REPLICA+ç+âO DA MOL+ëCULA DE DNA

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FASE S 
REPLICAÇÃO DA MOLÉCULA DE DNA 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS 
BIOLÓGICAS 
Profa. Délia Aguiar 
• Cada vez que uma célula se divide, 
uma cópia completa de seus genes deve 
ser produzida. 
 
Durante a replicação  necessário um grau 
considerável de precisão  uma taxa de erro de 
0,001% (1 erro por 10.000 nucleotídeos) causará um 
acúmulo significante de alterações nos genes . 
 
O PADRÃO GERAL DA REPLICAÇÃO DO 
DNA 
• WATSON e CRICK 
– O pareamento específico sugere 
um possível mecanismo de 
replicação do material genético. 
• Os biologistas moleculares no início da década de 
50 não tinham certeza do padrão geral do processo 
de replicação. 
 
• Três estratégias diferentes para a replicação da 
dupla hélice pareciam possíveis: 
O PADRÃO GERAL DA REPLICAÇÃO 
DO DNA 
1) REPLICAÇÃO SEMI-CONSERVATIVA, na qual as 
moléculas filhas contêm, cada uma, um 
polinucleotídeo derivado da molécula original e uma 
fita recém-sintetizada. 
2) REPLICAÇÃO CONSERVATIVA, na qual uma 
molécula filha contem ambos os polinucleotídeos 
originais e a outra contem ambas as fitas recém-
sintetizadas. 
3) REPLICAÇÃO DISPERSIVA, na qual cada fita 
de cada molécula filha é composta de segmentos do 
polinucleotídeo original e de segmentos recém-
sintetizados. 
O EXPERIMENTO DE MESELSON-STAHL 
• Este experimento dependeu do uso de isótopos 
químicos. 
– O isótopo normal (N14) e o pesado(N15) . 
 
• E. coli provida com nitrogênio pesado irá incorporá-lo 
em seu DNA 
 
• DNA contendo N15 pode ser distinguido daqueles 
contendo N14 por centrifugação em gradiente de 
densidade 
 
• DNA-N15 tem uma densidade de flutuação maior que o 
DNA-N14 e formará uma banda em uma posição mais 
baixa. 
O EXPERIMENTO 
OBSERVAÇÃO 
 
1º Cultivaram E. coli em um meio de cultura com N15 e N15 
CENTRIFUGAÇÃO DENSIDADES DIFERENTES 
O EXPERIMENTO 
• Uma cultura de E. coli - crescer em presença de N15 
•A cultura foi centrifugada, o meio de cultura descartado 
e as bactérias foram ressuspendidas em meio contendo 
somente N14. 
 
•Portanto, os polinucleotídeos sintetizados após a 
ressuspensão conteriam somente N14. 
• Deixava-se as bactérias crescendo por 20 minutos (um ciclo de 
divisão), tempo no qual o DNA se replica apenas uma vez. 
• Retirava-se algumas células da cultura, seus DNAs eram 
purificados e analisados por centrifugação em gradiente de 
densidade. 
 
• O resultado foi uma única banda de DNA na posição 
correspondente a uma densidade de flutuação intermediária 
entre os valores para DNA-N15 e DNA-N14, mostrando que cada 
molécula de DNA continha aproximadamente igual quantidade 
de polinucleotídeo-N14 e polinucleotídeo-N15. 
• Este resultado é compatível com a replicação semi-conservativa 
e dispersiva, porém elimina a replicação conservativa pois, por 
este esquema, seriam produzidos 2 tipos de moléculas de DNA, 
um inteiramente N15 e outro inteiramente N14, sem a formação 
de híbridos. 
• Para distinguir entre replicação semi-conservativa e 
dispersiva, Meselson e Stahl deixaram as bactérias 
crescendo por mais um ciclo de divisão celular. 
VER VIDEO 1 
CROMOSSOMO BACTERIANO 
O MECANISMO DE REPLICAÇÃO DO DNA 
EM E. coli 
O MECANISMO DE REPLICAÇÃO DO 
DNA EM E. coli 
• Quebra do pareamento de bases  posição 
específica  ORIGEM DE REPLICAÇÃO  
gradualmente se desloca ao longo da molécula  
síntese dos novos polinucleotídeos enquanto a dupla 
hélice se abre. 
 
• A região onde o pareamento das bases da molécula 
parental é quebrado e os novos polinucleotídeos são 
sintetizados é chamada FORQUILHA DE 
REPLICAÇÃO. 
Replicação do DNA: vários pontos de origem 
Pontos de origem 
de replicação 
A DNA POLIMERASE 
• Enzima capaz de sintetizar um novo polinucleotídeo de 
DNA  DNA POLIMERASE. 
 
• A seqüência das bases no novo polinucleotídeo é 
dependente da seqüência das bases na fita molde  e é 
determinada pela complementariedade no pareamento 
das bases. 
 
• A síntese de DNA ocorre somente no sentido (ou 
direção) 5'3'. 
Crescimento da cadeia 
A síntese do DNA é feita no sentido 5 
- 3. 
A extremidade 5´ trifosfato do 
nucleosídeo forma uma ligação 
fosfodiéster com o grupo hidroxil da 
nova cadeia. 
 
EVENTOS NA FORQUILHA DE 
REPLICAÇÃO 
• A enzima responsável pela replicação do DNA em E. 
coli  DNA POLIMERASE III. 
 
• Enzima HELICASE  rompimento do pareamento 
das bases entre as duas fitas da molécula de DNA 
parental. 
 
• SSB proteínas  ligam-se aos DNA-fita simples 
resultantes da ação da helicase, impedindo o 
repareamento das duas fitas. 
• A DNA polimerase III sintetiza DNA somente no sentido 5'3', 
o que significa que a fita molde deve ser lida no sentido 3'5‘. 
• Para uma das fitas parental, a FITA LÍDER, o novo 
polinucleotídeo pode ser sintetizado continuamente. 
Porém a outra, a FITA TARDIA, não pode ser copiada 
continuamente, pois isto necessitaria uma síntese 3'5'. 
 
• A FITA TARDIA tem de ser copiada em seções: 
– uma porção da hélice parental é dissociada e esse 
pequeno trecho exposto da fita tardia é replicado, a 
hélice se dissocia mais um pouco e o trecho é copiado e 
assim por diante. 
O PROBLEMA 
DA INICIAÇÃO 
Todas as DNA 
polimerases 
precisam de um 
grupo 3'-OH 
para estender a 
cadeia de DNA 
Como, então, se 
inicia a síntese 
de DNA? 
 
Uma enzima 
chamada primase 
sintetiza um 
PRIMER de RNA 
tanto na fita 
lider como nos 
fragmentos de 
Okasaki 
Uma RNA polimerase pode sintetizar também um 
primer da fita líder 
• Primeiros nucleotídeos - são ribonucleotídeos que são 
colocados por uma RNA polimerase. 
• Após isso, a RNA polimerase é liberada e a polimerização, 
desta fez de DNA, é continuada pela DNA polimerase III. 
• Na fita tardia, a DNA polimerase III somente pode 
sintetizar DNA até uma certa distância antes de 
atingir o iniciador na extremidade 5' do próximo 
fragmento de Okazaki. 
 
 
Aqui a DNA polimerase III é substituída pela DNA 
polimerase I que continua a síntese, retirando os 
ribonucleotídeos que constituem o iniciador do fragmento 
de Okazaki adjacente (atividade exonuclease 5'->3') e 
substituindo-os por desoxirribonucleotídeos. 
Quando todos os ribonucleotídeos são substituídos, a 
DNA polimerase I ou para, ou se desloca para outra 
região com iniciador, promovendo a substituição dos 
nucleotídeos. 
• Reação final - união dos fragmentos de Okazaki -
DNA LIGASE (sintetiza uma ligação fosfodiéster) 
ATIVIDADE DE REVISÃO 
• Tanto a DNA polimerase I como a III possuem 
atividade exonuclease 3'5', sentido contrário à 
síntese. Isto significa que, se um nucleotídeo for 
inserido incorretamente durante a síntese, a enzima é 
capaz de retroceder e substituir o nucleotídeo 
incorreto pelo adequado. 
Sistema de reparo: pareamentos errados são instáveis e 
provocam dobras na molécula (alteração espacial): percebidos e 
corrigidos. 
O PROBLEMA TOPOLÓGICO 
• Os 2 polinucleotídeos da hélice parental estão 
enrolados um no outro - o deslocamento da forquilha 
de replicação ao longo da molécula parental requer 
não somente a separação das 2 fitas, mas também seu 
desenrolamento. 
 
DNA TOPOISOMERASE 
• As enzimas que desenrolam a dupla hélice - DNA 
TOPOISOMERASES, pertencentes a 2 classes, TIPO I e TIPO II. 
 
• As topoisomerases tipo I quebram apenas um dos 
polinucleotídeos e passam a outra fita pela fenda, antes de 
desfazer a quebra. 
 
• As enzimas tipo II, das quais faz parte a DNA GIRASE, realizam 
o mesmo tipo de reação,porém quebram ambas as fitas em 
posições adjacentes. 
REPLICAÇÃO DO DNA EM 
EUCARIOTOS 
• A replicação do DNA processa-se de um modo muito 
similar em todos os organismos, e os eventos 
descritos em E. coli também valem para os eucariotos. 
• Células de mamíferos têm 5 DNA polimerases 
diferentes chamadas , , ,  e . 
FIM