Número Mais Provável

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REPRODUÇÃO E CRESCIMENTO: 
NÚMERO MAIS PROVÁVEL 
Importância da enumeração de coliformes 
• Indicadores de condições higiênico-
sanitárias insatisfatórias: são grupos de 
micro-organismos que quando presentes 
fornecem informações sobre a ocorrência de 
contaminação de origem fecal, indicando a 
provável presença de patógenos. 
 
• E. coli e outros gêneros como Enterobacter, 
Klebsiella, Citrobacter e Serratia fazem parte do 
grupo dos coliformes, os quais são importantes 
indicadores de monitoramento da qualidade da água 
e alimentos. 
 
• Coliformes totais- Bacilos, Gram-negativos, não 
formadores de endosporos, aeróbios ou anaeróbios 
facultativos, fermentadores de lactose com produção 
de ácido e gás dentro de 24-48 horas de incubação, à 
temperatura de 35°C. 
• Coliformes termotolerantes fermentam a lactose 
com produção de gás a 44,5oC. E. coli e alguns 
gêneros como Klebsiella e Enterobacter pertencem a 
esse grupo, mas somente E. coli habita 
primariamente o trato gastrointestinal de animais 
de sangue quente. 
 
ESTIMATIVA DE DENSIDADE BACTERIANA 
PELA TÉCNICA DO NMP 
• O método do NMP permite calcular o número de um 
micro-organismo específico numa amostra de água e 
de alimentos, utilizando tabelas de probabilidade. 
• Diluições decimais da amostra são inoculadas em 
séries de tubos contendo meio líquido seletivo. 
• O resultado positivo para coliformes é 
evidenciado pela presença de gás no 
interior do tubo de Durham, presente no 
tubo com meio de cultura. 
 
Definição dos grupos indicadores de 
contaminação 
 
• Coliformes - Este grupo também designado por 
coliformes totais inclui todas as bactérias Gram-
negativas, aeróbias facultativas, capazes de 
fermentar lactose, com produção de gás, em 24-48 h 
a 35 °C. 
 
▫ A definição inclui os gêneros: Escherichia, 
Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. 
 
 
• Coliformes termotolerantes - São parte do 
grupo dos coliformes totais e incluem bactérias 
Gram-negativas, que podem fermentar lactose em 
24 h a 44,5 °C, com produção de gás. 
 
▫ Este grupo é constituído em sua maioria 
pela espécie Escherichia coli, espécie 
indicativa de poluição fecal e portanto da 
possível presença de espécies entéricas 
patogênicas. 
 
 
Definição dos grupos indicadores de 
contaminação 
• Estreptococos fecais – São típicos da flora fecal de 
animais de sangue quente e são empregados como 
indicadores complementares às contagens de coliformes. 
• Bioindicador referenciado na legislação-CONAMA 
274/2000. 
-Melhores indicadores para águas marinhas- tolerância a 
altas concentrações de sal. 
• Este grupo inclui os estreptococos que indicam a 
qualidade sanitária da água e incluem as seguintes 
espécies: S. faecalis, S. faecium, S. bovis, S. equinus 
e S. avium. 
 
 
BIOINDICADORES UTILIZADOS 
 
▫ Coliformes totais (Klebsiella, Enterobacter, 
Citrobacter) 
 
▫ Coliformes Termotolerantes (fecais) 
 
▫ Coliforme específico: Escherichia coli 
 
▫ Estreptococos fecais (Enterococcus) 
 
 
CONDIÇÕES PARA UM MICRO-ORGANISMO SER UTILIZADO 
COMO INDICADOR DE POLUIÇÃO FECAL 
• Estar sempre presente em altas concentrações nas fezes. 
 
• Não se multiplicar fora do trato intestinal humano. 
 
 
• Densidade populacional diretamente relacionada com o 
grau de contaminação. 
A Escherichia coli como indicador mais 
utilizado 
• Habitante, em grande número, do intestino de seres 
humanos e de animais de sangue quente. 
 
• Unicamente de origem fecal. 
 
• Pouco exigente quanto ao meio de cultura para a sua 
identificação. 
 
• Não prejudicial a pessoas e animais, sendo de 
manipulação segura. 
 
• Facilmente identificável; 
 
• O seu número, em uma amostra de água, decresce 
semelhantemente ao número das bactérias patogênicas 
intestinais. 
 
SIGNIFICADO DOS COLIFORMES 
TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS 
( NÚMEROS ELEVADOS ) 
 
1. Possibilidade da presença de micro-organismos 
patogênicos entéricos (Salmonella, Shigella, etc.). 
2. Contaminação pós-processamento. 
 
3.Em números elevados pode ser atribuído a falta de 
higiene, estocagem imprópria, manipulação 
inadequada. 
 
4. Água : indicadores de poluição fecal, com 
possibilidade de presença de patógenos. 
 
Características de um bom indicador de 
contaminação fecal 
• E. coli como indicador: 
Bacilo Gram-negativo pertencente à família 
Enterobacteriaceae caracterizada pela atividade da 
enzima β-glicuronidase. 
habitat: trato intestinal de animais. 
Existência de bactérias patogênicas mais difíceis de 
serem detectadas. 
 
Características de um bom indicador de 
contaminação fecal 
• Em alimentos processados, a presença de um número 
considerável de coliformes indica: 
 
-Processamento térmico inadequado e/ou recontaminação 
pós processamento. 
 
-Proliferação microbiana que poderia permitir a 
multiplicação de micro-organismos patogênicos. 
COLIFORMES TOTAIS OU GRUPO COLIFORME 
 
 Família Enterobacteriaceae 
Bastonetes Gram-negativos, 
não formadores de esporos, 
fermentam a lactose com 
produção de ácido e gás a 35-
37°C/24-48h. 
Gêneros clássicos de coliformes: 
• Escherichia coli (só a E. coli tem como habitat 
primário o trato intestinal) 
• Enterobacter (solo, leite, fezes, etc) 
• Citrobacter (solo, água, fezes, etc) 
• Klebsiella 
 
COLIFORMES TERMOTOLERANTES 
• Bactérias caracterizadas pela presença da 
enzima β-galactosidase e pela capacidade de 
fermentar a lactose com produção de gás no 
prazo de 24 h a 44- 45 ° C em meios contendo 
sais biliares. 
• Apenas algumas cepas de Enterobacter e 
Klebisiella apresentam esta característica. 
 
• E. coli (vários sorotipos). 
 
DETECÇÃO DE COLIFORMES 
Dividido em: 
 
• PRESUNTIVO 
• CONFIRMATIVO 
• COMPLETO 
 
Teste Presuntivo 
• Detectar a presença de micro-organismos 
fermentadores de lactose, especialmente do 
grupo coliforme. 
 
• Princípio: 
 
- Fonte de carbono apenas a lactose (Caldo LST- 
Lauril Sulfato Triptose) 
 
- Meio com lauril sulfato que inibe 
consideravelmente a flora acompanhante. 
• Incubação :35-37◦C por 24-48 h. 
 
• Leitura: Os coliformes utilizam a lactose 
produzindo ácido e gás, sendo este detectado 
no teste presuntivo através da retenção de 
gás no tubo de Durham. 
 
Teste Confirmativo (Coliforme Total) 
 
• De cada tubo LST positivo, transferir 
uma alçada para um tubo de Caldo verde 
brilhante lactose Bile 2% (BVB)-
incubação em estufa a 35° C por 48 h. 
 
• Fonte de carbono apenas a lactose 
• Caldo verde brilhante lactose Bile 2% 
(BVB)-contém dois inibidores (Bile e 
Verde Brilhante) do crescimento da 
microflora acompanhante (bactérias 
Gram-positivas). 
 
• Incubação:35-37◦C por 24-48 h. 
• Leitura: os tubos com produção de gás = 
positivos no teste confirmativo. 
 
• Cálculo do Número Mais Provável (NMP) 
para Coliformes Totais. 
 
Confirmação: Caldo BVB 
 
 
COLIFORMES TERMOTOLERANTES 
 
• De cada tubo BVB positivo, transferir uma 
alçada pra um tubo de caldo EC. 
 
• Meio de cultura seletivo “Caldo EC”. 
• Tubos positivos no teste confirmatório - Caldo 
Escherichia coli (EC) contendo tubos de 
Durham em seu interior. 
• Positivo- produção de gás. 
• Incubação: 44,5 ± 0,5°C por 24-48 h. 
 
• Leitura: os tubos com produção de gás 
 
• Cálculo do Número Mais Provável (NMP) para 
Coliformes a 45°C. 
 
Caldo Lactose Caldo Lactosado Bile 
Verde Brilhante - 
CLBVB 
Caldo Escherichiacoli 
PROVA COMPLETA 
 
• Todos os tubos positivos em Caldo EC são 
repicadas para ágar EAM (Ágar Eosina Azul de 
Metileno). Possui sais biliares que inibem o 
crescimento de bactérias Gram (+), 
favorecendo o crescimento das Gram (-). 
 
 
• Cada tubo positivo em caldo EC 
corresponderá a um placa ( incubar a 35°C/ 
24 h). 
• Semeadura por estriamento do inóculo no 
meio EAM. 
 
• Leitura: 
• Colônias características de E. coli- 2 a 3 mm de diâmetro, 
com brilho metálico esverdeado ou com o centro escuro. 
Algumas vezes o brilho metálico pode estar ausente ou ser 
pouco visível. 
 
• Colônias características de Enterobacter- 4 a 6 mm de 
diâmetro, centro variando de cinza à marrom, aparência 
mucóide e não apresentam brilho metálico. 
Ágar EMB 
 
Klebisiella 
Enterobacter 
PROVA COMPLETA 
• Os tubos positivos no teste 
confirmativo (EC) são 
semeados para o meio EAM. 
• Incubação: 35-37°C por 24 h. 
• Leitura: As colônias com 
brilho verde metálico (E. coli). 
 
PROVAS BIOQUÍMICAS 
• As colônias típicas para coliformes 
termotolerantes, são transferidas com agulha 
flambada para o meio ágar nutriente inclinado, 
sendo incubado em estufa 35-37◦C por 24 h, 
para posterior realização do IMVIC: Indol, 
Vermelho de Metila (VM), Voges Proskauer 
(VP), Citrato. 
 
PROVAS BIOQUÍMICAS 
• IMVIC (Indol, Vermelho de Metila, Voges Proskauer e 
Citrato. 
 
• Positivo: Indol, Vermelho de Metila 
 
• Negativo: VP e Citrato 
 
• Verificar na tabela o NMP correspondentes aos tubos de 
EC positivos para a presença de E. coli e expressar o 
resultado em NMP de E. coli/ g ou mL 
 
• Bactérias que não fermentam a lactose, como por 
exemplo, a maioria das espécies de Salmonella e 
Shigella, apresentam-se, translúcidas e incolores. 
 
Cálculo do valor do NMP 
 
• O cálculo da densidade de bactérias do grupo 
testado é baseado no número de tubos positivos de 
cada diluição, no Teste Confirmativo e Completo. 
 
• O resultado é dado com limite de 95% de confiança. 
• São necessárias 3 diluições para formular o código 
que permite a leitura na tabela do NMP. 
• O número de código tem 3 dígitos, sendo cada um, o 
número total de tubos positivos em cada diluição e 
por ordem decrescente de volume de inóculo. 
 
Cálculo do valor do NMP 
 
• Quando as séries de diluições decimais são 
diferentes de 10, 1 e 0.1mL de amostra (diluições 
para as quais a tabela está elaborada), o valor do 
NMP é calculado pela fórmula: 
 
 NMP= NMP da tabela X __________10_______ 
 maior quantidade testada 
 
• Se foram testados mais de três volumes de amostra, 
determinam-se as três diluições mais significativas 
de acordo com as regras do NPM. 
 
PADRÕES MICROBIANOS DE QUALIDADE DA ÁGUA 
• Água potável- ausência de coliformes 
termotolerantes em 100 mL de água. 
 
• Água para pesca de mariscos e crustáceos-14 
coliformes termotolerantes em 100 mL de água. 
 
• Água de contato primário (banho e natação)-
1000 coliformes termotolerantes em 100 mL. 
 
-Nesse caso são considerados indicadores 
adicionais de patogênicos não fecais (P. 
aeruginosa e S. aureus). 
TESTE ONPG E MUG 
• Baseia-se na capacidade das bactérias coliformes 
em secretar enzimas que convertem um 
substrato em um produto que pode ser 
detectado por uma mudança de coloração. 
 
• Substratos 
-ONPG (O-nitrofenil-β-D-galactopiranosídio) 
 
-MUG (4-metilumbeliferil β-D-glicuronídeo) 
TESTE ONPG E MUG 
• Na presença de coliformes são secretadas as 
enzimas β-galactosidase e β-glucuronidase. 
 
• Β-galactosidase- hidrolisa o ONPG em um 
produto de coloração amarela 
 
Coliformes presentes 
Incubação por 24h. 
 
Resultados: 
 
Incolor: Negativo; 
Amarelo: Positivo 
para Coliforme. 
Azul: Positivo para E. 
coli. 
 
TESTE ONPG E MUG 
• β-glucuronidase- hidrolisa o MUG em um 
produto que se torna azul-fluorescente quando 
iluminado com luz ultravioleta. 
 
E. coli presente