Fisiologia Nutrição e Crescimento Bacteriano

Prévia do material em texto

*
*
Prof Maneco
Fisiologia Bacteriana
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Microbiologia e Parasitologia
Microbiologia Básica 
*
*
Fisiologia bacteriana
	 É necessário o conhecimento da fisiologia, bioquímica e nutrição microbiana para compreender os efeitos do mundo microbiano na saúde humana.
 Necessidades energéticas e nutricionais;
 Crescimento bacteriano;
 Metabolismo bacteriano.
*
*
Nutrição Bacteriana
		O crescimento e a divisão celular necessitam de um ambiente propício com todos os constituintes físicos e químicos para o seu metabolismo.
Pseudomonas spp. (mais flexíveis)
Treponema spp. e Porphyromonas spp. (mais exigentes)
*
*
Estrutura Bacteriana
macromoléculas
(proteínas, ácidos nucléicos)
Os precursores das macromoléculas podem ser retirados do meio ambiente ou ser sintetizados pelas bactérias a partir de compostos mais simples.
As substâncias ou elementos retirados do ambiente e usados para construir novos componentes celulares ou para obter energia são chamados nutrientes.
NUTRIENTES Macronutrientes
				 Micronutrientes
*
*
Macronutrientes
Carbono
Oxigênio
Hidrogênio
Nitrogênio
Enxofre
Fósforo
Macronutrientes:
São requeridos em grandes quantidades por serem os principais constituintes dos compostos orgânicos celulares e/ou serem utilizados como combustível.
*
*
CARBONO:
Presente na maioria das substâncias que compõem a célula.
Autotróficas: bactérias que utilizam o carbono inorgânico na forma de CO2 ou carbonatos como única fonte de energia.
Heterotróficas: bactérias que utilizam o carbono orgânico na forma de carboidratos como única fonte de energia.
*
*
OXIGÊNIO:
é requerido na forma molecular como aceptor final na cadeia de transporte de elétrons aeróbica.
é elemento importante em várias moléculas orgânicas e inorgânicas.
HIDROGÊNIO:
componente muito freqüente da matéria orgânica e inorgânica.
elemento comum de todo material celular.
*
*
NITROGÊNIO:
componente de proteínas e ácidos nucléicos, além de vitaminas e outros compostos celulares.
disponível na natureza sob a forma de gás (N2) ou na forma combinada.
Sua utilização como N2 é restrita a um grupo de bactérias cujo principal habitat é o solo.
Na forma combinada, o nitrogênio é encontrado como matéria inorgânica (NH3 , NO3-) ou matéria orgânica: aminoácidos, purinas e pirimidinas.
*
*
ENXOFRE:
faz parte de aminoácidos (cisteína e metionina), de vitaminas e grupos prostéticos de várias proteínas importantes em reações de óxido-redução.
pode ser encontrado no ambiente nas formas elementar,oxidada e reduzida; estas duas últimas aparecem como compostos orgânicos e inorgânicos.
os sulfatos (SO4-2) inorgânicos ou os aminoácidos são as formas preferencialmente assimiladas.
na forma oxidada, pode ser aceptor final de elétrons das cadeias de transporte de elétrons anaeróbicas.
*
*
FOSFÓRO:
É encontrado na célula na forma combinada a moléculas importantes como os nucleotídeos (ATP, CTP, GTP, UTP, TTP) e como fosfato inorgânico.
As substâncias fosforiladas podem estar envolvidas com o armazenamento de energia (como o ATP) ou atuar como reguladoras de processos metabólicos: muitas enzimas tornam-se ativas ao serem fosforiladas.
*
*
Micronutrientes
Ferro
Magnésio
Cálcio
Manganês
Zinco
Potássio
Sódio
Cobre
Cobalto
Selênio
 Micronutrientes: 
*
*
 Micronutrientes: 
 São encontrados sempre na forma inorgânica;
 Fazem parte de minerais.
	Necessários ao desenvolvimento microbiano em quantidades variáveis, dependendo do microrganismo e do elemento.
Funções: - componentes de proteínas;
 - co-fatores de enzimas;
 - componentes de estruturas;
 - osmorreguladores.
		
*
*
 Requisitos para o bom crescimento dos microrganismos:
 
Condições de cultivo;
Meios de Cultura
Fatores de crescimento;
Químicos
Físicos
*
*
FATORES NECESSÁRIOS PARA O CRESCIMENTO - FATORES FÍSICOS: 		temperatura 		pH 		pressão osmótica (concentração de sal) 		 						 - FATORES QUÍMICOS: 		água 		fontes de carbono e nitrogênio 		minerais 		oxigênio 		fatores orgânicos	
*
*
Condições de cultivo
incubá-los em meios de cultura adequados;
incubá-los em condições ambientais igualmente adequadas;
*
*
Condições de cultivo
Inóculo: 
	É uma amostra de material contendo geralmente uma pequena quantidade de microrganismos; 
	Obedecidas as condições citadas, os microrganismos contidos no inóculo multiplicam-se, aumentando em número e massa e, com isto, atingindo o objetivo desejado.
*
*
Meios de cultura
 Meio de cultura é uma mistura de nutrientes necessários ao crescimento microbiano.
 Basicamente deve conter a fonte de energia e de todos os elementos imprescindíveis à vida das células.
*
*
Tipos de meio de cultura
Qualitativo
Composição simples: 
	Um único carboidrato como fonte de energia, carbono e sais minerais.
Composição complexa: 
	Várias fontes de carbono e energia, vitaminas e aminoácidos, sangue ou soro de animais.
*
*
Tipos de meio de cultura
Quantitativo
Meio de cultura deve obedecer aos limites de quantidade de cada componente suportáveis pelos microrganismos.
Meio de cultura deve conter substâncias para neutralizar a ação de produtos tóxicos lançados pelos próprios microrganismos, que sofrem os efeitos de seu acúmulo.
Adição de tampões para impedir a queda de pH provocada pelos ácidos orgânicos produzidos por fermentação bacteriana
*
*
Formulação de um meio de cultura:
	Considerar:
Tipo nutritivo do microrganismo
 Fonte de energia
 Luz ou substância química
 Substrato doador de elétrons
 Orgânico ou inorgânico
 Fonte de carbono
 Orgânica ou inorgânica
*
*
Formulação de um meio de cultura:
	Considerar:
Necessidades específicas:
 Grupo 
 Família
 Gênero 
 Espécie
*
*
Formulação de um meio de cultura:
	
	Acrescentar
 Compostos não sintetizados pelos microrganismos que se deseja cultivar;
 Vitaminas
 Cofatores
 Aminoácidos
*
*
Meio seletivo: 	Favorece o crescimento de uma determinada bactéria de interesse, impedindo o crescimento de outras bactérias. 
Ex: ágar Sabouraud dextrose, pH 5,6, é utilizado no crescimento de fungos que são favorecidos, em relação as bactérias, pelo baixo pH. 
*
*
Meios seletivos
*
*
*
*
 Meio diferencial: 
Facilita a identificação de um determinado organismo. 
Ex: meio ágar-sangue, utilizado para a identificação de bactérias capazes de destruir células sangüíneas (anel claro em torno da colônia). 
*
*
Meio diferencial
*
*
Agar tríplice ferro açucar (TSI) 
*
*
 Meio de enriquecimento: 	Favorece o desenvolvimento de uma população bacteriana que esta em desvantagem entre outras populações. 
Ex.: Caldo Tetrationato → Salmonella
 Agar chocolate
*
*
 Meios Redutores: 	Meios com reagentes, como o tioglicolato de sódio, que é capaz de se combinar com o oxigênio dissolvido eliminando este elemento do meio de cultura (específico para microrganismos anaeróbicos).
*
*
Transporte
 Cary Blair
 Solução salina tamponada
Conservação
 Skim milk
*
*
Estado Físico
Líquidos: quando são uma solução aquosa de nutrientes.
Sólidos: quando a solução aquosa é gelificada por um polissacarídeo extraído de algas, o ágar. Usado para separar células.
Semi-sólidos: menor concentração de ágar
*
*
Fatores de crescimento
Exigências nutricionais das bactérias heterotróficas:
Algumas crescem em meio muito simples:
solução de glicose, sal de amônio e alguns sais minerais
	A partir desses compostos,sintetizam todos os componentes do protoplasma: proteínas, polissacarídeos, ácidos nucléicos,coenzimas, etc.
*
*
Fatores de crescimento
Exigências nutricionaisdas bactérias heterotróficas:
Outras, são incapazes de sintetizar determinados compostos orgânicos essenciais para o seu metabolismo. 
Para que estes microrganismos possam crescer, tais compostos devem ser obtidos do meio natural ou artificial em que vivem. 
Essas substâncias são denominadas fatores de crescimento.
*
*
Influência de fatores ambientais
	A tomada de nutrientes e posterior metabolismo são influenciados por fatores físicos e químicos do meio ambiente.
 
temperatura; 
pH; 
presença de oxigênio;
pressão osmótica; 
luz;
*
*
Classificação: - psicrófilas – 12 e 17 ºC;
 - mesófilas – 28 e 37 ºC;
 - termófilas – 57 e 87 ºC.
	Temperatura:
 Temperatura ótima: máximo desenvolvimento
 Temperaturas superiores: desnaturação do material celular
			 	 morte da célula
 Temperaturas inferiores: desaceleração das reações metabólicas
			 diminuição da velocidade de multiplicação celular
*
*
Curva de crescimento característica de diferentes microrganismos.
*
*
Temperatura
*
*
 
		
Psicrófilos:	temperatura ótima: 15 °C 		encontrados em oceanos e regiões da Ártica
		não causam problemas na preservação de alimentos
Psicrotróficos: 	temperatura ótima: 20 a 30 °C 		crescem em temperatura de refrigeradores (4 °C)
		encontrados em alimentos estragados
Mesófilos:	temperatura ótima: 25 a 40 °C (mais encontrados) 
		corpo de animais (temperatura da pele)
		bactérias patogênicas: temp. ótima 37 °C 		degradam alimentos e são patogênicos
Termófilos: 	temperatura ótima: 50 a 60 °C
		ambiente de águas termais (***não crescem em temp.
							 < 45 °C)	
		material estocado (altas temp.) = compostagem
Área de Alimentos
*
*
 pH
 Os valores de pH em torno da neutralidade são os mais adequados para absorção de alimentos para a grande maioria das bactérias.
 Grupos adaptados a viver em ambientes ácidos e alcalinos.
*
*
Distribuição de alguns microrganismos de acordo com o pH.
*
*
 
 Oxigênio pode ser indispensável, letal ou inócuo para as bactérias
- estritas Ex.: gên. Acinetobacter.
microaerófilas Ex .: Campylobacter jejuni
facultativas Ex.: Escherichia coli
- aerotolerante Ex.: Lactobacillus.
- anaeróbias estritas . Ex.: Clostridium tetani e 
				Clostridium botulinum.
- aeróbias
*
*
*
*
*
*
Efeito do oxigênio sobre o crescimento de vários tipos de bactérias.
Catalase e a superóxido dismutase reduzem para H2O os compostos tóxicos.
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Pressão osmótica
 Açúcar, mel, leite condensado
 Sal, peixe salgado
Pressão Osmótica:
*
*
Taxa de crescimento de alguns microrganismos vs. a concentração de sal.
Não Halófilos: não necessitam de sal e não toleram a presença no meio.
Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a presença no meio.
Halófilos: necessitam de sal em uma concentração moderada
Halófilos extremos: necessitam de sal em altas concentrações.
*
*
 
 Exoenzimas
A seletividade da membrana citoplasmática impede que macromoléculas como proteínas, amido, celulose e lipídios sejam transportadas para o interior da célula.
Para essas moléculas serem utilizadas pelos microrganismos, é necessário serem quebradas em compostos menores, aos quais as membranas são permeáveis.
EXOENZIMAS
*
*
 Exoenzimas
As exoenzimas apresentam especificidade pelo substrato, atuando sobre proteínas ou amidos, ou determinados lipídios, e constituem um fator de virulência, uma vez que podem hidrolisar componentes estruturais de tecidos, conferindo ao microrganismo capacidade invasora e de permanência em outros organismos vivos.
Além de estarem associadas à nutrição dos microrganismos, as exoenzimas podem contribuir para a sua sobrevivência, uma vez que catalisam a hidrólise de substâncias que lhes são tóxicas ou mesmo letais.
*
*
“Sonhe como se fosse viver para sempre, viva como se fosse morrer amanhã.” 
*
*
REPRODUÇÃO BACTERIANA
	
1- Conceito: 
Crescimento: aumento do protoplasma celular pela síntese de ácidos nucléicos, proteínas, polissacarídeos e lipídios; e absorção de água e eletrólitos. Termina na divisão celular.
Multiplicação: resposta necessária à pressão de crescimento.
*
*
 DIVISÃO BACTERIANA: É considerado o aumento do número de indivíduos e não do tamanho celular. 1. BROTAMENTO: < nº de bactérias (forma um broto que quando atinge o tamanho da célula parental se separa) 2. FISSÃO BINÁRIA: (1) alongamento da célula e a replicação do DNA cromossomal; (2) início da invaginação da parede celular e da membrana plasmática; (3) encontro das duas seções da parede celular; (4) produção de duas células individuais idênticas à célula mãe.
*
*
Diagrama demonstrando uma seqüência de divisão celular
*
*
“Cocos” em qualquer direção;
“Bacilos e espirilos”, no sentido transversal.
*
*
 Tempo de geração É o tempo necessário para uma célula se dividir 
(e sua população dobrar de tamanho). - tempo varia de acordo com o organismo; - depende das condições ambientais (nutricionais, temperatura, etc); - maioria das bactérias: 1 – 3 h
*
*
	
Curva de Crescimento
 Demonstra o crescimento das células durante um período de tempo. Essa curva é obtida quando se realiza a contagem da população em intervalos de tempo após o inóculo de um número pequeno de bactérias em meio líquido.
Fases da Curva de Crescimento:
 1- Fase Lag (latência);
 2- Fase Log (crescimento exponencial);
 3- Fase Estacionária;
 4- Fase de Declínio.
*
*
	
Curva de Crescimento
 
 
*
*
Fase lag (A):
Esta fase de crescimento ocorre quando as células são transferidas de um meio para outro ou de um ambiente para outro. 
Fase de ajuste: representa o período necessário para adaptação das células ao novo ambiente. 
As células nesta fase aumentam no volume total em quase duas ou quatro vezes, mas não se dividem. 
Tais células estão sintetizando DNA, novas proteínas e enzimas, que são um pré-requisito para divisão.
*
*
Fase exponencial ou log (B): 
As células estão se dividindo a uma taxa geométrica constante até atingir um máximo de crescimento. 
Os componentes celulares como RNA, proteínas, peso seco e polímeros da parede celular estão também aumentando a uma taxa constante. 
Como as células na fase exponencial estão se dividindo a uma taxa máxima, elas são muito menores em diâmetro e mais sensíveis que as células na fase Lag. 
A fase de crescimento exponencial normalmente chega ao final devido à depleção de nutrientes essenciais, diminuição de oxigênio em cultura aeróbica ou acúmulo de produtos tóxicos.
*
*
Fase estacionária (C): 
Durante esta fase, há rápido decréscimo na taxa de divisão celular. 
Eventualmente, o número total de células em divisão será igual ao número de células mortas, resultando na verdadeira população celular estacionária. 
A energia necessária para manter as células na fase estacionária é denominada energia de manutenção e é obtida a partir da degradação de produtos de armazenamento celular, ou seja, glicogênio, amido e lipídios.
*
*
Fase de morte ou declínio (D): 
Quando as condições se tornam fortemente impróprias para o crescimento, as células se reproduzem mais lentamente e as células mortas aumentam em números elevados. 
Nesta fase o meio se encontra deficiente em nutrientes e rico em toxinas produzidas pelos próprios microrganismos.
*
*
Curva de crescimento
*
*
Métodos para Quantificar Diretamente o Crescimento Microbiano
Contagem em placas;
Filtração;
Método do número mais provável;
Contagem direta ao microscópio;
*
*
1- Contagem em placa
Técnica mais utilizada na determinação de uma populaçãobacteriana.
Vantagem: células viáveis são quantificadas
Desvantagem: 24 horas
Unidades Formadoras de Colônias (UFC)
Diluição seriada Método de espalhamento em placa e pour plate
*
*
Diluição seriada
*
*
Método de espalhamento em placa e pour plate
*
*
Cálculo:
nº de colônias na placa x índice de diluição da amostra = nº de bactérias/mL
DILUIÇÃO SERIADA
MÉTODO DE ESPALHAMENTO EM PLACA
Diluição seriada e contagem em placas
*
*
FILTRAÇÃO - < nº de bactérias = pode ser utilizado o método de filtração para a sua contagem. - concentração de bactérias sobre a superfície de uma membrana de filtro de poros muito pequenos após a passagem de um volume de 100 mL de água. - filtro posteriormente transferido para uma placa de petri contendo meio sólido.
*
*
Método do número mais provável
*
*
Tabela de combinações (NMP)
6-3-1 
Índice de NMP/100 mL = 110
Inferior = 40
Superior = 300
Confiabilidade de 95%
*
*
10
1
0,1
*
*
CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO - um volume conhecido de suspensão bacteriana é colocado em uma área definida da lâmina de microscópio. - a amostra pode ser corada ou analisada a fresco. - utilizam câmaras de contagem DESVANTAGENS:
 - não separa células mortas e vivas 
 - pode haver erros de contagem
- difícil contagem para bactérias móveis
*
*
Utilização da câmara de contagem Petroff-Hausser
*
*
Métodos Indiretos para Contagem do Número de Bactérias
Turbidimetria
Atividade Metabólica
Peso seco
*
*
 QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: (1) TURBIDIMETRIA - monitoramento do crescimento bacteriano através da turbidez - espectrofotômetro (660 nm) (2) ATIVIDADE METABÓLICA - quantidade de um certo produto (como ácido ou CO2) é diretamente proporcional ao número de células bacterianas.
(3) PESO SECO - principalmente para fungos filamentosos a) fungo é removido do meio por filtração b) seco em dessecador c) posterior pesagem.
*
*
A quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao nº. de bactérias.
	Quanto > o nº. de bactérias < a quantidade de luz que é transmitida 
Determinação do nº de bactérias por turbidimetria.
*
*
“A vida só pode ser compreendida olhando-se para trás, mas só pode ser vivida olhando-se para frente.”