Contagem viáveis em placas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
� Determinar o número de micro-organismos viáveis 
em uma amostra;
� Aplicar a técnica de contagem de viáveis em placa.
� O crescimento populacional pode ser acompanhado 
pela ananáálise de varialise de variaçções ões referentes ao número de 
células, peso de algum componente celular (ex. 
proteínas) ou peso seco total.
� Crescimento em bacteriologia refere-se ao aumento 
da população.
� Existem vários métodos que podem ser empregados 
na contagem do ncontagem do núúmero total mero total de células ou na 
mensuramensuraçção da massa ão da massa celular.
� O método de contagem em placa baseia-se no fato 
de que quando uma ccéélula isolada lula isolada cresce em meio 
sólido, dará origem a uma colôniacolônia.
� Presume-se que a suspensão bacteriana seja suspensão bacteriana seja 
homogênea homogênea e que não existam agregados ou arranjos.
� Contagem expressa em Unidade Formadora de 
Colônia (UFC/g ou UFC/mLUFC/g ou UFC/mL).
� Procedimento também conhecido como “contagem em 
placa”, muito comum.
� Aplicado para quantificar células: em vacinas, de 
leite, culturas, solos e alimentos, expresso em UFC/mL 
(Unidade Formadora de Colônia).
� Uma ccéélula vilula viáável vel é aquela capaz de multiplicar-se 
e gerar células filhas.
� A contagem de viáveis pode ser feita pela 
semeadura em superfsemeadura em superfíície cie (spread plate) ou 
semeadura em profundidade semeadura em profundidade (pour plate e alternate).
� Geralmente o volume a ser inoculado não deve 
ultrapassar 1 mL (pour plate e alternate) e 0,1 mL 
(spread plate) para evitar a confluência das evitar a confluência das 
colôniascolônias.
� O primeiro passo é fazer as diluições seriadas do 
material contendo os micro-organismos.
�� DiluentesDiluentes usadosusados: solução salina fisiológica, solução 
tampão fosfato ou água peptonada.
� Esta técnica é precisa quando o número de colônias 
situa-se entre 30 e 300 30 e 300 e quando as condições 
culturais e ambientais estão adequadas para os 
micro-organismos analisados.
� Para minimização dos erros há necessidade de 
triplicatas triplicatas para cada diluição.
� Deve-se especificar a temperatura de inoculação.
� Metodologia amplamente utilizada, permite permite a 
contagem de diferentes micro-organismos pelo 
emprego de meios seletivosemprego de meios seletivos.
�� DiluiDiluiççõesões:
� Diluição 1/100: adicionar 1 mL da suspensão da 
cultura de Escherichia coli, em um frasco contendo 99 
mL de solução salina (0,9%) estéril. Agitar o frasco.
� Diluição 1/1.000: adicionar 1 mL da diluição anterior 
em 9 mL de salina estéril.
� Diluição 1/10.000: adicionar 1 mL da diluição anterior 
em 9 mL de salina estéril;
�� Repetir Repetir até a diluição 1/101/1066 ou 1/101/1077.
�� Obs.: Obs.: utilizar uma pipeta para cada diluição.
� IdentificaIdentificaçção das placas ão das placas (em duplicata) de acordo com 
as diluições (10-6, 10-5 e 10-4);
�� AdiAdiçção de 1 mL ão de 1 mL de cada diluição em sua respectiva 
placa;
� Distribuição de 15 mL de meio ATGE 15 mL de meio ATGE (estéril, fundido e 
mantido a 50°C) sobre o inóculo contido nas placas;
� Agitar fazendo movimentos em forma de 8 movimentos em forma de 8 para 
homogeneizar o inoculo com meio;
�� Esperar solidificar Esperar solidificar o meio, inverter as placas inverter as placas e incubincubáá--las las 
a 35°C/ 48h.
PROCEDIMENTO
� A técnica de espalhamento em placa é mais usada 
para aeraeróóbios estritosbios estritos.
� A superfsuperfíície cie do meio de cultura deve estar seca deve estar seca 
para que seja embebida pelo líquido inoculado.
�� IdentificaIdentificaçção das placas ão das placas (duplicata) de acordo com as diluições 
(10-5, 10-4 e 10-3);
�� AdiAdiçção de 0,1 mL ão de 0,1 mL de cada diluição em sua respectiva placa 
contendo meio;
�� Espalhar o Espalhar o ininóóculoculo sobre a superfície da placa com auxilio de uma 
alça de Drigalsky;
� Para que seja usada a mesma alça em todas as diluições, deve-se 
comecomeççar a espalhar a amostra mais diluar a espalhar a amostra mais diluíídada.
� Inverter as placas e incubá-las a 35°C/48h.
PROCEDIMENTO
�� IdentificaIdentificaçção dos tubos ão dos tubos (com ATGE estéril, fundido e 
mantido a 45°C) e das placas e das placas (duplicata) de acordo 
com as diluições (10-6, 10-5 e 10-4);
�� AdiAdiçção de 1 mL ão de 1 mL de cada diluição em seu respectivo 
tubo, homogeneizando o inoculo com o meio;
�� DistribuiDistribuiççãoão nas respectivas placas;
�� Esperar solidificar Esperar solidificar o meio, inverter as placas inverter as placas e incubincubáá--
las las a 35°C/ 48h.
PROCEDIMENTO
� Nessa técnica 1 mL 1 mL da amostra será vertida em um 
tubo contendo 15 mL do meio ATGE a T= 45º C.
� A homogenização é feita no vortex/agitador de 
tubos. 
� Há possibilidade de crescimento em toda a área 
do meio.
� Após as 48h de incubação, organizar as placas segundo a organizar as placas segundo a 
diluidiluiçção crescenteão crescente.
�� Contar as colônias Contar as colônias em cada placa, usando um contador de 
colônias.
�� Registrar Registrar as contagens em duplicata para cada diluição.
� Contagem feitas nas placas com número de colônias entre 
30 e 300.
�� CalculaCalcula--se a concentrase a concentraçção mão méédia dia = número média de 
colônias X inverso da diluição. 
�� OBS: OBS: No caso de alíquota de 0,1 mL, o resultado deve ser 
multiplicado por 10.
Diluição Contagem (colônia/placa)
Pour plate Pour plate alternate Spread plate Concentração média 
UFC/ml
1 x 10-4
1 x 10-4
1 x 10-5
1 x 10-5
1 x 10-6
1 x 10-6
1 x 10-7
1 x 10-7
Resultado da contagem obtida
� Caso em uma mesma diluição as placas apresentem 
contagens:
�� Uma placa entre 30 e 300 (Uma placa entre 30 e 300 (normal) ) e a duplicata duplicata com 
menos de 30 ou mais de 300 menos de 30 ou mais de 300 colônias (fora do padrão):
�� Contar as duas placas, considerar o nContar as duas placas, considerar o núúmero de colônias de mero de colônias de 
ambas, utilizando a mambas, utilizando a méédia para calcular o ndia para calcular o núúmero de UFC mero de UFC ��������
situação 2
� Caso em duas diluições consecutivas, contagens entre 30 e 300 
(dentro do padrão) (situação 3):
�� Contar as placas de ambas diluiContar as placas de ambas diluiççõesões, calcular o número de UFC de cada 
diluição e comparar os resultadoscomparar os resultados. 
�� Dividir o maior resultado pelo menorDividir o maior resultado pelo menor
� Se < 2
� considera-se os 2 resultados
�� Resultado finalResultado final: : média das contagens 
� Obs: lembrar de colocar na mesma potência.
� Se > 2
� considera-se apenas o menor.
� Caso as placas da menor diluição não apresentem 
aparecimento de colônias: ESTIMAR OS 
RESULTADOS (situação 4).
� Considerar < 1 e expressar resultado como contagem 
estimada e < 1 x 10-1.
� Caso todas as placas apresentem mais de 300 
colônias: ESTIMAR OS RESULTADOSESTIMAR OS RESULTADOS.
� Se for possível contar todas as colôniascontar todas as colônias, deve-se 
contar e calcular o número de UFC a partir da 
contagem.
�� Dividir as 2 placas da maior diluiDividir as 2 placas da maior diluiçção ão em secções 
radiais (2, 4 e 8). Contar as colônias em um ou mais 
quadrantes. 
�� Multiplicar Multiplicar o resultado pelo npelo núúmero de quadrantes mero de quadrantes 
que a placa foi dividida (situação 5). 
� Caso nenhuma placa tenha menos de 30 colôniasmenos de 30 colônias: 
ESTIMAR OS RESULTADOS.
� Contar as placas com número de colônias mais próximo de 30, 
calcular o número de UFC e apresentar os resultados comcontagem estimada.
� O número de colônias obtidas depende do 
tamanho do inóculo, da qualidade do meio de 
cultura e das condições e tempo de incubação.
� Determinar as condições de incubação que 
propiciam o melhor crescimento das colônias para 
cada organismo: meio de cultura, tempo e 
temperatura de incubação.