Eletroforese-aula

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Eletroforese 
• Separação dos componentes de um sistema 
por meio da aplicação de um campo elétrico. 
 
 
• Um dos métodos mais usados no laboratório. 
Princípio do método 
• Substâncias que possuem carga elétrica livre em 
solução, deslocam-se quando submetidas a um campo 
elétrico de sentido invariável. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Separação qualitativa 
 
Fatores que alteram a migração 
eletroforética 
pH do meio 
pI das substâncias 
 
Eletrólitos usados 
Interações com a base fixa 
Temperatura 
Movimentos hídricos no suporte, etc. 
Migração eletroforética de proteínas 
• Se pH = pI da proteína 
– Carga efetiva zero, não migra, estacionária. 
 
• Se pH > pI da proteína 
Carga negativa e migra para pólo+ (anódio) 
• Se pH< pI da proteína 
Carga positiva e migra para pólo – (catódio) 
• Concentração dos eletrólitos (força iônica) 
deve ser a menor possível 
– Diminuir condutividade: mais corrente elétrica, 
mais calor gerado no processo 
 
• A voltagem aplicada deve ser adequada. 
Tipos de eletroforese 
• Eletroforese livre 
– Substâncias em meio totalmente líquido 
– Convecção 
– Em desuso 
 
• Eletroforese em suporte 
- Substâncias separadas em meio sólido (papel, 
acetato de celulose) ou semi-sólido (géis). 
- Convecção é abolida 
Instrumental da eletroforese 
• Amostra ( proteínas, ácidos nucléicos) 
• Fonte de corrente contínua 
• Câmara de separação (cuba) 
• Suporte 
• Carreadores 
• Sistemas tampões 
• Corantes 
• Densitômetros, transluminadores 
Aplicações 
• Estudos clínicos 
• Resolução de misturas complexas 
• Identificação de componentes 
• Determinação de pureza e homogeneidade 
molecular 
• Determinação do pI 
• Genética molecular 
• Classificação de espécies 
 
 
Métodos especiais 
• Eletroforese com SDS em gel de poliacrilamida 
– Perda da carga intrínseca da proteína 
– Adquire carga negativa constante em relação ao 
peso molecular 
 
• Eletroforese em gel 
- Adiciona filtração pelos poros à separação pela 
carga, aumenta o número de frações 
• Eletrofocalização 
–Gradiente de pH obtido por uma mistura de 
anfólitos 
–Migram p/ anódio ou catódio, pI. 
• Imunoeletroforese 
–Após separação no gel, reação 
antígeno/anticorpo 
–Restam complexos insolúveis 
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida - PAGE 
PAGE 
Nativa 
Desnaturante 
Ácida 
Básica 
Separa proteínas ácidas 
Separa proteínas básicas 
SEPARA POR CARGAS 
SEPARA POR TAMANHO 
SDS - PAGE 
Dodecil Sulfato de Sódio - SDS 
1. Agente 
desnaturante 
2. Atribui carga 
negativa 
- - - - - - - 
- - - - - 
- - 
- - - 
- - - 
SDS-PAGE 
• Preparação da amostra 
Tampão da amostra 
+ 
β-mercaptoetanol 
SDS - Agente desnaturante 
Agente redutor 
SH SH + 
β-mercaptoetanol/Redução de Proteínas 
Agente redutor 
S S SH 
Eletroforese: SDS-PAGE 
• proteínas migram de acordo 
com tamanho e forma 
 
• a proteína é denaturada, as 
subunidades se separam 
poço 
catodo 
direção de 
migração 
anodo 
Amostra 
Eletroforese: SDS-PAGE 
Eletroforese: corante 
Coomassie blue 
4 subunidades 
_ 
+ 
Coomassie 
 
 
SDS-PAGE 
Unidimensional 
25mA-1h 
Eletroforese: curva de calibração 
 
Eletroforese: focalização isoelétrica 
• Para determinar pI da 
proteína 
 
• Utiliza anfólitos para 
obter um gradiente de 
pH 
 
• Proteínas param de 
migrar quando pH = pI 
Eletroforese: Focalização isoelétrica 
• Cada proteína tem seu ponto isoelétrico (pI). 
• Este é o pH no qual a proteína não tem carga 
elétrica 
• Gradientes estáveis de pH nos géis podem ser 
criados usando polianfólitos 
• Proteínas carregadas nestes géis migrarão 
para os seus pIs correspondentes 
Focalização Isoelétrica 
Gradiente de pH imobilizado 
Eletroforese: Focalização isoelétrica 
Primeira 
Dimensão 
 
Focalização 
isoelétrica 
pI decrescente 
O gel de focalização 
isoelétrica é colocado 
sobre o gel de 
poliacrilamida e SDS 
Segunda Dimensão 
 
Eletroforese em gel de 
poliacrilamida e SDS 
 
pI 
decrescente 
PM 
decrescente 
Eletroforese Bidimensional ou 2D 
IMUNOELETROFORESE 
• Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que 
são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma 
corrente elétrica. 
• As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no 
gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. 
• Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com 
Ac, que se difunde. 
• Ag e Ac formam arcos de precipitação. 
 
+ - 
Ag 
Ag 
1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna 
canaleta 
2- Anti-soro na canaleta 
canaleta 
3- Difusão e precipitação 
Eletroforese em gel de agarose 
Preparação da amostra 
Tampão de corrida 
1-xileno cianol 
2- bromofenol 
 3-glicerol/ sacarose 
 
Preparo do gel 
• Tampão: Tris Borato EDTA 
(TBE) pH=7,5 
• Agarose 
• Brometo de etídeo 
– Comprovadamente 
cancerígeno. 
Representação esquemática dos equipamentos necessários para a 
realização da eletroforese em sistema horizontal 
 
catodo 
anodo 
Ag vAp 
Eletroforese 
Teste de paternidade