Enzimologia- Introdução

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INTRODUÇÃO A ENZIMOLOGIA
Prof. M. Sc. Francisco Marques de Oliveira Neto
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A vida e a energia para a vida
Duas condições fundamentais:
Autorreplicação
Metabolismo
Catálise enzimática
A queima de açúcares é a principal forma segundo a qual retiramos energia do meio ambiente para vivermos
Um saco de açúcar pode permane- cer anos na prateleira do supermercado
A prateleira não tem enzimas!
Nos animais, a glicose libera sua energia química em segundos
Reações catalíticas promovem a oxidação da glicose ao quebrar ligações químicas que armazenam energia
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Participam das vias bioquímicas
Enzimas realizam o controle preciso do metabolismo celular.
O metabolismo energético é um dos principais temas de estudo da bioquímica.
Permitem resposta e adaptação a um meio em mudança. 
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O que são as enzimas?
Proteínas notáveis, altamente especializadas
Alto grau de especificidade com substratos
Poder catalítico extraordinário
Muito maior do que catalisadores sintéticos
Aceleram reações químicas
Em condições suaves de temperatura e pH
São o centro e o objeto de estudo principal da bioquímica
Atuando de forma organizada catalisam centenas de reações que degradam as moléculas dos nutrientes e conservam suas energias
Doenças ocorrem quando elas não funcionam bem
Como os cientistas descobriram as enzimas?
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LOUIS PASTEUR
1835: Berzelius, conceito de catálise 
1885: fermentação do acúcar por lêvedos, gerando álcool
Vitalismo: o mágico élan vital
1896: Edward Buchner consegue fermentar o açúcar num extrato de lêvedo sem vida!
Fermentos, portanto, catalisavam reações químicas (açúcar a álcool) – biocatalisadores
Enzima vem do grego εν ζυμη, cuja tradução é “no lêvedo”
Louis Pasteur
1822-1895
Um pouco de história...
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EMIL FISCHER
 Sacarase
Quebra da sacarose em glicose e frutose
 Produziu diversos análogos de sacarose para testar se a enzima funcionava
Determinadas mutações tornavam os análogos resistentes à sacarase
Modelo de ação enzimática chave-e-fechadura
Hermann Emil Fischer
1852 - 1919
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Enzimas são proteínas?
Qual a natureza das enzimas?
O químico orgânico alemão Richard Willstätter (1872–1942) – ganhador do Nobel pela estrutura da clorofila – conseguiu separar o componente enzimático de um preparado biológico e não encontrou nenhuma proteína!
1926 (EUA) – J Summer cristaliza a urease e conclui: enzimas são proteínas!
 Willstater criticou os resultados…
James Batcheller Sumner
1887-1955
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SIM! Mas como funcionam?
 Kunitz e Northrop 
Eletroforese e centrifugação: enzimas estão na fração protéica!
Mesmo em quantidades proteícas indetectáveis pelos métodos, as enzimas continuavam tendo atividades
 Como as milhares de reações catalíticas eram possíveis a uma proteína?
John Howard Northrop 1891-1987
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1902: Emil Fischer (Estrasburgo) e Hofmeister (Berlim), proteínas eram formadas de aminoácidos que, ligados por ligações peptídicas, formavam cadeias polipeptídicas
POLÍMEROS DE AMINOÁCIDOS?
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Finalmente, Sanger
 1952 
Publica a primeira estrutura primária de uma proteína: a Insulina, com 51 aminoácidos
O trabalho mostrava também que a estrutura das proteínas poderia ser descrita pela sua sequência de aminoácidos, do N ao C terminal
A sequência, entretanto, não ajudava a prever a função da proteína (antes da bioinformática)
Frederick Sanger 13 August 1918
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CONCLUSÃO: HISTÓRIA DA BIOQUÍMICA
As enzimas realizam reações catalíticas e transformam moléculas umas nas outras
Os organismos biológicos são ricos em enzimas e as enzimas funcionam também fora dos organismos biológicos → biotecnologia!
As enzimas são proteínas formadas por polímeros de aminoácidos
A multiplicidade de função se dá pela interação tridimensional formada (modelo chave-fechadura) por interações não-covalentes a partir de uma série de aminoácidos ligados covalentemente (ligação peptídica)
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Toda enzima é proteína?!
Não!, há alguns RNAs que funcionam como enzimas também
Componente químico adicional necessário para a função:
Cofator: íons inorgânicos
Coenzima: moléculas orgânicas complexas
Se liga muito firmemente: grupo prostético
Enzima completa: holoenzima
Parte protéica: apoenzima ou apoproteína
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Nomenclaturase das enzimases
Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do substrato ou à atividade realizada
Urease – hidrolisa a uréia
DNA-polimerase – polimeriza DNA
Pepsina – pepsis vem do grego (digestão)
Sistema de classificação enzimático – EC number
Quatro números: 2.7.1.1
2: transferase
7: fosfotransferase
1: transfere P para grupo OH-
1: tem D-glicose com aceptor
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Reação enzimática
Reação se dá em fases: 
Enzima aumenta a velocidade das reações
Os catalisadores aumentam a velocidade das reações por que diminuem a energia de ativação
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Equilíbrio químico
As enzimas realizam, muitas vezes, as reações nos dois sentidos 
A concentração de substratos e produtos é o que define a velocidade das reações
Poder catalítico das enzimas vem da energia livre liberada na formação de ligações fracas quando da interação enzima-substrato
Interações fracas entre ES são otimizadas no estado de transição
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Bastonase
Pauling (1946): Enzima deve ser complementar ao Estado de transição (ET), não ao substrato
ET não é forma estável
Interações fracas entre a enzima e o substrato propulsionam a catálise enzimática
Necessidade de múltiplas interações fracas explica pq alguns prots são tão grandes
Estabiliza o substrato
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Especificidade enzimática
Deriva da formação de múltiplas interações fracas entre a enzima e a molécula do substrato específico
Redução da entropia pela ligação
Dessolvatação do substrato
Ajuste induzido, proteína tbm muda de conformação
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Grupos catalíticos
Catálise geral ácido-base
Transferência de prótons
Catálise covalente
Formação de lig. covalente transitória entre E e S
Ativação do substrato
Catálise por íons metálicos
Estabilizam estados de transição
1/3 das enzimas conhecidas usam íons metálicos nas reações catalíticas
Enzimas muitas vezes usam as três estratégias de catálise em conjunto -- quimiotripsina
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Cinética enzimática
Experimentos de mutagênese sítio-dirigida permite que os pesquisadores investiguem o papel de cada aminoácido na função protéica
A concentração do substrato [S] influi na velocidade das reações catalisadas por enzimas
Velocidade máxima é abstraída para concentrações excessivas de Substrato
Constante de Michaelis
kM = [S] correspondente a ½ Vmax; 
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Reação enzimática ocorre por etapas
Ligação reversível da enzima ao substrato
Estado estacionário: concentrações constantes de enzima e enzima + substrato
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Reações com 2 ou mais substratos
Enzimas podem formar os chamados complexos ternários ou realizar as reações uma-depois-da-outra
Velocidade das reações químicas depende também da faixa de pH
Maior velocidade está normalmente associada ao pH do ambiente onde a enzima atua
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Inibição reversível
Inibição competitiva
Inibidor compete pela ligação ao sítio ativo
A ligação do inibidor altera os parâmetros cinéticos, tornando a reação mais lenta
Os inibidores irreversíveis ligam-se covalentemente ou destroem grupos funcionais da enzima
Podem ser usados como drogas
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Exemplos de reações enzimáticas
Quimiotripsina
Lisozima 
Hexocinase
Enolase
Beta-lactamases
Proteases do HIV
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A quimiotripsina
Catalisa a hidrólise de ligações peptídicas adjacentes a aminoácidos aromáticos (Trp, Phe, Tyr)
Forma intermediário acil-enzima covalente
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A hexocinase
Sofre um ajuste induzido quando ligada ao substrato
Fosforila um resíduo de glicose
Primeiro passo da via glicolítica
Adição de Xilose “engana” a enzima e faz com que ela fosforile
a água
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A enolase
Realiza desidratação reversível de 2-fosfoglicertato a fosfoenolpiruvato
Dímero com 436aa
Catálise geral ácido base + estabilização do estado de transição
Interações estabilizam intermediário (enolato)
Ligações de H com outros aa’s do sítio ativo contribuem para o mecanismo geral
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A lisozima
Agente antibacteriano natural encontrado nas lágrimas e clara de ovo
Peptideoglicano da parede de bactérias é seu substrato
Constituinte da parede microbiana que protege da lise osmótica
Enzima rompe ligação glicosídica
Monômero com 129 aa’s
Mecanismo específico de ação enzimática ainda é controverso
“mesmo uma infinidade de experimentos não pode provar que algo esteja certo, mas um único experimento pode provar que está errado”. Albert Einstein
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Medicamentos
Muitos são inibidores de enzimas são usados para tratar doenças; desde as dores de cabeça até a AIDS
Penicilina (Alexander Fleming, 1928)
Peptideoglicano: polímero de açúcares e D-aa’s da parede bacteriana
Penicilina interfere na síntese do peptideo glicano ao mimetizar um segmento D-Ala-D-Ala
Inibem reação de transpeptidase
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Os Beta-lactâmicos
Penicilina: degradada no ambiente do estômago
Penicilina V: estável em meio ácido pode ser administrada em via oral
Amoxilina: ampla faixa de ação; antibiótico β-lactâmico + prescrito
O ataque da Ser à porção amida do anel leva a um produto acil-enzima que é praticamente irreversível
Transpeptidase inativa!
Bloqueia síntese da parede bacteriana
Rompe-se devido à pressão osmótica
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As Beta-lactamases
Enzimas que quebram o anel beta-lactâmico das penicilinas
Disseminaram-se em bactérias submetidas à pressão seletiva
O mau uso dos antibióticos
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Guerra contra as bactérias
Acido clavulânico: inativa irreversivelmente as Beta-lactamases
Clavulin: amoxilina + ácido clavulânico
Foram encontradas bactérias resistentes ao ácido clavulânico...
Desenvolvimento e descoberta de novos antibióticos é uma indústria em crescimento
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Os antivirais: (1) o que é um vírus?
Anatomia molecular viral
Ácido nucléico envolto por uma capa protetora feita de proteínas (capsídeo)
Uma única molécula de ácido nucléico de fita simples ou dupla (fita positiva ou negativa)
Genomas compactos
Contêm apenas as proteínas necessárias à replicação viral
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Parasitismo intra-celular
O vírus não tem metabolismo próprio
Não é um organismo de vida-livre
Parasita intra-celular obrigatório
Forma de cristal
Sequestra a maquinaria molecular da célula
Mecanismo moleculares de produção preferencial dos genes virais (fator sigma próprio e específico)
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Variedades virais
Vírus de DNA
Precisam chegar ao núcleo para serem primeiramente transcritos em RNA
Vírus de RNA
Podem atuar no citoplasma
Vírus de RNA com transcrição reversa
Acontece a transcrição reversa do RNA em DNA e o DNA é normalmente integrado ao genoma do hospedeiro
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HIV
SIDA: Síndrome da imunodeficiência humana
Pandemia
Matou 25 milhões de pessoas nos últimos 25 anos
Retrovírus (lentivirus)
2 cópias de um RNA fita simples (fita +)
Nove genes
Capsídeo é formado por cerca de 2000 proteínas
0,6% da população humana está infectada
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AZT (azidotimidina)
Mimetiza um nucleotídeo de timina
Azida no lugar de hidroxila
Prejudica a ação da transcriptase reversa
Atrasa o desenvolvimento dos vírus, ainda que, aos poucos o vírus se torne resistente
Transcriptase reversa mutante passa a não reconhecer mais o AZT
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Outros tratamentos
Inibidores de protease
Impedem a protease do HIV de clivar as proteínas produzindo componentes maduros
Inibidores de integrase
Impedem o vírus de integrar seu DNA no genoma do hospedeiro
Inibidores de fusão
Interferem nas proteínas gp120 e gp41 ou bloqueiam receptores celulares de ligação ao HIV
Coquetel anti-AIDS
dificulta a adaptação do vírus a várias frentes moleculares de ataque, diminui comprovadamente o número de vírus no sangue
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Proteases do HIV
O RNA do vírus é traduzido em grandes proteínas
Essas proteínas precisam ser hidrolisadas em proteínas individuais do capsídeo
A protease do HIV é uma aspartil-protease
2 resíduos de Asp facilitam ataque da água à ligação peptídica
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Inibidores de proteases
Drogas que formam complexos não-covalentes com a protease do HIV
Ligam-se fortemente: praticamente irreversíveis
Cadeia principal com grupo hidroxil próximo a grupo benzil
Grupo hidroxil mimetiza a água
Resto da estrutura encaixa nas fendas da enzima
Estrutura planejada para ser análoga ao estado de transição
Sucesso terapêutico
Aumentou longevidade e qualidade de vida dos doentes
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Enzimas regulatórias
Possui atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a certos sinais
Ajustes na velocidade da via metabólica permite que as células se adaptem a condições em variação
Tipos mais comuns
Enzimas alostéricas (ligações reversíveis a compostos)
Modificações covalentes
Ativadas por remoção de segmentos peptídicos (irreversível)
Subunidade regulatória é normalmente diferente da subunidade catalítica
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Enzimas alostéricas
Homotrópicas: o ativador é o próprio substrato (hemoglobina)
Heterotrópicas: outro ativador
Enzimas alostéricas
Mais de um sítio regulatório
Cada um específico para um regulador
Aspartato-transcarbamoilase
12 cadeias polipeptídicas
Azul: catalíticas
Vermelho/Amarelo: regulatórias
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Enzimas alostéricas são reguladoras
... de vias bioquímicas
Normalmente são o primeiro passo da via
“economiza” a execução das outras reações
Único passo de regulação da via
Inibição por retroalimentação: São inibidas pelo produto do último passo
Inibição alostérica heterotrópica
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Regulação por modificações covalentes 
500 tipos diferentes Modificações pós-traducionais covalentes já foram descritos
Proteínas inteiras podem ser adicionados como a ubiquitina e a sumo
Ubiquitinilação marca proteína para degradação
Sumoilação é encontrada em proteínas nucleares
Mudanças substanciais afetam de forma significativa a função da enzima
Fosforilação é a mudança mais comum
Podem haver vários sítios fosforiláveis
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Proteínas cinases e fosfatases
Cinases: adicionam grupo fosforil a resíduos de Ser, Thr ou Tyr
Básicas: fosforilam resíduos de vizinhança básica
Atómos de O2 do grupo fosforil podem fazer pontes de H com outras regiões da proteína
Reestabiliza a proteína estruturalmente
Atuam em cascatas de sinalização celular
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Cinases sítio-específicas
Fosforilações são sítio-específicas
Cada enzima reconhece uma ordem de aminoácidos e os fosforila
Sítio de reconhecimento
Sítio de fosforilação
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Fosforilações múltiplas
São possíveis e permitem controle requintado da regulação
Glicogênio sintase
Catalisa a união de glicoses para formar glicogênio
Fosforila em vários sítios
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Proteólise de precursores
Proteases não podem ser produzidas em estado ativo
Do contrário destruiriam as proteínas celulares...
Zimogênios são precursores das proteínases
Só funcionam depois da ativação por proteínas 
Ativação irreversível
Mecanismo de produção de pró-proteínas ou pró-enzimas
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Conclusões
A atividade das vias metabólicas é regulada pelo controle da atividade de certas enzimas
O conhecimento do mecanismo de ação das enzimas permite desenvolver medicamentos que inibam essa ação
A inibição de uma enzima pode ser reversível ou competitiva
Os principais mecanismos de catálise são: ácido-básica, covalente e por íons metálicos
As enzimas são catalisadores eficazes, aumentando a velocidade de ocorrência de uma reação
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aracnomarques@yahoo.com.br
OBRIGADO!
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