Imunodiagnostico das doencas congenitas (DISCENTE JOAO PAULO)

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Diagnóstico Laboratorial das Doenças Congênitas
Profa Eloisa
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Toxoplasmose
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Introdução:
Distribuição: Mundial.
Infecta aves, mamíferos e o homem
Hábitat: Líquidos orgânicos (saliva, leite, esperma, líquido peritoneal) vários tecidos, células (exceto hemáceas) 
A toxoplasmose é uma zoonose causada pelo protozoário Toxoplasma gondii.
protozoário intracelular com tropismo por tecido nervoso e células embrionárias
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Patogenia:
Adulto:
Toxoplasmose congênita ou pré-natal:
forma mais grave
Mãe precisa estar na fase aguda da infecção
Consequências para o feto – dependem do grau de exposição aos toxoplasmas, da virulência da cepa, da capacidade dos Acs maternos protegerem o feto e do período de gestação
Abortos, partos prematuros, fetos com anomalias graves (coriorretinite, retardo psicomotor, alteração do volume do crânio) e morte fetal (40-50%) 
Toxoplasmose pós-natal
retinocoroidites
menigoencefalites
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Diagnóstico laboratorial
I- Pesquisa do parasita ou seus antígenos:
Isolamento do Toxoplasma
Inoculação em camundongos: 
sangue/líquido cefalorraquidiano, amniótico, bronquio-alveolar é inoculado por via intraperitoneal em camundongo 
Pesquisa de taquizoítos no líquido peritoneal
Resultado em 30 dias ou mais
Isolamento em cultura de células
Cultura de fibroblastos humanos ou outras linhagens celulares
Toxoplasmas no interior das células evidenciados por imunofluorescência
Resultado: até uma semana
Pesquisa de Ags
Material antigênico do toxoplasma ou complexos imunes de antígenos parasitários: podem ser detectados no soro na fase aguda - Pouco valor diagnóstico
Pesquisa do parasita ou Ags – tecidos – imunohistoquímica (Acs específicos e coloração imunofluorescente ou imunoenzimática)
PCR
Segmentos de DNA – genes P30, TRG1, B1 ou DNA ribossomal = maior sensibilidade
Pesquisa no líquido amniótico, sangue do cordão umbilical, sangue venoso, biópsia cerebral, líquido cefalorraquidiano
Não permite distinção entre taquizoítos (fase aguda) e formas císticas (crônica), ou seja, entre infecção ativa e dormente 
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Diagnóstico laboratorial
II- Testes Sorológicos
Imunofluorescência Indireta
Identificação de Acs IgG e IgM
Soros reagentes – São titulados em diluições crescentes sobre toxoplasmas fixados em lâmina de microscopia
ELISA
IgM e IgA (infecção aguda)
IgG – infecção tardia
Método de captura para IgM
Extrato solúvel do protozoário
Hemaglutinação
Extrato solúvel
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Testes Sorológicos
IgM
Sujeito a falso-positivo – interferência de fatores reumatóides com frequência presentes no soro
Fator reumatóide (FR) – é uma IgM contra IgG
Quando Acs IgG a-toxoplasma, presentes no soro, fixam-se aos Ags do parasita, o FR fixa-se aos IgG e irá reagir com o conjugado a-IgM
Solução: remoção prévia do IgG por precipitação com um soro a-IgG
ELISA de captura para IgM
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Perfil sorológico
3 perfis sorológicos:
Perfil I - Vigência da parasitemia – aguda ou recente
Primeira semana – surgem Acs específicos IgM, IgA, IgE e IgG (baixa avidez) – característica de toxoplasmose recente
Perfil II – Evolução da Infecção – Perfil sorológico de transição
Níveis elevados de Acs IgG (avidez crescente)
Ausência de IgA e IgE, assim como IgM (ou em baixos títulos)
Perfil III – Perfil de infecção latente ou crônica
Mantém por toda a vida – indica que pode ocorrer reativação
IgG de baixos títulos e alta avidez
Ausência de outros Acs
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Teste de Avidez de Acs IgG
Afinidade ou avidez com que os Acs IgG ligam-se a seus respectivos antígenos
Pode ser avaliada pela maior ou menor facilidade de quebra dessa ligação
ELISA – Uréia:
ELISA-IgG modificado
Dissociação dos complexos Ags-Acs formados e liberação dos anticorpos IgG de baixa avidez por meio de solução uréia 6M 
Após incubação do soro a placa é lavada com uma solução de uréia e, em seguida, prossegue-se a reação
Baixa avidez é indicada por acentuada diminuição do título com relação ao título original sem tratamento com uréia
Resultado em % = (título após uréia/título original)x100
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Toxoplasmose Congênita
Diagnóstico fetal
Líquido amniótico – 20 a 22 semanas de gestação – detecção do parasita (isolamento ou PCR)
Presença de IgM, IgA e/ou IgE – cordão umbilical ou sangue de recém-nascidos – diagnóstico para infecção congênita
IgG alta/baixa avidez 
Acs de baixa avidez podem ser detectados por 3 a 4 meses, definindo os casos de infecção recente
IgG de alta avidez pode indicar infecção por T.gondii pelo menos 3 a 5 meses antes da gestação
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Rubéola
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Etiopatogenia
O vírus da rubéola é um vírus RNA, pertencente ao gênero Rubivirus, família Togaviridae.
O homem é o único reservatório conhecido.
Transmissão: inalação do aerossol contendo altas concentrações de partículas virais que infectam células do trato respiratório superior e da faringe, onde ocorre a primeira multiplicação.
O período de maior contágio varia de cinco e seis dias antes e vai até depois do surgimento do enxantema (manchas avermelhadas no corpo). 
vírus Togavírus 
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Vacinação
Única forma de prevenção
Vacina vírus vivo e atenuado
Tríplice viral: rubéola, sarampo e caxumba –calendário vacinal da rede pública
Notificação obrigatória – rubéola e Sindrome da Rubéola Congênita
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Síndrome da Rubéola Congênita
A transmissão do vírus da rubéola ao feto pode ocorrer durante todo o período de gestação, sendo mais intensa no início da gravidez.
Primeiro trimestre – 67 – 90%
Segundo trimestre - 25 a 67%
Terceiro Trimestre – 35 a 100%
Pode resultar no nascimento de criança sem nenhuma anomalia, mas pode provocar abortamento espontâneo, natimortalidade ou nascimento de crianças com anomalias simples ou combinadas. 
Crianças congenitamente infectadas podem excretar o vírus nas secreções respiratórias e na urina por meses ou anos – risco de contaminação durante esse período.
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Diagnóstico
Testes Sorológicos
ELISA
Detecta anticorpos específicos IgM (infecção ativa)
Infecção congênita – IgM aparecem desde o nascimento e perduram até 180 dias de vida.
PCR
Detecta material genético do vírus (urina e secreção nasofaríngea.
Isolamento viral em cultura de células
Identificar genótipo do vírus
Diagnóstico histopatológico
Realizado a partir de coleta de material post-mortem.
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Diagnóstico sorológico
Rubéola Congênita
A presença de anticorpos IgM específicos para rubéola, no sangue do recém-nascido, é evidência de infecção congênita
 Os anticorpos IgM podem ser detectados em 100% das crianças com SRC até o 5º mês; em 60% de 6 a 12 meses e em 40% de 12 a 18 meses. Raramente são detectados após o 18º mês.
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Diagnóstico sorológico
Os anticorpos maternos, da classe IgG, podem ser transferidos passivamente ao feto através da placenta, sendo também encontrados nos recém-natos normais, nascidos de mães imunes à rubéola. 
Se a quantidade de anticorpos IgG maternos diminui com o tempo, desaparecendo por volta do 6º mês
Monitoramento
IgG provavelmente de origem materna
Se há a persistência dos níveis de anticorpos IgG no sangue do recém-nascido
Altamente sugestiva de infecção intra-uterina.
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Citomegalovirus
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Características
O citomegalovírus (CMV) pertence à família Herpesviridae.
Atualmente é considerado como um dos principais causadores de doença no homem.
Infecção primária é seguida pela infecção crônica ou latente por toda a vida do hospedeiro, com reativações periódicas.
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Transmissão
Contato da superfície mucosa com a secreção infectada como saliva, urina, sangue, leite materno e secreções genitais, sangue e transplante de órgãos.
Viremia
Ocorre durante poucas semanas a meses após a infecção.
Infecção congênita ou perinatal – excreção pode persistir por cerca de 5 anos na urina e por 2 a 4 anos na saliva.
Transmissão pode ocorrer durante todo o período gestacional (infecção congênita); durante o parto ou o aleitamento materno (infecção
perinatal); na infância e no adulto (infecção adquirida).
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Transmissão
Transmissão vertical – mãe para o feto
Consequências – variam com a idade gestacional
Mais grave quando ocorre na primeira metade da gestação, até cerca de 16 semanas, com sequelas graves como calcificação intracraniana e retardo no crescimento intra-uterino
Infecção primária materna – taxa de transmissão – 40%
Mães soropositivas previamente à gestação – risco de transmissão congênita é baixo (0,5 – 2%) 
Crianças infectadas – assintomática, com baixo risco de sequelas – proteção parcial da imunidade humoral e celular materna pré-existentes
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Manifestações Clínicas
Seqüelas após CMV congênita
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Alterações laboratoriais – Infeccão Adquirida
Hemograma
Linfocitose relativa e absoluta
Presença de grande número de linfócitos atípicos
Exames bioquímicos
TGO e TGP (enzimas hepáticas) – moderadamente elevadas em 80% dos casos. 
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Diagnóstico laboratorial
Exame histopatológico e citológico
Observação de células grandes com inclusões citoplasmáticas, facilmente visualizadas quando coradas por hematoxilina-eosina, Papanicolau ou Giemsa.
Tecidos (fígado, rim, pulmão), sedimento urinário, lavado gástrico e broncoalveolar
Vantagem: barato e de fácil execução
Desvantagem: alta incidência de resultados falso-negativos
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Diagnóstico laboratorial
Imuno-histoquímica e imunocitologia
Detecção de antígenos específicos em fragmentos de tecidos obtidos por biópsia, ou em autópsias, e em amostras de urina, lavado broncoalveolar e preparações de leucócitos
Emprego de anticorpos monoclonais dirigidos para proteínas do CMV
Revelação feita por imunofluorescência ou por técnicas imunoenzimáticas
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Diagnóstico Sorológico
Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)
Acs IgM – detectados precocemente na infecção primária, com pico em 1 a 3 meses, declinando a seguir até a negativação, em 6 meses.
Acs IgG – pico em 1 a 2 meses, após o início da infecção, persistem por toda a vida
Teste de avidez de IgG – permite realizar o diagnóstico da infecção primária por um período de 4 a 5 meses
Detecção de IgG de baixa avidez – infecção primária; IgG de alta avidez exclui infecção primária.
Encontro de avidez < ou igual 50% numa amostra colhida no primeiro trimestre de gravidez – maior risco de transmissão fetal;
Avidez > 65% - menor risco.
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Diagnóstico
PCR – detecção do DNA viral; RNAm
Cultura do vírus
Isolamento do virus na urina ou na saliva – 2 a 3 semanas de vida – infecção congênita por CMV
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SÍFILIS
Agente etiológico
Treponema pallidum – espiroqueta (bactéria)
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Diagnóstico laboratorial
Evidenciação do Treponema nas lesões
Protossifiloma (lesão primária no local da inoculação), lesões cutâneas ou mucosas
Microscopia direta, em campo escuro, coloração pela prata, Leishman ou Giemsa, imunofluorescência
Detecção de anticorpos suscitados na infecção
Testes lipóidicos ou de cardiolipina (VDRL)
Testes treponêmicos (FTA-ABS) – Imunofluorescência
Hemaglutinação – hemácias revestidas com antígenos de T. pallidum
ELISA – extratos de T. pallidum
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Campo escuro
Coloração pela Prata
Fontana Tribondeau
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Sífilis Congênita
Gestantes com sífilis não-tratada, em especial nas fases secundária e latente precoce, apresentam probabilidade de 70 a 100% de transmissão placentária.
Pode manifestar-se de forma precoce, ao nascimento, semelhante à fase secundária
Lesões mucocutâneas, linfadenopatia, lesões oculares, comprometimento renal e do SNC
Sintomas tardios: Neurossífilis, surdez, comprometimento vascular, alterações ósseas
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Sífilis congênita
40% dos casos de sífilis congênita evoluem para morte fetal
Diagnóstico:
Detecção de anticorpos
Testes cardiolipínicos ou não-treponêmicos
Testes treponêmicos
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Testes cardiolipínicos
VDRL
Veneral Diseases Research Laboratory
O antígeno cardiolipina (monoglicosil-diglicerídeo) é uma emulsão da cardiolipina adsorvida a cristais de colesterol em solução alcoólica, estabilizado com solução aquosa protéica de lecitina
Empregado a mais de 60 anos
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VDRL
Qualitativo – positivou ou negativo
Quantitativo – para soros positivos - título de anticorpos presentes
Amostra de escolha – soro
Plasma pode levar a interferências pela presença do fibrinogênio e de seus produtos
Preconiza-se que se faça o teste com uma amostra não diluída e outra diluída a 1/10, para evitar o fenômeno de pró-zona
Na sífilis secundária pode ocorrer falso negatividade pelo excesso de anticorpos
Leitura: microscópio ou lupa
Reações cruzadas podem ocorrer – doenças auto-imunes (Lupus), artrite reumadóide, infecções agudas bacterianas e virais, malária, hanseníase, pneumonia por micoplasma
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Teste de VDRL
VDRL – Acs interagem com Ag (cardiolipina), formando imunocomplexos que se depositam sobre os cristais de colesterol em meio lecitina, formando grumos visualizados em microscopia óptica
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Testes treponêmicos 
Usam antígenos do T. pallidum
Difícil obtenção - Custo elevado
Elevada sensibilidade e especificadade
Confirmatório 
Hemaglutinação (HA), microaglutinação de partículas (MHA), imunofluorescência (IF) e ELISA
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FTA-Abs
Imunofluorescência indireta
FTA-Abs = Fluorescent treponemal antibody absorption
Usa bactéria íntegra
Leitura em microscópio de campo escuro para imunoflorescência
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ELISA
Extrato solúvel de T. pallidum
Maioria detecta IgG, mas pode ser adaptado para detectar IgM
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Interpretação dos testes
Sífilis primária 
Testes de cardiolipina e treponêmicos se positivam depois do aparecimento, mas ainda na vigência do protossifiloma – VDRL e FTA-ABS (+) = 85% de sensibilidade
Sífilis secundária e latente
VDRL e FTA-ABS = 99 a 100% de sensibilidade
Sífilis tardia = 70% para VDRL e 98% para testes treponêmicos
VDRL – bom para triagem de pacientes, permite acompanhar a terapêutica, pela rápida resposta representada pela queda de títulos e mesmo pela negativação (teste quantitativo)
Testes treponêmicos – não devem ser utilizados para triagem, devem ser reservados para confirmação dos resultados dos testes de cardiolipina (neste caso apresentam alto valor diagnóstico)
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Sífilis congênita
Suspeitos = todos os recém-nascidos e mães portadoras de sífilis não tratada ou insuficientemente tratada
Testes sorológicos
IgG maternos – VDRL e FTA-ABS – tendem a cair e se negativar
Sifílis congênita – IgG são mantidos ou estão em ascensão
VDRL do recém-nascido = 4x ou mais acima dos títulos maternos são evidência de infecção congênita
Casos suspeitos e recém-nascido negativo = repetir sorologia após o terceiro mês de vida
IgM positivo no soro do recém-nascido – diagnóstico para sífilis congênita
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