lâmina em estufa 
 
 Leva-se a lâmina à estufa a 58
0
C por 15 a 20 minutos para a retirada do excesso de água e 
para dissolver o excesso de parafina. Retirar da estufa e deixar secar em temperatura ambiente até 
a coloração. 
 
Obs.: Após o corte recobre-se a superfície do bloco com um banho de parafina a fim de proteger 
o restante do material incluído. Em seguida arquiva-se o bloco. 
 
 
7.6. Coloração de rotina (H.E.) 
 
 A coloração de rotina ou mais usual é pelo método da Hematoxilina-eosina, cuja 
finalidade é corar as diferentes estruturas do tecido (núcleos em azul escuro e citoplasma em 
rosa). 
 Técnica de coloração pelo H.E.: 
a) Lâmina com o material cortado. 
b) Desparafinar nos banhos de xilol. 
c) Retirar o xilol nos banhos de álcool de 100% a 70%. 
d) Hidratar em água. 
e) Corar pela Hematoxilina - 2 a 5 minutos. 
f) Lavar em água corrente (viragem) – 10 a 15 minutos. 
g) Corar pela Eosina - 30 segundos a 2 minutos. 
h) Diferenciar em álcool a 70% (retirar o excesso de eosina) por passagem rápida. 
i) Desidratar em álcool a 80 - 100%. 
j) Clarificar nos banhos de xilol. 
k) Montagem da lâmina. 
 
 
 
 20 
BATERIA COMPLETA C/ TEMPO SUGERIDO 
 
XILOL (de desparafinação) 5 min. 
ÁLCOOL 100% 1-2 min. 
ÁLCOOL 90% 1-2min. 
ÁLCOOL80% 1-2 min. 
ÁLCOOL 70% 1-2 min. 
ÁGUA 1-3 min. 
HEMATOXILINA 1-2 min. 
ÁGUA 3-5 min. 
EOSINA 1-2 min. 
ÁGUA lavagem rápida 
ÁLCOOL 70% 1-2 min. 
ÁLCOOL 80% 1-3 min. 
ÁLCOOL 100% I 1-3 min. 
ÁLCOOL 100% II 1-3 min. 
XILOL I 3-5 min. 
XILOL II 3-5 min. 
 
 
7.7 MONTAGEM COM LAMÍNULA E BÁLSAMO DO CANADÁ 
 
7.7. 1 Montagem da lâmina 
 
 A montagem é feita colocando-se uma gota de bálsamo do Canadá ou entelan 
sobrepondo-se a esta a lamínula. Retirar com gaze ou pedaço de pano o excesso de bálsamo. 
 
Obs.: O resultado consiste de: 
 Núcleos celulares corados em azul escuro ou roxo. 
 Citoplasmas em rosa claro. 
 
 
8. NOÇÕES BÁSICAS SOBRE ARTEFATOS NO PROCESSAMENTO DOS TECIDOS E 
COLORAÇÃO 
 
8.1. Artefatos na preparação de tecidos 
 
a) Organismos saprófitas- Saprófita é um microrganismo que prospera na matéria em 
decomposição. Observa-se após iniciada a autólise do tecido. O organismo é notado por 
suas características invasivas. Nota-se a presença de inúmeras estruturas geralmente em 
forma de bastonetes disseminadas pelos tecidos. 
 
Obs. É impossível restabelecer as propriedades corantes dos núcleos celulares de 
espécimes que sofreram autólise. 
 
 21 
b) Artefato causado pelo congelamento- Temperaturas de congelação provocam a formação 
de cristais de gelo intra e extracelulares e causam o deslocamento do tecido produzindo 
vacúolos e lacunas intra e extracelulares que permanecem após o degelo. As causas mais 
comuns da introdução destes artefatos são a armazenagem ou conservação em ambiente 
refrigerado (temperaturas de congelação), e exposição a baixas temperaturas naturais ou 
não durante o transporte. 
c) Fixador de Bouin- É absolutamente indispensável que não fiquem resíduos de ácido 
pícrico em tecidos tratados pelo fixador de Bouin. O ácido pícrico residual alterará o 
tecido e afetará suas propriedades corantes. O material ressecado torna-se quebradiço ao 
corte. Fragmenta-se, não se obtendo as fitas de tecido. 
d) Fixador muito forte- Formol ou qualquer fixador em altas concentrações pode endurecer e 
ressecar excessivamente o material, inviabilizando seu processamento. 
e) Álcool absoluto (100%)- Quando usado como fixador-conservador desidrata 
excessivamente o material tornando-o endurecido e ressecado e pode inviabilizar seu 
processamento. 
 
 
8.2 Artefatos devidos à impregnação e inclusão 
 
a) Impregnação imperfeita da parafina- Caracteriza-se pela dispersão, ao se colocarem cortes 
histológicos em banho-maria. 
b) Efeito de “terra rachada” - O tecido imperfeitamente impregnado apresentará um aspecto 
semelhante ao de terra seca (rachada). A exposição aos xilóis clarificadores contrai o 
corte, e este, ao voltar às dimensões originais, apresentará as rachaduras citadas. 
c) Inclusão imperfeita- As rachaduras que aparecem em volta dos materiais são produzidas 
pela imperfeita adesão da parafina dentro do material e da parafina que o envolve, se o 
tecido não é prontamente transferido do recipiente de parafina para o molde de inclusão. 
d) Bloco duplo– Ocorre quando há demora em se colocar mais parafina na caixinha quando 
da inclusão. A diferença de temperatura da pouca parafina que se coloca inicialmente e da 
que se completa posteriormente, provoca a formação de duas camadas de parafinas 
distintas dando a impressão de dois blocos em um só. Isto permite a quebra do bloco na 
hora do corte e inclusive pode-se perder totalmente o fragmento. Quando isto acontecer 
pode-se dissolver o bloco na estufa e tornar a incluir o material. 
 
 
8.3. Artefatos provocados pelo corte 
 
1) Navalha cega- As três características mais importantes de uma navalha sem fio são: 
a) Os cortes não saem em fita. 
b) Os cortes saem espessos. 
c) Os cortes aderem ao bloco durante o curso ascendente do micrótomo. 
d) Compressão microscópica das estruturas histológicas. 
2) Efeito veneziana- o efeito “veneziana” (linhas horizontais espessas e delgadas de cores claras 
e escuras) frequentemente observado em cortes histológicos é devido: 
a) Ao uso de lâminas sem fio. 
b) Inclusão de tecido duro e tecido mole no mesmo bloco. 
c) Parafusos de ajustes do micrótomo mal apertados (folgados). 
 22 
d) Lubrificação deficiente das superfícies móveis do micrótomo. 
3) Efeito de mordedura de traça- O aspecto se caracteriza pelo aparecimento de orifícios de 
bordas irregulares no corte. O artefato é devido a exposição excessiva aos álcoois, xilol e 
parafina, redundando em endurecimento excessivo do tecido. Ao cortar o bloco de parafina, a 
navalha do micrótomo provoca estrição do tecido. Pode-se resolver esse problema pela 
aplicação de um chumaço de algodão embebido em água à superfície de corte do bloco de 
parafina. 
4) Riscos no tecido– É um defeito muito frequente e caracteriza-se por mostrar riscos retilíneos 
nos tecidos. É provocado por dentes na navalha. Cada dente provoca um risco. 
 
 
8.4. Artefatos causados no banho-Maria (pescagem) 
 
a) Água fria (abaixo da temperatura ideal = 45º C) - Não há estiramento adequado do 
material. As dobras dos tecidos são frequentes. 
b) Água quente demais- O material se dissolve bastante e até totalmente, inviabilizando a 
pescagem. 
c) Água suja- Decorre da água suja com restos de outros materiais cortados anteriormente. 
Estes restos de tecidos são pescados junto com as novas tiras de material e se sobrepõem 
ao material pescado. Confundem o exame microscópico por tratarem-se de células de 
tecidos diferentes sobrepostas. 
 
 
 8.5 Artefatos na coloração de lâminas com H. E. 
 
a) Muitas vezes, a coloração desigual deve-se ao fato de não terem sido as lâminas agitadas 
várias vezes, dentro da solução corante, antes de descansar durante o período de 
exposição necessário. 
b) A desidratação incompleta das lâminas microscópicas é caracterizada por um aspecto 
cinzento e granuloso do corte histológico. Quando se abaixa o condensador do 
microscópio podem-se observar bolhas de água. 
c) Excesso de hematoxilina. Os cortes ficam excessivamente azuis inclusive os citoplasmas. 
Tempo excessivo de exposição ao corante é a causa. 
d) Excesso de eosina. Os cortes ficam excessivamente vermelhos. Tempo excessivo de 
exposição ao corante é a causa. 
 
 
8.5. Defeitos de confecção de lâminas 
 
a) Gotas de água - Ocorre por falha na desidratação na bateria de coloração ou por excesso 
de água nos xilóis, especialmente no xilol de montagem, ou ainda pela presença d’água no 
bálsamo do Canadá. 
b) Dobra do corte - Ocorre no momento da pescagem do material no banho-maria, e tem por 
causas a inabilidade do técnico ou água abaixo da temperatura ideal. 
 
 23 
c) Meio de montagem em excesso (entellan ou bálsamo do Canadá) - Quando se usa meio de 
montagem em excesso e que se deixa engrossar, o tecido apresenta um aparência 
nebulosa, quando observado em grande aumento. 
d) Bolhas de ar - Ocorre durante a colocação da lamínula. Evita-se fazendo leve compressão 
sobre esta, até a retirada completa das bolhas. 
e) Secagem de lâminas - A secagem deficiente (temperatura ambiente) dos cortes é 
caracterizada por uma coloração desigual do tecido. 
 
 
 
 24 
Microscópio e Microscopia 
 
I – Introdução: 
 
 O olho humano apresenta um poder de resolução de 0,1 mm. Isso significa que ele 
consegue atingir dois pontos separados por uma distância maior que 0,1mm; se a distância for 
menor, nosso olho verá apenas um ponto tremido. A maioria das células tem um tamanho menor 
que o poder de resolução do nosso olho e, por isso, necessitamos de aparelhos como os 
microscópios para aumentá-las, permitindo a sua visualização. Existem dois tipos básicosde 
microscópio: o óptico e o eletrônico. O óptico é um sistema de lentes que utiliza a luz visível, 
permite a visualização de células vivas e consegue ampliações de, no máximo, 2.000 vezes. O 
eletrônico opera com o mesmo princípio da televisão, utilizando feixes de elétrons e permite 
ampliações superiores a 200.000 vezes, mas que, por suas características de funcionamento, não 
permite a observação de células vivas. A utilização do microscópio eletrônico, a partir da década 
de 50, possibilitou o estudo dos componentes celulares de um modo revolucionário, aumentando 
muito nosso conhecimento sobre a célula. Praticamente, todas as informações sobre as estruturas 
celulares de um modo revolucionário, aumentando muito nosso conhecimento sobre a célula. 
Praticamente, todas as informações sobre as estruturas celulares – retículo endoplasmático, 
aparelho de Golgi, mitocôndrias, lisossomo, cloroplastos, ribossomos e outras – só foram 
possíveis com o uso do microscópio. Normalmente, as células são transparentes à luz e aos 
elétrons. Por isso, utilizam-se corantes para permitir a visualização das estruturas celulares e a 
observação da morfologia desses componentes. Os corantes utilizados na microscopia eletrônica, 
que funciona com feixes de elétrons. Nesta última, são usados metais pesados, densos aos 
elétrons e que produzem o contraste necessário à observações das diferentes partes da célula. 
 
 Um recurso importante na microscopia, tanto óptica quanto eletrônica, é o uso de isótopos 
radioativos, para observar o funcionamento celular. Esses compostos permitem a marcação de 
substâncias celulares, pois podem ser seguidos dentro da célula. 
 
 Tudo isso permitiu ao homem observar estruturas com ampliação maior e maior 
resolução. 
 
 
II - História do Microscópio: 
 
 A invenção do microscópio é atribuída aos holandeses Hans Janssen e Zacharias Janssen, 
fabricantes de óculos que viveram no final do século XVI. Com as suas observações eles 
descobriram que duas lentes montadas apropriadamente em um tubo, tenham capacidade de 
ampliar as imagens, permitindo a observação de objetos pequenos, invisíveis a olho nu. Contudo, 
não há registro de que os Janssen tenham utilizado este aparelho com finalidades científicas. 
 
 Cronologicamente até o século XVII conhecia-se bastante sobre os órgãos que constituem 
os seres vivos, mas não sabiam como eram organizados e constituídos (em unidades menores, as 
células) isto na época de Galileu que interessou para esse problema e fez quase um microscópio. 
 25 
 
 
 Porém, já na antiguidade havia tentativas de reforçar a visão com auxílio de dispositivos 
óticos. Nas escavações de Nínive foram encontrados pedaços de vidro usados como lentes. 
Aristóteles refere-se claramente a uma lente, e Seneca descreveu o uso de globos de vidro para 
aumentar imagens. A partir do século XIV as lentes começaram a serem usadas comumente para 
corrigir defeitos de visão e como dispositivos de aumento. 
 
 Este uso atingiu seu apogeu com Leeuwenhoek, pesquisador holandês (1632-1723) que 
provavelmente deve ser considerado o primeiro verdadeiro microscopista. Detentor de uma 
técnica extremamente desenvolvida, levou o uso do microscópio simples (uma lente ou lupa) ao 
seu nível mais alto. Seus microscópios eram individualmente feitos para cada amostra e alguns de 
seus "pequenos animais" são examinados com aumentos de 300 vezes, façanha considerável 
mesmo em comparação com alguns instrumentos modernos. 
 
 
 26 
 
Microscópios construídos por Leeuwenhoek, dotados de lente única 
 
 Leeuwenhoek foi o primeiro pesquisador a registrar suas observações. Usando os 
microscópios de sua própria construção, observou e relatou as formas e o comportamento dos 
microrganismos, sendo por isso considerado o pai da Microbiologia. 
 
 Comunicou as descobertas, por carta a Royal Society de Londres onde na descrição dizia 
que descobriu pequenos animais (os protozoários), foi o primeiro homem a ver bactérias, e na 
época considerou-se a descoberta dum 3º mundo dos microrganismos (x270). Esses animais com 
fama (1676) foram designados animálculos onde havia uma péssima imagem com lentes 
deficientes e com uma imagem pouco nítida e deformada. 
 
 O microscópio simples não é cômodo nas mãos do público em geral. Paralelamente ao 
desenvolvimento do telescópio no século XVII, surgiram os microscópios compostos, 
constituídos, no mínimo, de uma lente objetiva e de uma lente ocular. A invenção do microscópio 
composto é controvertida. A maioria dos historiadores situa sua origem na Holanda, por volta de 
1600 e mencionam Jansen ou Lippershey como inventores. Convencionemos que a verdadeira 
história do microscópio começa em 1625, ano em Giovanni Faber cunhou o termo microscópio. 
 
 Os cem anos entre 1650 e 1750 podem ser considerados como época do desenvolvimento 
mecânico do microscópio. Em 1665 surgiu o célebre microscópio de Hooke. Examinou uma 
lâmina muito fina de cortiça e coloco-a num dos 1º microscópios simples construídos, que é 
constituído por uma única lente e mais tarde associaram-se duas ou mais lentes até o microscópio 
composto simples que permitiram observações mais precisas das estruturas animais e vegetais. O 
seu aperfeiçoamento ao longo do séc. XVII permitiria um avanço no estudo dos seres vivos. Ao 
observar a cortiça com o seu microscópio composto, Hooke constatou a sua estrutura porosa 
assemelhando-se a favos de mel, usando então o termo cela (do latim cellula diminutivo de cella, 
pequeno compartimento) para designar cada uma das cavidades existentes na cortiça. Com 
relação á ciência biológica, Hooke foi um microscopista de grandes méritos. Usava, e suas 
observações, um dos melhores microscópios compostos da época e publicou seus resultados no 
 27 
livro Micrographia de 1665. Com belos desenhos de micro estruturas diversos, como esponjas, 
insetos, briozoários e até penas de aves. 
 
 Da célula Hooke viu apenas as paredes esqueléticas, sem intervir na natureza real e na sua 
individualidade. Os seus trabalhos, no entanto encorajaram outros cientistas a utilizarem o 
microscópio na observação de material biológico. A hipótese Hooke admitiu que todos os seres 
vivos são constituídos por células que eram porções de matéria que podiam ou não estar 
envolvidas por uma parede, citoplasma, núcleo. 
 
 Foi preciso 150 anos para que a noção de célula adquirisse o significado que têm hoje. 
 
 
 
 
 
 
 Este é talvez o protótipo do microscópio moderno, não só pela sua construção, mas por 
sua íntima ligação com a Micrographia, sem dúvida a mais famosa publicação de microscopia de 
sua época. 
 
 Os microscópios de Cuff representam um patamar no desenvolvimento do microscópio, 
que só foi sensivelmente ultrapassado após um século. Acompanhando o desenvolvimento da 
mecânica fina em meados de século XVIII, Cuff passa do uso da madeira e couro para o metal, e 
reúne pela primeira vez em um instrumento focalização por parafuso, platina para amostras, 
espelho para luz, transmitida e refletida, que permitem equivalência com a disposição moderna. 
E, inevitavelmente, o rococó do século XVIII não poderia ter deixado de influenciar o 
microscópio. O instrumento construído pelos Adams para o Rei George III, em prata e querubins, 
apesar de sua sofrível qualidade ótica, merece a atenção da crônica histórica. 
 28 
 
 
 A qualidade ótica dos microscópios não acompanhou o seu desenvolvimento mecânico. O 
grande problema eram as aberrações, principalmente o cromatismo. Além de só fornecer uma 
pequena imagem central adequadamente focalizada, estava envolta por um halo colorido que 
inviabilizava o estudo de detalhes. Nos cem anos entre1800 e 1900 o microscópio finalmente 
conheceu a maturação ótica correspondente ao seu desenvolvimento mecânico. Em 1747 Euler 
desenvolveu a teoria da correção cromática. No final do século XVIII surgiram as primeiras 
tentativas de lentes acromáticas, mas só em 1830 Amici e J.J.Lister avançaram substancialmente 
na sua realização. 
 
 Coube a Abbe a contestação de que "aumentos cada vez maiores só dependeriam da 
perfeição de fabricação de lentes". Seus estudos mostraram que havia uma limitação básica para a 
resolução de um sistema ótico, relacionada ao diâmetro da lente e ao comprimento de onda da 
luz. Os trabalhos de Abbe resultaram na concepção das lentes apocromáticas em 1887. Estas 
lentes oferecem padrões de qualidade até então inexistentes, principalmente depois que Abbe, 
seguindo a sugestão de J. W. Stephenson, projetou a primeira lente de grande aumento de 
imersão a óleo, ou homogênea. 
 
 A qualidade ótica final atingiu assim o seu mais alto grau no início do século XX. A 
excelente correção das lentes apocromáticas foi estendida por Boegehold a partir de 1938 às 
lentes planoapocromáticas, cujo grande campo de visão corrigida as tornam especialmente 
importantes para a microfotografia e metalografia. Mencionando ainda a introdução das camadas 
anti-refletoras, para controle da luz difusa, vemos que em meados do século XX, o microscópio 
atingiu praticamente os aumentos máximos previstos pela teoria, não sendo esperados grandes 
desenvolvimentos nesta direção. Evoluções importantes ocorreram, no entanto no projeto dos 
microscópios. 
 
 
 
 29 
III - Evolução dos microscópios: 
 
 
 
 Microscópio de Microscópio de Microscópio de Microscópio de 
 Van Leeuvenhoek Jonh Yarwell Marshall Culpeper 
 (Séc. XIV) (1680) (1715) (1725) 
 
 
 Microscópio de Microscópio do Metalógrafo Microscópio 
 Cuff Séc. XIX (Le Chatelier) Moderno 
 (1744) 
 
 
IV - O microscópio - Noções Gerais: 
 
 O olho humano tem poder de resolução de aproximadamente 0,1mm ou 100µm. Isto 
significa que se olharmos dois pontos separados por uma distância menor que 100µm, esses 
pontos aparecerão como um ponto único. Para distinguir estruturas separadas umas das outras por 
menos de 100µm, há necessidade de instrumentos ópticos que tenham poder de resolução 
aumentado. 
 
 É importante salientar a diferença entre poder de resolução e poder de aumento. Se 
ampliarmos várias vezes uma mesma fotografia comum, a imagem aumenta, mas os pontos 
separados por menos de 100µm continuarão a aparecer como um ponto só, borrado. É possível, 
 30 
portanto, aumentar a ampliação, sem, contudo melhorar a resolução. Os microscópios permitiram 
ao homem esse poder de resolução. 
 
 
 
 
A: ponto observado a olho nu 
B: o mesmo ponto observado ao microscópio 
C: o mesmo ponto observado com um aumento maior do microscópio 
 
 
 Esse é um exemplo da diferença entre poder de aumento e de resolução. O mesmo ponto 
observado a olho nu não permite distinguir que ele é formado por quatro pontos distantes entre si 
menos de 100µm. Quando esse ponto é observado ao microscópio, já é possível distinguir os 
quatro pontos simplesmente aumentados de tamanho, não sendo possível saber se cada um deles 
é formado por um conjunto de pontos menores, distanciados entre si, abaixo do poder de 
resolução do microscópio. 
 
Transição de A para B = maior aumento e maior resolução. 
Transição de B para C = maior aumento, sem aumentar a resolução. 
 
 Ampliação e resolução são frequentemente usadas no estudo biológico de célula. 
Ampliação é uma relação da amplificação (ou redução) de uma imagem, normalmente se 
expressa como X1, X1/2, X430, X1000, etc. 
 
 Resolução é a habilidade para distinguirmos entre dois pontos. Geralmente a resolução 
aumenta com ampliação, embora haja pontos onde você aumenta a ampliação pelo aumento no 
ganho da resolução. 
 
 Normalmente as medidas em microscopia são indicadas no sistema métrico. Unidades 
gerais que você encontrará em seus estudos de biologia incluem micrometro (µm, 10
6
m), 
nanômetro (nm, 10
9
m), e angstrom (Å, 10
10
m). 
 31 
 
 
 O limite de resolução dos microscópios ópticos é melhor que o olho humano cerca de 500 
vezes. Não se consegue construir microscópios ópticos com desempenho melhor que este, pois o 
fator limitante é o comprimento da onda da luz. 
 
 Com o advento do microscópio eletrônico, o poder de resolução foi aumentado cerca de 
1000 vezes em relação ao microscópio óptico. 
 
 Os microscópios eletrônicos têm limite de resolução próximo de 2Å, cerca de 500000 
vezes maior que o do olho humano. 
 
 Para fazer uso do microscópio e medir as células ou suas pequenas estruturas internas é 
necessário empregar unidades de medidas especiais, menores do que as que usamos no mundo 
macroscópico. A unidade mais utilizada no mundo é o metro. Sua comodidade resulta do fato de 
ser próxima do tamanho de objetos com os quais lidamos cotidianamente. Entretanto temos 
grandezas maiores ou menores, o primeiro múltiplo é o quilometro (10
3
m) e a primeira 
subdivisão é o milímetro (10
3
m). Algumas subdivisões também muito empregadas são o 
centímetro (10
-2
m) e o angstrom (Å=10
-10
m). 
 
 Milímetro -> 10-3m (mm) 
 Micrometro -> 10-6m( m) 
 Nanômetro -> 10-9m (nm) 
 Angstrom -> 10-10m (Å) 
 Picômetro -> 10-12m (pm) 
 
 
 
 32 
V - Tipos de microscópios: 
 
 
 
 
Microscópio Óptico: 
 
 Os microscópios de luz ou ópticos modernos são descendentes do microscópio composto 
usado por Robert Hooke. Podem, também ser chamados microscópios fotônicos (do grego 
photo.= luz), pois utilizam luz em seu funcionamento. Esses aparelhos possuem dois sistemas de 
lentes de vidro ou cristal (ocular e objetiva) e fornecem ampliações da imagem geralmente entre 
cem e mil vezes. 
 
 O físico francês De Broglie em 1924 descobriu que os elétrons possuíam uma natureza 
ondulatória e que as radiações ultravioletas tinham menor comprimento de onda. Assim sendo na 
década de 30 o Prof. E. Ruska em 1933 constrói o 1º microscópio eletrônico que na sua natureza 
é bastante volumoso e complexo, tendo uma mesa com todos os comandos incluindo um monitor 
e com um tubo metálico com vários metros de comprimento. 
 
 Este aparelho fornece imagens ampliadas dos objetos, permitindo, portanto a observação 
de estruturas invisíveis à vista desarmada. Havia vários defeitos nestes microscópios no princípio 
do séc. XIX à nível de acromatismo e esfericidade que atualmente já foram corrigidos com uma 
 33 
associação de lentes fabricados com matérias especiais para esse fim, e as imagens têm vindo a 
ser mais nítidas e cada vez mais pormenorizado. 
 
 Atualmente, o microscópio óptico composto é constituído por duas partes – uma parte 
mecânica e uma parte óptica. Cada parte engloba uma série de componentes constituintes do 
microscópio 
 
 
ESTRUTURA DO MICROSCÓPIO ÓPTICO 
 
 
 
 
 
Parte mecânica: 
 
 A parte mecânica serve para dar estabilidade e suportar a parte óptica, e é constituída por: 
 Pé ou Base – suporta o microscópio, assegurando a sua estabilidade. 
 Braço ou Coluna – peça fixa à base, na qual estão aplicadas todas as outras partes 
constituintes do microscópio. 
 Tubo ou Canhão – cilindroque suporta os sistemas de lentes, localizando-se na 
extremidade superior a ocular e na inferior o revólver com objetivas. 
 34 
 Platina – peça circular, quadrada ou retangular, paralela à base, onde se coloca a 
preparação a observar, possuindo no centro um orifício circular ou alongado que 
possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador. 
 Parafuso Macrométrico – engrenagem que suporta o tubo e permite a sua deslocação a da 
platina. É indispensável para fazer a focagem. 
 Parafuso Micrométrico – imprime ao tubo ou à platina movimentos de amplitude muito 
reduzida, completando a focagem. Permite explorara a profundidade de campo do 
microscópio. 
 Revólver – disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivas de 
diferentes ampliações: por rotação é possível trocar rápida e comodamente de objetiva. 
 
Parte óptica: 
 
 A parte óptica é constituída por: 
 Sistema de Oculares e Sistema de Objetivas – o conjunto de lentes que permitem a 
ampliação do objeto. A ampliação dada ao microscópio é igual ao produto da ampliação 
da objetiva pela ampliação da ocular. 
 Fonte Luminosa – existem vários tipos de fontes luminosas (fig. 3), podendo ser uma 
lâmpada (iluminação artificial), ou um espelho que reflita a luz solar (iluminação natural). 
Os dois tipos de iluminação têm virtudes e defeitos, mas destinam-se os dois à iluminação 
da preparação, possibilitando assim a sua visualização. 
 Condensador – distribui regularmente, no campo visual do microscópio, a luz refletida 
pelo espelho. 
 Diafragma – regula a intensidade luminosa no campo visual do microscópio. 
 
 Devido a estes componentes serem de alta precisão e porque o microscópio é um 
instrumento caro, requer cuidados especiais de transporte, utilização e manutenção. 
 
 Neste microscópio o tipo de radiação é a luz natural ou artificial, e as amostras podem ser 
constituídas por animais vivos ou mortos, tecido montado em material transparente, lâminas e 
lamínulas de vidro, sobrepostas umas nas outras geralmente com amostras finíssimas. Lentes em 
geral de vidros 
 
 Diafragma é um dispositivo mecânico que serve para diminuir ou aumentar e evitar a 
incidência da luz que dificulta a observação de amostras muito finas e fica situado debaixo da 
plataforma e que serve de mediador entre a luz que vem do espelho ou lâmpada até ás amostras. 
A imagem transmitida é geralmente colorida. 
 
 No microscópio óptico, a luz proveniente do objeto observado atravessa as lentes objetiva 
e ocular e chega ao olho do observador, onde se forma a imagem ampliada. Se empregarmos, por 
exemplo, uma lente ocular que amplie dez vezes e urna lente objetiva que amplie cem vezes, o 
valor final da ampliação será de mil vezes (o aumento da ocular multiplicado pelo aumento da 
objetiva). 
 
 
 
 35 
CARACTERÍSTICAS DA IMAGEM 
 
 O objeto a ser observado deve ser colocado muito perto do foco objeto do sistema da 
objetiva, para que se forme uma imagem real, invertida, de maiores dimensões, que vai servir de 
objeto em relação à ocular. Esta dá uma imagem virtual, invertida (nos dois sentidos) em relação 
ao objeto a ser observado, que deve formar-se entre o ponto próximo e o ponto remoto do olho do 
observador, ou seja, virtual. 
 
 
 
 
 Para movimentar a imagem para outras posições deve-se deslocar a lamina sempre no 
sentido oposto a que queremos ir (mas atualmente há parafusos especiais na plataforma, e com 
precisão para esse fim, ou seja, para movimentar a amostra) (e ainda existem atualmente 
parafusos micrometros para visualizar nitidamente no mesmo plano, e parafuso macrômero para 
focar a imagem). 
 
 A partir da observação de uma qualquer imagem ao microscópio, pode-se reparar que 
como em sequência desta ser invertida, a imagem para se deslocar num determinado sentido, a 
preparação tem que se deslocar em sentido oposto. 
 
 Se a objetiva fornecer uma imagem defeituosa – com aberrações cromáticas, esféricas eu 
com cortadura do campo – a ocular vai ampliar as imperfeições dessa imagem. Estes defeitos do 
 36 
sistema óptico combatem-se com sistemas de lentes, algumas das quais com papel corretor, de 
modo que, as imagens sejam nítidas, planas e com pormenores bem separados. 
 
 Neste microscópio a ampliação e o campo de visualização são inversamente 
proporcionais, ou seja, quanto maior for a ampliação, menos a área da preparação observada. O 
contrário também se verifica. A ampliação é feita através de dois sistemas de lentes de ampliação 
(objetivas e oculares) suportadas por uma série de peças mecânicos que permitem uma utilização 
prática desse aparelho. 
 
 As objetivas são formadas por uma associação de lentes inseridas num suporte metálico e 
têm uma escritura na parte externa com o seu poder resolvente e de ampliação. 
 
 A ampliação proporcionada pelo microscópio óptico deve-se em geral a uma conjugação 
do poder de sistemas de objetivas e do sistema ocular a ser usado; exemplo: 40 x ocular, 120 x 
objetivas= 40 x 100= 400 vezes de ampliação. Normalmente a ampliação tem limites, e se usar 
ampliações muito grandes as imagens começam a perder qualidade. 
 
 O poder resolvente é calculado com os parâmetros: 
1. O comprimento de ondas eletromagnéticas de luz radiada que é limita do (luz visível entre 
400nm a 700nm ou 0.01 um de comprimento) é limitado para esse microscópio, e que é 
calculada através da velocidade da luz 300000 m\s sobre o tempo de uma onda. 
2. NA objetivas e NA condensador = que são aberturas numéricas da objetiva e do 
condensador, onde NA é uma característica especifica do sistemas de lentes. 
Ex: NA = n. sen #, n = índice de refração, # formado pelo eixo óptico. 
 
 
 Poder Resolvente = comprimento de onda da luz visível 
 NA objetivas + NA condensador 
 
Sendo assim o poder de resolução máxima é de 200 - 250 nm e o aumento máximo é de 
1500x. 
 
 
PROFUNDIDADE DE CAMPO: 
 
 Quando se utiliza o microscópio, pode-se observar preparações com três dimensões, ou 
seja, com largura, comprimento e profundidade. 
 
 A preparação observada continha dois cabelos cruzados, de modo que não se encontravam 
num plano comum: um encontrava-se num plano mais abaixo que o outro. Esta diferença de 
planos não se conseguiria detectar a olho nu, mas quando a preparação é observada ao 
microscópio, são constatáveis algumas consequências dessa diferença de planos. 
 
 Quando se observa nitidamente um certo plano, aqueles que se encontrarem acima ou 
abaixo plano focado ficam desfocados, apenas se conseguindo ver de modo pouco nítido. Isto 
significa que o campo do microscópio tem, também, uma certa profundidade, não sendo possível 
focar simultaneamente dois planos diferentes. 
 37 
 
 
 
 Como se sabe, a profundidade de campo do microscópio é muito pequena, o que implica, 
que os objetos examinados ao microscópio devem ser de pequena espessura. 
 
 A operação de focagem é tanto mais delicada quanto menor for a distância focal do 
sistema, ou seja, quanto maior for a ampliação, mais delicada será a focagem e menos nítido 
ficará o plano que não estiver focado. Devido a isto, é importante que, durante a observação, se 
proceda a uma manobra constante do parafuso micrométrico de modo a poder-se visualizar 
nitidamente pormenores nos diferentes planos, visualizando todos os campos existentes, um de 
cada vez. 
 
 
 
RELAÇÃO ENTRE A ÁREA OBSERVADA E A AMPLIAÇÃO UTILIZADA: 
 
 A medida do campo do microscópio pode ser feita com a ajuda de micrômetros de 
objetiva ou de ocular. Na sua falta, o papel milimétrico permite medir, aproximadamente, o 
campo do microscópionas diferentes ampliações realizadas pelas lentes incorporadas em alguns 
componentes (fig. 6). 
 
 A área da superfície observada através do microscópio composto é sempre relativamente 
restrita e depende da ampliação utilizada. A área do material observado varia na razão inversa da 
ampliação que se utiliza. Deste modo, pode-se relacionar a área da superfície com as ampliações 
através da relação: 
 
 
A 1 – ampliação mínima A 2 – ampliação média 
 
 Para ampliações maiores, a área observada é apenas de uma fracção do milímetro. A 
redução progressiva da área observada é, no entanto, acompanhada de um aumento de detalhes. 
As maiores ampliações permitem a observação de áreas restritas, mas revelam pormenores não 
 38 
detectados com pequenas ampliações. Torna-se, portanto desnecessária a montagem de grandes 
fragmentos para observação microscópica. Também objetos de dimensões superiores às da área 
do campo não podem ser completamente abrangidos. 
 
 
 
 
 Pode-se então concluir que se deve iniciar a observação microscópica utilizando pequenas 
ampliações, que permitam captar uma ideia de conjunto. A preparação deve ser percorrida nos 
vários sentidos a fim de se localizar a zona de maior interesse. Dessa zona seleciona-se os 
elementos de maior importância, centrando-os, e só depois se deve passar a objetivas de poder 
ampliador maior. Estas permitirão observar detalhadamente os pormenores desejados da 
preparação em causa. 
 
 
TIPOS DE MICROSCÓPIO COMPOSTO 
 
1. Microscópio de campo luminoso: 
As amostras podem ser coradas ou não, exemplo: bactérias coradas, servem para 
determinação de elementos morfológicos. Aumento 1000-2000 vezes todos os m. 
compostos. 
2. Microscópio de campo obscuro: 
Amostras não coradas e utilizam-se lentes que desviam raios luminosos onde aparece 
iluminado as amostras com fundo escuro e os microrganismos vão exibir alguns dados 
morfológicos característicos em estado vivo e em suspensão liquida. 
3. Microscópio de luz ultravioleta: 
Utiliza como fonte de luz as radiações ultravioletas onde é vantajoso nas radiações 
visíveis e de condições de visibilidade e podem ser em amostras coradas e não coradas e 
podem ser fotografadas e diferenciam-se os componentes e estruturas intracelulares com 
maior ou menor absorção das diferentes partes através da luz ultravioleta. 
4. Microscópio de contraste de fases: 
 39 
Desviam-se raios luminosos com uma grande intensidade, com vários graus de brilho, e 
fazem-se exames de estruturas celulares em células vivas de microrganismos maiores: 
leveduras, algas, protozoários e bactérias. 
5. Microscópio de fluorescência: 
Brilhante e corado por cor fluorescente e usa-se para técnicas diagnósticas com diferentes 
organismos e com diferentes fluorescências onde vai revelar a sua própria identidade 
como microrganismo. 
 
 
A PREPARAÇÃO DE MATERIAL BIOLÓGICO PARA M. ÓPTICO: 
 
 Deve ser feita temporariamente ou esporadicamente ou de preparação definitiva, e deve-se 
ser de pequena espessura e é colocada sobre a lamina, mergulhando sobre soluções aquosas à 
ocasião. Ou também “in vivo” meio normal de vida das células e com solução de Ringer. 
 
 Há coloração especificada para ver diferentes e especificadas organelas citoplasmáticas. 
 
 Podem ser os processos: 
1. Colheita 
2. Fixação 
3. Desidratação 
4. Inclusão 
5. Corte 
6. Colagem 
7. Desparafinação 
8. Montagem. 
 
 
VANTAGENS DO MICROSCÓPIO COMPOSTO ÓPTICO 
 
 Maior poder separador ou de resolução, ou seja, capacidade de distinguir X do Y aos 
pormenores. 
 
 Quanto à luz, menor for o comprimento de onda maior é o poder resolvente do 
microscópio e o de luz ultravioleta melhora extraordinariamente as qualidades da imagem quanto 
aos pormenores. 
 
 
Microscópio Eletrônico: 
 
 No microscópio eletrônico de Transmissão se observa a projeção de uma fatia muito fina 
do material. Tem alta resolução e as imagens obtidas mostram uma riqueza de detalhes 
surpreendente. 
 
 40 
 
 
 Os elétrons são produzidos graças ao aquecimento no vácuo de um filamento, o catodo, 
que então emite elétrons. Essas partículas são aceleradas devido a uma diferença de potencial de 
60 a 100kV existente entre o filamento e o anodo, uma placa perfurada que forma um feixe de 
elétrons. Esse feixe é defletido por lente eletromagnéticas, de maneira parecida ao que acontece 
com a luz no microscópio óptico. O condensador focaliza o feixe de elétrons no plano do objeto, 
e a objetiva forma uma imagem do objeto. Esta imagem é ampliada por uma ou duas que 
projetam (lentes projetoras) a imagem sobre uma tela fluorescente ou um filme fotográfico. 
 
 Devido ao fato de serem os elétrons facilmente desviados pelo objeto, torna-se necessário 
utilizar cortes muito finos de tecidos. Para isso, foi necessário desenvolver métodos especiais de 
microtomia. 
 
 No microscópio óptico a luz é absorvida pelas estruturas coradas, no eletrônico os elétrons 
são desviados por poções do objeto que contenham átomos de elevado peso atômico. O resultado 
é que as estruturas que desviam os elétrons aparecem escuras na tela fluorescente e são chamadas 
de elétron-densas. A capacidade de desviar os elétrons depende do número atômico, por isso se 
costuma impregnar os cortes de tecidos com metais pesados a fim de aumentar o contraste, 
resultando assim uma imagem nítida e bem visível. 
 
 O microscópio eletrônico basicamente em: 
a) Canhão eletrônico com a fonte de elétrons (fio aquecido), que podem ser acelerados em 
potenciais em geral de 20 até 100kV. 
b) Sistema elétrico para suprir as tensões e correntes do aparelho. 
c) Lentes magnéticas, que são bobinas para produzir um campo magnético atuante sobre os 
elétrons, tendo um efeito semelhante ao de uma lente comum para a luz. 
d) Sistema de bombas para produzir alto vácuo e permitir que os elétrons migrem pelo tubo 
do aparelho, além de evitar a combustão do filamento pelo oxigênio do ar. 
e) Tela fluorescente para produzir uma imagem final visível, quando atingida pelos elétrons. 
 
 41 
 Mais recentemente, na década de 1960, surgiu o chamado microscópio eletrônico de 
varredura, cuja aplicação está na observação da superfície dos materiais. Nesse aparelho, a 
superfície do material é varrida ponto a ponto por um feixe de elétrons. 
 
 Nesse tipo de microscópio, entre a lente eletromagnética e o objeto, é interposta uma 
bobina de varredura. Essa bobina provoca um desvio do feixe de elétrons, de tal modo que o 
mesmo vai incidir sobre o objeto ponto por ponto, numa sequência de determinada. O objeto, por 
sua vez, não se deixa atravessar pelo feixe eletrônico, devido a sua espessura e a uma cobertura 
feita por evaporação de metal pesado sobre sua superfície. 
 
 Desse modo, o feixe de elétrons que incide sobre o objeto (chamado feixe primário) sofre 
reflexões, originando elétrons secundários, os quais são captados por detectores especiais que 
geram um sinal elétrico, transferido para um monitor de vídeo. 
 
 
 
 Microscópio eletrônico de varredura 
 
 
 
 42 
 Uma comparação entre os microscópios ópticos e eletrônicos de transmissão e de 
varredura. 
 
 
 
 
 
VI – Microscopia: 
 
 “Microscopia é a arte de observar através e com o microscópio, ou seja, um conjunto de 
conhecimentos que se obtêm no estudo dos objetos microscópicos.” (Rui Freitas) 
 
 
6.1- OS PRINCÍPIOS DA MICROSCOPIA: 
 
 Existe uma limitação física, relacionada com a radiação utilizada, para a menor distância 
entre dois pontos que permite distingui-los separadamente. A esta distância chama-se "limite de 
resolução", e um aumento maior nãorevelará nenhum detalhe adicional da estrutura. O elemento 
fundamental para a formação de uma imagem ampliada é a lente. Seu entendimento básico é pela 
 43 
chamada ótica geométrica, onde consideramos a luz como constituída de raios, que obedecem às 
leis da reflexão e da refração. As lentes comuns, baseadas em elementos esféricos, são no entanto 
sujeitas a defeitos que independem da qualidade de sua fabricação, denominados de aberrações. 
Dentre estas, as mais importantes são a aberração esférica e a aberração cromática. A aberração 
esférica determina que raios axiais que atravessam a lente próxima de seu eixo ótico são 
focalizados em um ponto diferente daquele dos raios que passam pela periferia. Este defeito é 
inerente a uma lente esférica, e para uma lente isolada, só pode ser minimizado através da 
diminuição de seu diâmetro, ou seja, utilizando apenas raios paraxiais. A aberração cromática 
refere-se ao comportamento com luz branca, que, como sabemos, é constituída da soma de todas 
as cores do espectro luminoso. A distância focal de uma lente depende da cor da luz; e, portanto 
raios de cores diferentes serão focalizados em pontos diferentes. 
 
 Estes defeitos se agravam à medida que usamos uma lente mais "forte", ou seja, com 
maiores aumentos. Foi com o objetivo de minimizar esta dificuldade que surgiu o microscópio 
composto, onde, pelo aumento sucessivo de duas lentes, obtemos o mesmo aumento atingido por 
uma só lupa. A qualidade da imagem fornecida pelo conjunto, por exemplo, de 5 X x 10 X será 
muito melhor do que a obtida por uma lente de 50 X. Estas aberrações podem ser largamente 
controladas caso utilizemos, ao invés de lentes simples, combinações de lentes de diversos perfis 
e com vidros de diferentes índices de refração. Da mesma maneira que em fotografia, dispomos 
para microscopia de lentes com complexidade, preço e qualidades crescentes. 
 
 Os mais importantes avanços foram obtidos no século XIX, com as lentes acromáticas e 
apocromáticas. Existe outro comportamento da luz que não pode ser interpretado pelas leis da 
ótica geométrica: é a difração, que exige que consideremos a luz como constituída de ondas 
transversais que se propagam no espaço. 
 
 Durante o século XIX, procurou-se aumentar o poder de resolução das lentes e dos 
microscópios pela construção de lentes cada vez mais perfeitas, na suposição de que isto levaria a 
aumentos crescentes, e supostamente, ilimitados. Em 1880, Abbe demonstrou que na verdade a 
resolução de uma lente era limitada por difração, dependendo de sua abertura e do comprimento 
de onda da luz, segundo: 
 
d = 0.61 l / n . sen a, 
 
onde l é o comprimento de onda da luz, n o índice de refração do meio, e a o ângulo de abertura 
da lente. Este resultado pode ser considerado um dos mais importantes, senão a fórmula 
fundamental da microscopia. Para que haja formação de uma imagem, precisamos também de 
"contraste". Denominamos de contraste a capacidade de distinguir traços característicos da 
estrutura sobre o plano de fundo. Além da simples absorção ou reflexão de energia pela amostra 
existem vários outros mecanismos de geração de contraste em microscopia. Tudo isto resulta da 
interação entre a luz, objetos e lentes, e, portanto, com a matéria. No entanto, costuma-se estudar 
esta interação de maneira mais geral, analisando o efeito de todo o espectro eletromagnético 
sobre a matéria incluindo o efeito de um feixe de elétrons. 
 
 De um modo geral, uma excitação incidente desencadeará na matéria uma resposta, dita 
um sinal, que podemos adquirir por um sensor adequado. No caso especial de ocorrer a excitação 
 44 
por um feixe de elétrons acelerados, verifica-se a ocorrência de múltiplos sinais. Dois exemplos 
são bem conhecidos de todos: a imagem luminosa de um tubo de televisão, e a radiação emanante 
de um tubo de raios-X. 
 
 
6.2 - O ADVENTO DA MICROSCOPIA ELETRÔNICA: 
 
 No começo do século XX, a microscopia ótica havia atingido o limite de resolução 
previsto pela teoria de Abbe. Uma vez que a qualidade das lentes não oferecia mais escopo para 
progresso, o único caminho para conseguir maior resolução seria através da utilização de 
radiações com menor comprimento de onda. Em 1924 de Broglie formulou sua postulação da 
dualidade onda-partícula para elétrons, que lhes atribuía um comprimento de onda equivalente a 
 
l = h / 2 m v &nbspou l = ( 150 / V )
-1/2 
 
onde l é o comprimento de onda, V a tensão de aceleração dos elétrons , h a constante de Planck e 
m, v a massa e velocidade dos elétrons. Portanto, a aceleração de elétrons a algumas dezenas de 
milhares de volts resulta em comprimento de onda da ordem de angstroms, da ordem das 
dimensões atômicas. 
 
 A carga dos elétrons determina que sejam influenciados por campos magnéticos e 
eletrostáticos, que possibilita a construção de lentes. Em 1926 Busch descreveu a teoria básica de 
lentes eletrostáticas, logo em seguida complementada pela descrição das lentes magnéticas. A 
possibilidade de construção de um microscópio eletrônico foi imediatamente percebida por 
diversos pesquisadores, principalmente de grupos em Berlin, empenhados na construção de 
osciloscópios de raios catódicos. Dentre estes, Knoll e Ruska tomaram a dianteira, e rapidamente 
desenvolveram o instrumento a ponto de superarem, pela primeira vez em 1931, a resolução do 
microscópio ótico. Durante a década de '30, o instrumento conheceu sucessivos 
aperfeiçoamentos, e à véspera da 2a. Grande Guerra, iniciava sua comercialização pela firma 
Siemens. 
 
 A disposição do microscópio eletrônico de transmissão é semelhante ao do microscópio 
biológico, incluindo uma fonte de radiação, lentes condicionadoras do feixe, a amostra 
transparente aos elétrons, e aumento da imagem através de sucessivos estágios de lentes. As 
peculiaridades devidas ao uso de elétrons são a necessidade de estabelecer vácuo em todo o 
percurso dos elétrons, amostras muito finas, e aquisição da imagem por filmes ou telas 
fluorescentes. 
 
 A necessidade de dispor de amostras transparentes aos elétrons determinou o avanço da 
aplicação biológica em relação à metalurgia. Inicialmente o exame de materiais foi restrito ao uso 
de réplicas da superfície; foi só após 1955, quando Heidenreich obteve pela primeira vez lâminas 
finas da ordem de 100 nm, transparentes aos elétrons, que a estrutura interna de metais pode ser 
examinada. 
 
 O MET possibilita a obtenção de dois tipos principais de informações: morfológicas, e no 
caso de amostras cristalinas, cristalográficas. 
 45 
 
 A absorção, de maior importância no caso de amostras biológicas ou amorfas, 
corresponde em princípio ao contraste de amplitude na microscopia ótica, e resulta da absorção 
diferenciada de elétrons por diversas regiões da amostra, seja por variação de espessura, seja por 
interação com átomos de maior ou menor número atômico. No caso da microscopia de materiais, 
este mecanismo surge como importante no caso do exame de réplicas. O contraste de fase resulta 
da interação entre feixes que percorrem regiões adjacentes da amostra, e entre as quais haja 
diferenças de fase provocadas por variações de espessura, estrutura cristalina, etc.; notar no 
entanto que a origem clássica do contraste de fase em microscopia ótica, baseada na variação de 
índice de refração, não tem equivalente no microscópio eletrônico de transmissão. O estudo da 
interação entre a radiação e a matéria indica uma variação de intensidade periódica com a 
espessura da amostra, e com sua estrutura cristalina. Este contraste pode ser exemplificado pela 
observação de defeitos de empilhamento em cristais. Finalmente, uma vez que o comprimento de 
onda