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HPLC resumo

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CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO DE ALTO DESEMPENHO (HPLC) 
 
É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas 
de materiais especialmente preparados e uma fase móvel que é eluída sobre 
altas pressões. Ela tem a capacidade de realizar separações e análises 
quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos 
de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, 
eficiência e sensibilidade. 
 
DESCRIÇÃO GERAL DE HPLC 
 A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna 
cromatográfica preenchida com a fase estacionária (FE) 
 Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os 
componentes da mistura através da coluna. Esses se distribuem entre as 
duas fases de acordo com suas afinidades 
 As substâncias com maior afinidade com a FE movem-se mais 
lentamente. Já as substâncias com pouca afinidade com a FE movem-se 
mais rapidamente. 
 Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um 
sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma. 
 
APARELHAGEM 
 
O cromatógrafo tem os seguintes componentes principais: 
 Reservatório de eluente (FM) 
 Bomba 
 Injetor 
 Pré-coluna 
 Coluna de 250 × 4 mm (Merck, Lichrosphere RP-18) 
 Detector de ultravioleta, λ = 225 nm 
 Registador/integrador (Aquisição de dados). 
 
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AMOSTRA 
A amostra é colocada no loop da válvula de injeção por meio de uma seringa 
(ver figura 2), quando esta está em posição de carga (posição: load). Rodando 
o manípulo da válvula para a posição de injeção (posição: inject), dá-se uma 
alteração no trajeto do eluente no interior desta e a amostra é então arrastada 
para a coluna. O eluente, que é continuamente bombeado para a coluna, vai 
arrastar os componentes da amostra (designados vulgarmente por solutos) 
primeiro para o topo e depois ao longo da coluna. 
 
Figura 2 - Representação esquemática da válvula de injecção e do processo de 
introdução de amostras na coluna de HPLC. 
(A) Introdução da amostra no loop da válvula, 
(B) Introdução da amostra na coluna. 
 
 
Se os solutos tiverem alguma afinidade pela fase estacionária da coluna, ao 
longo desta vão-se estabelecer sucessivos equilíbrios de distribuição dos solutos 
entre a fase móvel (o eluente) e a estacionária. Se as constantes de distribuição 
 
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para os diversos solutos forem suficientemente diferentes, estes irão deslocar-
se ao longo da coluna a velocidades diferentes, saindo da coluna separados uns 
dos outros. 
Em seguida os componentes da amostra passam a um detector, que neste 
trabalho consiste num espectrofotómetro de UV/Vis com uma célula de fluxo 
especialmente desenhada para permitir a medida da absorvância da solução que 
nela passa sem que se dê alargamento significativo da zona de líquido onde está 
cada um dos solutos. 
Um registador, que está ligado ao detector, permite obter automaticamente o 
sinal enviado por este o qual, em primeira aproximação, é proporcional à 
concentração do componente na solução que passa nesse instante através da 
célula do detector. A representação gráfica do sinal enviado pelo detector em 
função do tempo que decorreu desde a injeção da amostra na coluna constitui o 
que se designa por cromatograma da mistura. Sendo conhecido o caudal de 
eluente, se necessário pode transformar-se a escala de tempos em volumes de 
efluente. 
 
FASES ESTACIONÁRIAS 
As FE são constituídas de material sólido, granulado, finamente dividido e 
densamente empacotado dentro de um tubo feito de material inerte, 
normalmente aço. O material sólido pode estar revestido ou ligado quimicamente 
a um líquido. 
TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIA 
 FE SÓLIDA 
 FE POR EXCLUSÃO 
 FE POR TROCA IÔNICA 
 FE POR BIOAFINIDADE 
 FE QUIMICAMENTE LIGADA 
 NORMAL 
 REVERSA 
 
FASE ESTACIONÁRIA QUIMICAMENTE LIGADA 
São as fases mais importantes da cromatografia líquida Obtidas pela reação dos 
grupos silanois da sílica com compostos contendo grupos polares (Fase Normal) 
ou não polares (Fase Reversa). 
Na Fase Quimicamente Ligada, a sílica gel, através dos grupamentos Si - OH, 
se liga quimicamente a um grupo funcional que lhe confere grande estabilidade 
química. 
A “Cromatografia de Fase Ligada” é subdividida em Fase Normal e Fase Reversa 
de acordo com a polaridade dos grupos funcionais ligados à sílica gel. 
 
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As notáveis propriedades deste tipo de material fazem da Cromatografia de Fase 
Ligada a mais utilizada em todo o mundo. 
Para a produção das Fases Quimicamente Ligadas, a sílica gel é submetida a 
um processo de hidrólise formando grupos silanóis SiOH, grupo quimicamente 
ativo no qual se ligará o grupo funcional através de reações de silanização, 
utilizando organosilanos (ex: dimetilcloroocatadecilsilano), mono, di ou 
trifuncionais, dependendo do número de grupos no silano que pode reagir. 
Obtém-se fase monomérica ou polimérica. 
Infelizmente, devido a efeitos estéricos, muitos grupos SiOH não 
reagempermanecendo ativos e provocando encaudamento dos picos. 
Ligação química tradicional usando silano monofuncional alcança um máximo de 
50% ou uma densidade de ligante de ~4µmol/m2. 
Para atenuar este problema, emprega-se um processo conhecido como 
“Endcapping”. 
 
Endcapping 
 Para minimizar o efeito dos grupos silanol residuais é necessário um 
passo secundário de ligação para cobrir esses grupos ainda presentes na 
sílica. 
 O processo denominado endcapping efetua-se em geral com 
trimetilclorosilano(TMS). Ainda assim restam grupos silanol livres 
 As sílicas usuais só podem ser utilizadas na faixa de pH 2 – 8, pois os 
grupos TMS sofrem hidrolise a pH menor que 2 e a sílica se dissolve em 
fase móvel contendo água em pH maior que 8. 
 Muitos desses problemas: cauda nos picos de analitos básicos, limitação 
de pH, baixo tempo de vida da coluna, tem sido resolvidos ou minimizados 
através de desenvolvimentos mais recentes, tais como: sílica de alta 
pureza, partículas hibridas, sílica tipo C(sílica hidreto) e novas “químicas 
ligantes”. 
 
FASE ESTACIONÁRIA 
 NORMAL: Grupos Funcionais Polares são ligados à matriz de sílica. A 
técnica, em geral, substitui com vantagens a Cromatografia por Adsorção. 
Grupos funcionais mais comuns: diol, ciano, amino. 
 REVERSA: Em Cromatografia de Fase Reversa, os grupos funcionais 
ligados à base de sílica são apolares. Os analitos são atraidos para a 
superficie pelos seus grupos funcionais não polares. O analito mais polar 
elui primeiro, seguidos pelos outros em ordem decrescente de polaridade. 
Os grupos butil, octil, octadecil e fenila são os mais utilizados. O grupo 
octadecil é responsável pela maioria das separações em fase reversa. 
 
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FASE MÓVEL 
 
O sucesso da separação cromatográfica só é possível se for aplicada uma FM 
correta a uma FE conveniente. A escolha da composição da FM leva em conta 
vários fatores, tais como: 
 Propriedades físico-químicas que afetam a solubilidade, partição e 
adsorção e, portanto, a separação 
 Propriedades físicas que afetam a possibilidade de detecção dos 
componentes 
 Propriedades físicas que dificultam o manuseio das bombas, detectores 
e coluna 
 Propriedades que afetam a segurança (toxidez e inflamabilidade) 
 Custo 
 
Os seguintes parâmetros devem ser considerados para uma escolha 
adequada da FM: 
 Viscosidade 
 Compressibilidade 
 Pressão de vapor 
 Toxidez