Estresse oxidativo - 2009-2 - PB

Prévia do material em texto

1
Universidade Federal de Santa Catarina
Centro de Ciências Biológicas
Departamento de Bioquímica
ESTRESSE OXIDATIVOESTRESSE OXIDATIVO
Aula para curso de graduaAula para curso de graduaçção em Farmão em Farmááciacia
Professor Marcelo Farina
MetabolismoMetabolismo anaeranaeróóbicobico -- glicglicóóliselise
Glicose + 2ADP + 2Pi Lactato + 2ATP + 2H2O
OO22 comocomo um um aceptoraceptor de de eleléétronstrons no no metabolismometabolismo aeraeróóbicobico
Glicose + 6O2 + 36ADP + 36Pi 6CO2 + 36ATP + 6H2O 
• Originalmente, o metabolismo era 
anaeranaeróóbicobico
• A concentração de O2 bem menor do que a 
atual
A reduA reduçção do oxigênio molecular e ão do oxigênio molecular e 
a formaa formaçção de espão de espéécies reativas cies reativas 
FormaFormaçção de espão de espéécies reativas de oxigêniocies reativas de oxigênio
• As espespéécies reativas de oxigêniocies reativas de oxigênio (EROs) são 
geradas constantemente como parte da vida 
aeróbica normal:
• Cadeia transportadora de elétrons
• Intermediários de reações enzimáticas
2
Mitocôndria
Lisossomos
Peroxissomos
Retículo endoplasmático
Citoplasma
Oxidação Microssomal, 
Flavoproteínas, Citocromo P450 Mieloperoxidase
fagócitos 
Transporte de elétrons
Oxidases,
Flavoproteínas
Membrana plasmática
Lipoxigenases,
Prostaglandina sintase
NADPH oxidase
Xantina Oxidase,
NOS
Fe
Cu
Metais de
transição
Fontes endFontes endóógenas de EROgenas de ERO
Principal sPrincipal síítio de formatio de formaççãoão: Complexo I (NADH-coenzima Q)
FatoresFatores: Dano mitocondrial físico ou químico, disponibilidade de 
oxigênio e presença de xenobióticos
A mitocôndria como fonte de A mitocôndria como fonte de EROsEROs
O citoplasma como fonte de O citoplasma como fonte de EROsEROs -- Catabolismo de PurinasCatabolismo de Purinas Xantina oxidase, isquemia e Xantina oxidase, isquemia e alopurinolalopurinol
Xantina oxidase, isquemia e Xantina oxidase, isquemia e alopurinolalopurinol
Alopurinol
Oxido NOxido Níítrico trico SintaseSintase
- nNOS - Isoenzima Neuronal
- eNOS - Isoenzima Endotelial
- iNOS - Isoenzima Induzível
3
BetaBeta--oxidaoxidaçção ão peroxissomalperoxissomal
Ácido graxo
Acil-CoA
Enoil-CoA
Hidroxiacil-CoA
Cetoacil-CoA
Acetil-CoA Acil-CoA diminuído 
de 2 carbonos 
Acil Graxo-CoA sintetase
Acil-CoA oxidase
Enoil-CoA hidrolase
Hidroxiacil-CoA
desidrogenase
Tiolase
H2O2
Principalmente em neutrófilos, mas também em outros tecidos
NADPH oxidase como fonte de NADPH oxidase como fonte de EROsEROs
Tóxico para os 
patógenos, mas 
também para os 
tecidos vizinhos.
Defesas AntioxidantesDefesas Antioxidantes
“Tendo em vista que o OO22 é uma 
molécula potencialmente tóxica, os 
seres aeróbicos desenvolveram defesas 
antioxidantes”. 
Defesas AntioxidantesDefesas Antioxidantes
Antioxidantes são: 
• Agentes que removemremovem cataliticamente radicais 
livres e outras espécies reativas (ex: catalase, 
superóxido dismutase, peroxidases);
• Proteínas que minimizam a disponibilidade de prminimizam a disponibilidade de próó--
oxidantesoxidantes (ex: transferrina, metalotioneínas);
• Agentes de baixo peso molecular que ““bloqueiambloqueiam””
espespéécies reativascies reativas (glutationa, ácido ascórbico)
Defesas Antioxidantes Defesas Antioxidantes 
EnzimEnzimááticasticas
SuperSuperóóxido xido DismutasesDismutases
CuCu--ZnZn--SuperSuperóóxidoxido dismutasedismutase
• Enzima capaz de remover radicais superremover radicais superóóxido (Oxido (O22●●
--))
cataliticamente – eritrócitos (McCord & Fridovic, 1969);
• Presente praticamente em todas as células 
eucarióticas e localizada principalmente no citoplasmacitoplasma; 
- 32.000 PM
- Altamente resistente ao 
calor e proteases
- Dímero (cada subunidades 
contém um sítio ativo 
contendo um Cu e um Zn 
4
ReaReaçção da ão da CuCu--ZnZn--SODSOD
Enz-Cu2+ + O2•- Æ Enz-Cu+ + O2
Enz-Cu+ + O2•- + 2H+ Æ Enz-Cu2+ + H2O2
O2•- + O2•- + 2H+ Æ O2 + H2O2
ReaReaçção geral da ão geral da CuCu--ZnZn--SODSOD
CuCu--ZnZn--SODSOD extracelular (ECextracelular (EC--SOD)SOD)
• Presente no plasmaplasma de vários mamíferos;
• 135. 000 PM, tetrâmerotetrâmero com 1Cu e 1 Zn por 
subunidade, 
• Previne a formação de peroxinitritoperoxinitrito nos vasos
NO• + O2•-Æ ONOO-
• Significado biológico:
- um antagoniza o outro (hipertensãohipertensão)
- Peroxinitrito é altamente oxidante para liplipíídeosdeos e DNADNA
Óxido Nítrico Sintase
NO•
Liga-se ao heme da 
guanilato ciclase
Mudança conformacional
na enzima
Aumento da atividade 
(produção de cGMP)
Modulação da atividade de 
outras proteínas (proteínas 
quínases, fosfodiesterases, 
canais de íons)
Resposta fisiológica 
(relaxamento dos 
músculos lisos, inibição da 
agregação plaquetária, 
etc.)
O2-• ONOO-
SinalizaSinalizaçção fisiolão fisiolóógica do NOgica do NO• MnMn--SuperSuperóóxidoxido dismutasedismutase
• A manganês SODmanganês SOD foi isolada inicialmente de E. coli
• 40.000 Daltons e contém Mn (III) no estado “basal”
Enz-Mn3+ + O2•- Æ Enz-Mn2+ + O2
Enz-Mn2+ + O2•- + 2H+ Æ Enz-Mn3+ + H2O2
• A taxa de dismutação é similar a da Cu-Zn-SOD em 
pH = 7,0. 
Importância FisiolImportância Fisiolóógica das gica das SODsSODs
A melhor forma de se estudar sua importância é retirá-la dos organismos
• Gene knockouts em bactérias e fungos
- Bactérias sem atividadesem atividade da SOD não cresceram em aerobiose
- E. coli com atividade SOD deficienteSOD deficiente tiveram mais mutações no 
DNA em aerobiose (mas não em anaerobiose) 
• Animais trangênicos
- Hiper-expressão de SOD em camundongos: aumento da 
resistência à toxicidade do oxigênio (HIPERHIPERÓÓXIAXIA)
- Camundongos MnMn--SODSOD knockoutknockout morrem antes dos 10 dias de 
vida por cardiopatia, esteatose hepática e acidose metabólica. 
ReaReaçção de Haberão de Haber--WeissWeiss
O Cobre tambO Cobre tambéém catalisa esta ream catalisa esta reaççãoão
5
CatalaseCatalase
• A dismutação do supersuperóóxidoxido gera o perperóóxido de xido de 
hidrogênio (Hhidrogênio (H22OO22));
• Entretanto, esta molécula pode provir de outras 
fontes:
• Catabolismo de purinas (Citoplasma)
• Beta-oxidação peroxissomal (Peroxissomos)
Peróxido de Hidrogênio
Peróxido de Hidrogênio
• O perperóóxido de hidrogênio (Hxido de hidrogênio (H22OO22) ) deve ser 
decomposto por:
• CatalasesCatalases: decompõem o H2O2 ao O2 no seu 
estado basal;
• PeroxidasesPeroxidases: usam o H2O2 para oxidar outro 
substrato 
Nos animais, a maior parte dos tecidos têm catalase:
- Fígado: Principalmente
- Eritrócito: Peróxido proveniente de dismutação do 
superóxido gerado pela auto-oxidação da HEMOGLOBINAHEMOGLOBINA
Estrutura da Catalase
• Quatro subunidades, cada uma com um grupo hemegrupo heme
contendo Ferro “enterrado” em um ambiente apolar 
Mecanismo Catalítico
Cat-Fe3+ + H2O2 Æ Composto 1 + H2O
Composto 1 + H2O2 Æ Cat-Fe3+ + H2O + O2
O estado redox do heme muda durante a catálise.
H2O2 Æ H2O + ½ O2
Ensaios enzimáticos podem ser feitos pela medida do 
desaparecimento de peróxido de hidrogênio (Abs = 240 nm)
Localização da Catalase
• Principalmente peroxissomalperoxissomal (beta-oxidação)
• MitocôndriasMitocôndrias hepáticas praticamente não têm não têm 
catalasecatalase (Como degradar H2O2 gerado pela dismutação 
de superóxido intra-mitocondrial?)
6
PeroxidasesPeroxidases e o sistema GSHe o sistema GSH
GlutationaGlutationa
• Tripeptídeo: glutamato, cisteína e glicina. 
• Cisteína – grupos tióis – reduzem outros 
compostos enquanto formam pontes dissulfeto 
(2GSH Æ GSSG).
• Altas concentrações intracelulares (mM), baixas 
concentrações extracelulares
2 Glu-Cis-Gli Glu-Cis-Gli|| 
S Æ S 
| | 
H S 
| 
Glu-Ciys-Gli
A FamA Famíília das Glutationa lia das Glutationa PeroxidasesPeroxidases
“As GPxs (1957) removem HH22OO22 acoplando sua 
redução em H2O à oxidação da glutationaglutationa”
H2O2 + 2GSH Æ 2H2O + GSSG
Também podem catalisar a redução de perperóóxidos xidos 
de lipde lipíídeosdeos em seus respectivos áálcooislcoois – produtos 
de peroxidação do ác. Linoléico, Linolênico. 
LOOH + 2GSH Æ LOH + H2O + GSSG
PeroxidaPeroxidaççãoão LipLipíídicadica
Estrutura da Estrutura da GPxGPx (GPx1)(GPx1)
• Tetrâmero, cada subunidade contendo um átomo 
de selênioselênio (Se) no sítio ativo (selenocisteína);
• Selênio (Se) ≅ Enxofre (S) – Grupo VI, calcogênios
•• LocalizaLocalizaççãoão:
Matriz mitocondrial 
e citoplasma
Durante a catDurante a catááliselise
Selenol (-Se-/-SeH) gera um ácido selenínico (-SeOH)
a) Prot-Se- + ROOH + H+ ⇒ ROH + Prot-SeOH
Vem a primeira GSH
b) Prot-SeOH + GSH ⇒ + Prot-SeSG + H2O
Vem a segunda GSH
b) Prot-SeSG + GSH ⇒ + Prot-Se- + H+ + GSSG
7
Durante a catDurante a catááliselise A famA famíília das lia das peroxidasesperoxidases
• GPx clcláássicassica (intracelular - GPx1)
• GPx3 plasmplasmááticatica (glicoproteína – tetrâmero)
• FosfolipFosfolipíídio dio hidroperhidroperóóxidoxido GPx4GPx4 (monomérica)
- Age em lipídios de membrana peroxidados
• GPx2 do trato gastrintestinaltrato gastrintestinal (tetrâmero)
- Metabolismo de peróxidos ingeridos ou gerados 
no trato gastrintestinal
A razão GSH/GSSGA razão GSH/GSSG
• É geralmente altaalta nas células
• Fígado humano: > 100
• Rim humano: > 100
• Eritrócito humano: > 100
Deve existir um mecanismo de redureduçção da ão da 
GSSGGSSG gerada pela oxidação da GSHGSH
Glutationa RedutaseGlutationa Redutase
• Contém duas 
subunidades contendo FAD
• O NADPH reduz o FAD 
que reduz as pontes 
dissulfeto de duas cistinas 
do sítio ativo
• Os grupos tióis formados 
reduzem a GSSG
Glutationa Redutase (GR) Glutationa Redutase (GR) -- ReaReaççãoão
Antioxidantes de baixo peso molecularAntioxidantes de baixo peso molecular
ÁÁcido asccido ascóórbico (vitamina C) e Tocoferol (vitamina E) rbico (vitamina C) e Tocoferol (vitamina E) 
8
Defesas Antioxidantes de baixo PMDefesas Antioxidantes de baixo PM
Atividade antioxidante via 
• “Scavenger” de radicais livres
• Impedimento da propagação (param as reações em cadeia da 
lipoperoxidação)
• Ligam metais.
Antioxidantes de 
baixo peso molecular
Sintetizados in vivo Adquiridos na dieta
ÁÁcido Asccido Ascóórbicorbico
Proveniente da dieta em humanos: 
• Possui dois grupos -OH ionizáveis 
• pK1 = 4,25
• pK2 = 11,8 
• Mono-ânion ascorbato 
• Solúvel em água
SSííntesentese
• Plantas e alguns animais podem sintetizá-lo a 
partir da glicose, mas não os humanos;
Glicose Æ Æ Æ L-gulonolactonaÆ L-ascorbato + H2O2
gulonolactona oxidase
Humanos, primatas,
“guinea pig”
• Os humanos têm o gene da gulonolactona, mas 
é mutante (inativo) - Erro inato do metabolismo*
SSííntesentese
FunFunçções ões -- ““não antioxidantesnão antioxidantes””
• Acúmulo tecidual e absorção intestinal: Na-dependente
• Cofator das enzimas:
• Prolina hidroxilase (prolina ⇒ hidroxiprolina)
• Lisina hidroxilase (lisina ⇒ hidroxilisina)
• Dopamina hidroxilase (dopamina ⇒ norepinefrina)
ESCORBUTO
FunFunçções ões -- antioxidantesantioxidantes
Agente redutorAgente redutor
• Redução do Fe (III) para Fe (II)
• Reduz espécies reativas, como OH● e O2●-;
• O ascorbato doa elétrons ⇒ semi-
dehidroascorbato (SDA) ou radical ascorbil. 
• Assim, reduz ERO e ERN (radicais peroxil, hidroxil, 
superóxido e peroxinitrito).
9
FunFunçções ões -- antioxidantesantioxidantes
Ascorbato Radical Ascorbil
Radical Ascorbil Dehidro-ascorbato
- Pouco-reativo
FunFunçções ões -- antioxidantesantioxidantes
“A pobre reatividade do radical ascorbil é a essência 
de muitos de seus efeitos antioxidantes”
• O radical ascorbil não é um forte oxidante nem um 
forte redutor: não reduz O2 a O2●-,
• Um radical livre altamente reativo interage com o 
ascorbato e forma-se um radical muito menos reativo
2 radicais ascorbil ⇒ ascorbato + dehidro-ascorbato
Ascorbato como antioxidante Ascorbato como antioxidante in vivoin vivo
Várias ações
• “Scavenger” de:
• O2●, HO2●, OH● , R-S●
• Inibe a peroxidação lipídica induzida por hb/H2O2
• Coopera com a vitamina E (regenera o tocoferol)
• Protege contra a lipoperoxidação induzida pelo 
fumo - 30 a 100 μM no plasma humano
Estudos Estudos in vivoin vivo
• Deficiência dietética induzida em guinea pig:
• ⇓ dos níveis de vitamina E nos tecidos
• ⇑ da exalação de pentano e etano (lipoperoxidação)
• Humanos:
• ⇑ 8-OH-desoxiguanosina (dano oxidativo no DNA) 
em esperma de adultos com deficiência de vitamina C 
na dieta - melhora após suplementação
• ⇑ dos níveis de DHA no líquido sinovial de pacientes 
com artrite reumatóide (inflamação).
Vitamina EVitamina E
Proveniente da dieta em humanos: 
• “Scavenger” de radicais peroxil (ROO●): O mais 
importante inibidor das reações em cadeia de 
radicais livres da peroxidação de lipídeos em 
animais;
Alfa- tocoferol
Vitamina E Vitamina E -- QuQuíímica dos tocofermica dos tocoferóóisis
• Tocoferóis são substâncias com atividade 
“vitamina E like” - O mais ativo é o alfa-tocoferol. 
10
Atividade antioxidanteAtividade antioxidante
• Tocoferóis e tocotrienóis inibem a peroxidação
lipídica porque neutralizam o radical peroxil antes 
que ele reaja com ácidos graxos adjacentes;
α-TocH + LOO● ⇒ α-Toc● + LOOH
• Constante de reação 106 M-1s-1, ou seja, 4 ordens 
de magnitude mais rápida que a reação de radicais 
LOO● com lipídios - 102 M-1s-1
Seqüência Básica da Reação de Peroxidação Lipídica
Atividade antioxidanteAtividade antioxidante
• Além disso, o radical α-Toc● pode reagir com outro 
radical LOO●, gerando um produto não-radicalar
α-Toc● + LOO● ⇒ α-TocOOL
• Assim, 1 molécula de α-Toc pode terminar 2 
reações em cadeia de peroxidação.
Reciclando o Reciclando o 
αα--TocoferolTocoferol
Principalmente via Principalmente via 
ascorbato:ascorbato:
Outras vias:
- Ubiquinol
- GSH
Transferência de Radicais entre as fases aquosa e lipídica:
Membrana Citoplasma
LOO•
LOOH
TocH
Toc• Asc
SDA• NADH/GSH
NAD+/GSSG
Remoção de 
Radicais da 
Membrana
Outros antioxidantes de baixo PMOutros antioxidantes de baixo PM
Existe uma grande variedade de antioxidantes de 
baixo PM sintetizados no próprio organismo humano: 
• Bilirrubina: “scavenger” de radical peroxil e oxigênio 
singlet;
• Melatonina: agente redutor doador de hidrogênio;
• Ácido úrico: “scavenger” de radical hidroxil e 
quelante de íons metálicos (Fe e Cu) em formas 
menos reativas