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CIÊNCIA EQUATORIAL ISSN 2179-9563 Artigo Original Volume 2 - Número 1 - 1º Semestre 2012 REVISÃO TEÓRICA DAS TÉCNICAS UTILIZADAS NA DETECÇÃO DE ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS Tiago Fernando Chaves RESUMO A intoxicação alimentar estafilocócica é provocada pela ingestão de enterotoxinas pré-formadas no alimento contaminado. São toxinas denominadas de enterotoxinas estafilocócicas (EE). Enterotoxina A é a mais relacionada a casos e surtos de intoxicação alimentar, Staphylococcus aureus coagulase-positiva é o principal agente de intoxicação alimentar. Identificar a EE é relevante na elucidação de surtos de doenças alimentares, podendo indicar a fonte de contaminação. Ferramentas empregadas na detecção de EE são cruciais nas pesquisas, divididas em métodos biológicos e imunológicos. Os métodos imunológicos são simples e de baixo custo, á OSP é sensível na avaliação de EE. Nos ensaios biológicos as EE são detectadas pela sua atividade emética in vivo. ELISA é rápido, sensível e permite analisar grande volume de amostras simultaneamente. A técnica Western blot é usada para análise de proteínas detectando EE. RPLA consiste no anticorpo específico ligado covalentemente ao látex, misturado com a amostra onde se há ou não aglutinação. Na imunodifusão a proteína e um anticorpo específico difundem por um gel, formando linha de positividade. A PCR tem resultado imediato. Na avaliação da melhor escolha para a detecção de EE os métodos imunoquímicos são sensíveis, específicos, práticos, rápidos e bem vistos, e proporcionando analisar grande número de materiais. Palavras-chave: Enterotoxinas, Staphylococcus spp., Intoxicação Alimentar, Detecção de Enterotoxinas. THEORETICAL REVIEW OF TECHNIQUES USED IN STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXINS ABSTRACT The staphylococcal food poisoning is caused by ingestion of enterotoxinspreformed in contaminated food. They are called toxins staphylococcalenterotoxin (SE). A enterotoxin is more related to cases and outbreaks of food poisoning, coagulase-positive Staphylococcus aureus is the main agent of food poisoning. Identify the EE is relevant in the elucidation of outbreaks offoodborne illness, which may indicate the source of contamination. Tools usedin the detection of EE are crucial in the polls, divided into biological and immunological methods. Immunological methods are simple and inexpensive, the OSP is sensitive in the evaluation of EE. In biological assays the EE are detected by their emetic activity in vivo. ELISA is rapid, sensitive and allows to analyze large volumes of samples simultaneously. The Western blot techniqueis used to analyze proteins by detecting EE. RPLA is the specific antibodycovalently bound to latex mixed with the sample in which whether or notagglutination. In immunodiffusion protein and an antibody specific for a diffusegel, positive forming line. PCR has an immediate result. In the evaluation of the best choice for the detection of the EE immunochemical methods are sensitive, specific, practical, quick and well viewed, and analyzing providing large number of materials. Keywords: Enterotoxins, Staphylococcus spp., Food poisoning, Detection of enterot. Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1 - 1º Semestre 2012 Página 2 INTRODUÇÃO A intoxicação alimentar estafilocócica é provocada pela ingestão de enterotoxinas pré-formadas no alimento contaminado essencialmente através da manipulação humana, ou da matéria-prima obtida de animais. São toxinas denominadas de enterotoxinas estafilocócicas (EE), pertencentes à família de exotoxinas pirogênicas, com uma relação filogenética comum e seqüências homólogas, são proteínas extracelulares de baixo peso molecular (25.000 a 30.000 daltons), hidrossolúveis, compostas por aminoácidos, estrutura molecular e atividades farmacológicas semelhantes entre si, possuindo, propriedades imunológicas distintas (LEBEAU, 1994; CUNHA, 2006). Enterotoxina A (sea) é a mais relacionada a casos e surtos de intoxicação alimentar, sendo responsável por mais de 75% dos surtos, seguida, em ordem decrescente de freqüência, por EED, EEC e EEB (BALABAN; RASOOLY, 2000; VERNOZY-ROZAND, 2004). Staphylococcus aureus coagulase- positiva o é o principal agente de intoxicação alimentar, embora alguns pesquisadores enfatizem que os estafilococos coagulase- negativos (ECN) são capazes de produzir enterotoxinas estafilocócicas, e devido a estarem envolvidos em uma variedade de infecções humanas e animais, podem ser um potencial causador de intoxicação alimentar (CUNHA, 2006). Muito pouco se sabe sobre o crescimento do ECN em alimentos, esses microrganismos têm sido raramente envolvidos em intoxicações alimentares, porque eles não crescem rapidamente em alimentos, no entanto ECN podem contaminar os alimentos, porque os seres humanos são portadores comuns desses microrganismos e alguns podem ser relacionados a determinadas infecções humanas (CUNHA, 2006). A determinação do tipo de enterotoxinas estafilocócicas é de estrema importância na elucidação de casos e surtos de doenças alimentares sendo que sua identificação nos alimentos indica possível fonte de contaminação (LANCETTE; BENNETT, 2001; NÁJERA-SANCHEZ, 2003). Estudos recentes relacionam as EEA e EEB estão associadas com contaminação humana, através de manipuladores de alimentos, e as EEC e EED ocasionalmente associadas com contaminação animal, geralmente bovino e suíno (NÁJERA-SANCHEZ; CENCI-GOGA, 2003). Devido a esses riscos de contaminações as indústrias de alimentos necessitam de métodos rápidos e confiáveis para determinar a microbiota especifica e o potencial risco patogênico nos produtos. Com isso, as ferramentas para a detecção de EE são cruciais nas investigações de fontes de surtos de intoxicações alimentares, mesmo tendo vantagens e desvantagens no seu emprego. Ferramentas baseadas em ácidos nucleicos, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), podem ter grande impacto para resultados imediato, pelo fato de a PCR detectar uma região única de um genoma bacteriano, a técnica demonstra maior especificidade quando comparada com os métodos microbiológicos tradicionais. (VAN DER ZEE, 1997). A utilização de técnicas in vivo é uma ferramenta baseada em ensaios biológicos, onde o uso de animais é fonte de investigação dessas EE, suas desvantagens destacam se a variação na sensibilidade dos animais, a incapacidade de diferenciação entre os sorotipos das enterotoxinas, o desenvolvimento de resistência do organismo e o alto custo dos ensaios (SANTILIANO et al, 2011). Ensaios imunológicos também ferramentas utilizadas na detecção de EE em alimentos, dentre eles o ELISA (Enzyme- linked Immunosorbent Assay), destaca se devido à sua simplicidade e sensibilidade, sendo baseado no uso de anticorpos policlonais ou monoclonais específicos para as enterotoxinas, o ELISA utiliza uma matriz sólida, sendo normalmente padronizado em microplacas ou em esferas de poliestireno revestidas com anticorpo permitindo uma fácil visualização de resultados e pode ser finalizado sem a adição de materiais radioativos (DORO et al, 2004). O Western blot é outra ferramenta que se baseiam em detecção imunológica, sendo amplamente usada para análise de proteínas, permitindo assim ser usado para detectar EE. A Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1 - 1º Semestre 2012 Página 3 Aglutinação Reversa Passiva em Látex (RPLA- Reversed Passive Latex Agglutinations) é outra ferramenta baseada em ensaio imunológico, anticorpos específicos aderidos a partículas de látex, apresentando uma sensibilidade de 1 ng/mL (WONG, 2002). Uma ferramenta de referência é aimunodifusão, que requer de três a dez dias para obtenção dos resultados. Neste método, a proteína e um anticorpo específico difundem por um gel e a reação entre ambas as forma uma linha de precipitação característica de positividade na detecção das toxinas (SANTILIANO et al, 2011). A técnica de Sensibilidade Ótima em Placas (OSP- Optimum Sensitivy Plate) permite a detecção de 0,5 ug de EE/mL, sendo sua sensibilidade adequada para maioria das cepas enterotoxigênicas, não sendo possível detectar linhagens pouco produtoras (WONG; BERGDOLL, 2002). STAPHYLOCOCCUS Observados pela primeira vez de um material purulento em 1878 por Robert Kock, onde sua publicação no ano 1881 caracterizava a sua forma de cocos e sua presença em abscessos agudos e crônicos. A relação dos Staphylococcus spp. com surtos de intoxicação alimentar só foi evidencia em 1884, no Michigan, EUA, devido a casos onde ocorreu consumo de queijo tipo cheddar contaminado com estafilococos (PEREIRA et al., 2000). De acordo com Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, o gênero Staphylococcus (do grego “staphyle” = cacho de uvas e “coccus” = semente ou grão) pertence à família Micrococcaceae (KONEMAN et al., 2001) se apresentando em forma de coco onde tendem formar agrupamento semelhante a cachos de uva, são bactérias Gram positivas, com diâmetro variando entre 0,5 e 1,5 μm, imóveis e não formam esporos, possuem metabolismo fermentativo e respiratório, mesófilos com temperatura de crescimento entre 7 e 47,8ºC e temperatura ótima entre 40 e 45ºC, seu pH ideal para crescimento é entre 7 a 7,5, porem eventualmente ocorre sua multiplicação em alimentos com pH na faixa entre 4,2 e 9,3, são capazes de sobreviver e se multiplicar em uma concentração de cloreto de sódio de até 15%, são únicos com a capacidade de se multiplicarem em substratos com baixos níveis de atividade de água, em torno 0,86 com relatos de crescimento em 0,83, valores inferiores ao considerados mínimos para outros grupos de bactérias halófilas. O gênero é dividido em dois grupos com base na produção da coagulase; as espécies coagulase- negativas são distinguidas das S. aureus, S. delphini, S. intermedius, S. schleiferi coagulans e algumas cepas de S. hyicus (coagulase-positiva) pela sua incapacidade de coagular plasma de coelho, as bactérias pertencentes ao gênero Staphylococcus são sensíveis à ação da lisostafina, característica esta que permite a sua diferenciação do gênero Micrococcus (TRABULSI et al., 2002). Diferem também dos Micrococcus spp. por serem oxidase-negativa, fermentarem glicose em anaerobiose, possuírem ácido teicóico como constituinte de sua parede celular e DNA com conteúdo bastante reduzido de Guanina + Citosina (GC) (30 a 39%) (ANDRADE, 2008), Staphylococcus spp. tem uma distribuição ubiquitária, seu reservatório primário são as membranas mucosas e pele, especialmente a região naso-faríngea de mamíferos e aves, o gênero atualmente compreende 41 espécies e 24 subespécies, entre seus representantes 20 são associados a uma ampla variedade de infecções de caráter oportunista, em seres humanos e animais (KONEMAN et al., 2001). Entre as três principais espécies de cocos Gram positivos patogênicas para o homem estão: S. aureus, S. epidermidis e S. saprophyticus (TRABULSI et al., 2002), sendo que o S. Aureus é a espécie mais virulenta e o patógeno com maior relevância sendo ele responsável por uma imensa quantidade de problemas médicos, incluindo infecções de pele e tecidos moles, infecções de sítios cirúrgicos, endocardites e bacteremias adquiridas em hospitais. Um grande número de infecções já foi relatado por conta do desenvolvimento de procedimentos médicos, incluindo o uso de próteses, imunossupressores e cateteres (CASEY; LAMBERT; ELLIOTT, 2007). Entretanto a incidência de infecções causadas por estafilococos coagulase-negativa vem aumentando em todo o mundo (SAKAI, 2004. Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1 - 1º Semestre 2012 Página 4 EUSÉBY, 2009). No gado, a infecção pelo Staphylococcus spp. provoca a mastite estafilocócica, vindo a contaminar o leite a ser consumido ou utilizado no preparo de seus derivados, podendo causar intoxicação alimentar (FRANCO; LANDGRAF, 2002). ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS As enterotoxinas compreendem uma família de múltiplos sorotipos (Sea-See Seg- Sej) sendo 18 diferentes EE, com sua classificação baseada nas suas características antigênicas. Porém recentes estudos complementam as novas descobertas de enterotoxinas sendo elas SEK, SEL, SEM, SEM, SEO, SEP, SEQ, SER e SEU. A filogenética existente entre as enterotoxinas é estimada pela análise da seqüência de nucleotídeos de seus respectivos genes, onde a heterogeneidade das toxinas produzidas deve- se a uma seleção genética para a modificação das seqüências de seus aminoácidos, suas cadeias polipeptídicas apresentam quantidades apreciáveis de lisina, acido aspártico, ácido glutâmico e tirosina. Seqüências divergentes das EE possibilitaram dividi-las hierárquica em dois grupos distintos. O grupo que consiste em genes codificadores da EEA, EEE, EED, tendo uma homologia de seqüência na sua cadeia de aminoácidos variando entre 51 e 81%. E o outro grupo compreende a EEC, EEB, com uma seqüência homóloga de 42 a 67%. EEJ, bem como as EEI e EEH foram caracterizadas recentemente com uma homologia com as outras enterotoxinas variando entre 52 e 66% e 31 e 38%, respectivamente. Os genes das EE são controlados por um complexo sistema global regulatório, o gene acessório regulador (agr), atuam em combinação com o acessório regulador estafilococal (sar) , genes seb, sec e sed têm sido demonstrados como agr dependentes, enquanto os sea e sej como agr independentes. A expressão do agr- dependente em alimentos está correlacionada com quantidade de S. aureus e aos fatores ambientais (LOIR et al., 2003; WONG, 2002). Estes genes são carreados por plasmídios - sed e sej, por fagos - sea e see, ou pelo cromossomo - seb, sec, seg, seh, sei, sek, sel, sem, sen, seo, sep e seq (LETERTRE et al., 2003). Característica importante das EE é a resistência à inativação por proteases gastrointestinais, a ação da pepsina, característica que explica a capacidade de permanecerem ativas após sua ingestão e a manutenção de sua atividade em certos alimentos, a produção de enterotoxinas acontece em concentrações de sal de até 10%, sua termoestabilidade, extremamente importante em termos de segurança alimentar, uma vez que elas permanecerão ativas no alimento mesmo após seu processamento térmico (JARRAUD, 2001; DINGES, 2000; ZOCCHE, 2005), essa termoestabilidade das EE tem grande influencia do meio onde esteja inserida e podem ser sensíveis a variação do pH, concentração salina e dentre outros fatores ambientais correlacionados ao nível de desnaturação da toxina, enterotoxinas termorresistentes são produzidas em temperaturas entre 10 e 46ºC, baixas temperaturas pode ser usada no controle da produção de enterotoxinas, pois a multiplicação bacteriana diminui e a síntese de enterotoxinas é quase totalmente inibida.(SORIANO, 2002;BALABAN; RASOOLY, 2000). As EE têm propriedades superantigênicas, de onde vem a denominação de superantígenos, esses antígenos não são processados e apresentados pelos macrófagos, em associação com a molécula do complexo de histocompatibilidade da classe II (MHC II), porém possuem a capacidade de interagir ao mesmo tempo com essa molécula e com o receptor dos linfócitos auxiliares que as reconhecem. Devido a essas características, os superantígenos unem macrófagos e linfócitos T, mas como não são preparados pelos macrófagos, esta união é indiscriminada, formando-se muitospares de macrófagos e linfócitos T. pelo fato de ocorrer esse tipo de associação, expressiva quantidade de linfócitos T são simultaneamente estimulados, ocorrendo elevada produção de interleucina 2 (IL-2), onde em grande quantidade, entra para a corrente sangüínea, ocasionando uma variedade de sintomas, como febre, náuseas e vômitos. Ocorrendo a proliferação abundante de linfócitos T e a conseqüente produção Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1 - 1º Semestre 2012 Página 5 excessiva de IL-2 determinam a produção excessiva de outras interleucinas, o que pode resultar em choque, processo que torna as EE semelhante à toxina da síndrome do choque tóxico (TSST-1) (TRABULSI; TEIXEIRA, 2004). Outros dois mecanismos de ação são apresentados em estudos relacionados à ingestão das enterotoxinas e a ocorrência de sintomas patogênicos. Depois de ingeridas, as EE ligam-se aos seus receptores que estão localizados no intestino. Gerando estímulos que são transferidos através dos nervos vago e simpático até o centro do vômito, induzindo o retroperistaltismo do estômago e do intestino delgado. O outro mecanismo sugerido e pouco elucidado, parece se relacionar a ativação de um mecanismo secretor de sódio e cloro, provocando um desequilíbrio hidroeletrolítico no intestino, por conseqüência ocasionando a diarréia (FRANCO; LANDGRAF, 2002). Enterotoxina A (sea) é responsável pela maioria dos casos de intoxicações em humanos, com doses tão baixas quanto 100 ng da proteína, capaz de promover surtos alimentares (EVENSON et al., 1988) e uma concentração equivalente a 1pg por mililitro de SEA desencadeia a proliferação de linfócitos de ratos e humanos in vitro, ela é considerada a EE principal pelos surtos alimentares em todo o mundo (RASOOLY,1997; BALABAN, 2000). INTOXICAÇÃO ALIMENTAR ESTAFILOCÓCICA Doenças transmitidas por alimentos (DTA) têm um grande impacto na saúde pública. Segundo o Centro para o Controle e Prevenção de Doenças “CDC - Center for Diseases Control” a cada ano, nos Estados Unidos, entre 76 a 80 milhões de pessoas sejam afetadas por essas doenças, gerando em torno de 325 mil internações hospitalares e causando 5.200 mortes (Center for Diseases Control, 2009) e um custo entre 5 e 17 bilhões de dólares com medicamentos, internamentos e queda na produtividade (SANTANA et al, 2010) sendo que 4,5% das DTAs que ocorrem anualmente nos Estados Unidos da America se atribuem ao o S. aureus (U.S. Departament of Agriculture, 2004). Já na França, 1.267 surtos de doenças veiculadas por alimentos ocorreram nos anos de 1999 a 2000, totalizando 17.378 indivíduos afetados, e 1.383 hospitalizações com um óbito, no Brasil, anualmente são notificados cerca de 620 surtos em media, gerando 12 mil casos de DTAs, entre os anos de 2009 a 2010 foram notificados aproximadamente 1700 surtos alimentares e 1800 casos, sendo no segundo ano as notificações somam a metade do primeiro no numero de surtos (ANVISA, 2011). De acordo com o Sistema de Informação sobre Mortalidade (SIM), de 1999 a 2002, ocorreram 25.281 óbitos por DTAs, com uma média de 6.320 óbitos/ano e um custo entorno de 280 milhões de reais com internamento entre 1999 a 2004, média de 46 milhões de reais ao ano (SANTANA et al. 2010). Se tratando das intoxicações estafilocócicas sua real frequência no Brasil é desconhecida, devido a erros de diagnósticos, por serem similares a outras intoxicações (Bacillus cereus - toxina do vômito); por coletas inadequadas, exames laboratoriais impróprios ou investigações epidemiológicas inadequadas dos surtos, e por ser uma doença de notificação não compulsória. Dos casos onde o a gente etiológico foram identificados nos surtos alimentares de 2000 a outubro de 2011, S. aureus foi o segundo microrganismo mais envolvido, estando presente em 800 surtos (ANVISA, 2011). No estado de São Paulo foram notificados 25 surtos por S. aureus, envolvendo quase 200 pessoas, nos anos de 2001 e 2002, em Minas Gerais entre ao nos de 1995 a 2001 foram 12.820 pessoas intoxicadas causando 17 mortes após ao ingerirem alimentos contaminados por EE, segundo o Instituto Panamericano de Proteção dos Alimentos e Zoonoses nos anos de 1993 a 2002, foram notificados 18 surtos de intoxicação estafilocócica envolvendo produtos lácteos (BALABAN; RASOOLY, 2000). Intoxicação alimentar estafilocócica é resultado da ingestão de alimentos contaminados com EE. Leite e derivados lácteos, como leite cru, leite pasteurizado, leite UHT e queijos, são os alimentos mais envolvidos com intoxicação alimentar estafilocócicas, no entanto, tortas recheadas com creme, saladas de batata, atum, frango e Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1 - 1º Semestre 2012 Página 6 derivados cárneos, podem ser veículos do microrganismo e de suas enterotoxinas (FRANCO; LANDGRAF, 2002; CENCI- GOGA, 2003). A intoxicação estafilocócica raramente é letal, sendo que as fatalidades da intoxicação ocorrem ocasionalmente em indivíduos debilitados imunologicamente, idosos são mais susceptíveis do que os jovens. Em determinados casos, a intoxicação alimentar estafilocócicas pode causar morte devido a complicações secundárias. Tento como principais sintomas da intoxicação estafilocócicas, as náuseas, vômitos, sudorese abdominais, diarréia, cólicas, dores de cabeça e, ate mesmo podendo ocorrer à diminuição da temperatura corporal. Sintomas desencadeados, em média, a partir de cerca de 4 horas após ingestão do alimento contaminado, variando de 1 a 6 horas, geralmente durando, 24 a 48 horas (JAY, 1992; FRANCO; LANDGRAF, 2002). No de 2000, 13.420 pessoas foram afetadas por um surto de intoxicação ao consumirem leite desnatado no Japão, análises comprovaram que o alimento estava contaminado com enterotoxinas A produzidas por estafilococos (IKEDA et al., 2005). Embora ECN possam produzir quantidades menores de EE quando comparada com S. aureus, esses microrganismos não devem ser excluídos da investigação quando a ocorrência em surtos de intoxicações alimentares (SANTANA et al.,2010). DETECÇÃO DE ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS Para detecção de enterotoxinas estafilocócicas, vários métodos foram desenvolvidos como os biológicos e imunológicos. Os métodos imunológicos são mais sensíveis e específicos (SU e WONG, 1997) e utilizam anticorpos monoclonais e policlonais específicos para identificação das EEs (LANCETTE e TATINI, 1992). O maior problema na identificação da enterotoxinas estafilocócicas em alimentos é a pequena quantidade que é encontrada no alimento relacionado a surtos de intoxicação alimentar. O primeiro teste sorológico desenvolvido foi o método de imunodifusão baseado na reação em gel da enterotoxina com anticorpo especifico, formando uma linha de precipitação (WONG e BERGDOLL, 2002). A técnica de OSP permite a detecção de 0,5 ug de EE/mL, sendo sua sensibilidade adequada para maioria das cepas enterotoxigênicas (PEREIRA et al., 2001). A utilização de técnicas de produção e concentração como cellophane-over-agar podem aumentar a sensibilidade para 0,1ug/mL (CUNHA et al., 1996). A técnica de OSP foi desenvolvida com o objetivo de promover um teste com maior sensibilidade, de maneira a não comprometer a visualização da linha de precipitação. O método de imunodifusão em microlâminas (microslide) é o mais sensível na imunodifusão em gel, tendo a capacidade de detectar de 0,05 a 0,1ug/ml, embora apresente resultados de difícil interpretação. A técnica de ELISA é, atualmente, a mais utilizada para detecção de enterotoxinas estafilocócicas. Vários tipos de ELISA foram desenvolvidos, sendo o ELISA sanduíche o método mais comum (SANTOS, 2003), podendo detectar menos de 1ng de EE pormL de sobrenadante (FREED et al., 1982). Para pesquisa de enterotoxinas em alimentos, estão disponíveis uma série de Kits comerciais sendo a maioria baseada na técnica de ELISA e com sensibilidade variando entre 0,1 e 1 ng / mL (SU e WONG, 1997). A técnica de RPLA é baseada em anticorpos específicos aderidos a partículas de látex, apresentando uma sensibilidade de 1ng/mL. Técnicas como a reação em cadeia pela polimerase (PCR) pôde ser aplicada para detecção de diversos tipos de estafilococos enterotoxigênicos em culturas e alimentos (WONG e BERGDOLL, 2002). Metodos Imunológicos Tradicionais São métodos de ensaios imunológicos simples e de baixo custo que se fundamentalizam se na capacidade do antígeno (enterotoxina) interagir com anticorpos policlonais específicos, consistindo a formação de um precipitado denominado precipitina. A interação do antigeno-anticorpo, incorporados em uma placa de ágar ou agarose, determinara o aparecimento do precipitado, surgindo uma banda ou linha branca, sendo que a distância percorrida por essa união é diretamente coesifo Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1 - 1º Semestre 2012 Página 7 à quantidade de antígeno, quando os dois componentes são dispostos separadamente, no suporte de Agar ou agarose e se difundem um em direção ao outro, a técnica é denominada imunodifução dupla, quando ele é unidirecional denomina se imunodifusão simples (SANTILIANO, 2011). O procedimento imunológico "micro- slide gel double diffusion test"(micro imunodifusão e lâmina), onde pequenas quantidade e reagentes utilizados conferem certa sensibilidade e agilidade à reação, essa ferramenta permite evidenciar a presença de EE diretamente da amostra testada. Desvantagens da técnica e de exigir uma prévia separação da amostra, em consequência aumento do tempo de análise e requer pessoal especialmente capacitado para a execução. A metodologia "Optimun Sensitivity Plate- OSP" (Sensibilidade ótima em Placa) é considerada adequadamente sensível para a avaliação de linhagens enterotoxigênicas, detectando entre 0,5- 1,o ng de enterotoxina, sendo então menos sensível que a técnica de micro imunodifusão em lâmina, entretanto sua execução e leitura são mais facilitadas. A técnica permite a detecção de 0,5 ug de EE, sendo que sua sensibilidade é adequada para maioria das cepas enterotoxigênicas (WONG e BERGDOLL, 2002), não possibilitando detectar linhagens pouco produtoras. A utilização de técnicas de produção e concentração como cellophane-over-agar podem aumentar a sensibilidade para 0,1ug/mL (CUNHA et al., 1996). A técnica de OSP foi desenvolvida com o objetivo de promover um teste com maior sensibilidade, de maneira a não comprometer a visualização da linha de precipitação. Sabe-se que fatores como o tipo e a concentração do agar, quantidade distribuída na placa, tamanho e localização dos poços e a concentração do antisoro e toxina podem influenciar na sensibilidade e resolução do teste (SANTANA, 2006). Reação em Cadeia da Polimerase – PCR A reação em cadeia da polimerase (PCR) desenvolvida inicialmente por Kary B. Mullis, em 1985, consiste em uma técnica relativamente simples, pela qual moléculas de DNA ou cDNA são enzimaticamente amplificadas milhares ou milhões de vezes de uma forma bastante rápida, procedimento é realizado in vitro, gerando DNA em quantidade suficiente para análises posteriores. Ela é extremamente sensível, possibilitando a amplificação de DNA a partir de uma mínima quantidade de amostra. Com essa característica se tem se tornado uma excelente ferramenta de pesquisa básica, e nas mais complexas, como em testes de identificação genética, medicina forense, diagnóstico de doenças infecciosas, controle de qualidade industrial, entre outros (ZAHA, 2003; KONEMAN, 2001). A base para uma reação de amplificação consiste em DNA com a sequência alvo a ser amplificada, uma DNA-polimerase termoestável, dois oligonucleotídeos iniciadores, desoxirribonucleotídeos (dNTPs), tampão de reação e concentração adequada de MgCl2. Os componentes da reação são misturados e a amostra é colocada em um termociclador que possibilita a alternância de temperaturas por determinados períodos de tempo permitindo a ocorrência de ciclos repetitivos de desnaturação e síntese do DNA (KONEMAN et al., 2001). A aplicação dessa tecnologia originou diversos estudos na busca de métodos mais eficazes para a diferenciação e identificação de microrganismos, bem como de genes responsáveis pela expressão de toxinas microbianas, um expressivo e diverso numero de trabalhos sugerem a utilização da PCR, tento como alvos sequencias específicas do genoma microbiano para serem utilizadas como marcadores genéticos, com isso o PCR vem se tornando o mais utilizado e popular método genético para diagnóstico microbiológico. O inicio da utilização dessa técnica em diagnóstico microbiano proporcionou uma alternativa viável aos métodos tradicionais de cultura e aos testes imunológicos, apresentando inúmeras vantagens em relação às técnicas convencionais, como maior eficiência na tipificação e discriminação, maior rapidez, e significativo limite de detecção, alta seletividade, especificidade, potencial para automação e a possibilidade de trabalhar com bactérias que não são cultiváveis em meios de cultura utilizados normalmente (BUSH; Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1 - 1º Semestre 2012 Página 8 NITSCHKO, 1999). Os aspectos negativos que trazem desvantagens para sua implementação rotineira em laboratorial estão relacionadas à incapacidade em diferenciar células vivas de células mortas, a presença de inibidores de polimerase em alguns alimentos, o alto investimento em equipamentos e reagentes e a falta de aprovação, padronização e regulamentação por parte de organizações oficiais (MALORNY et al., 2003). Modificações da técnica PCR básica já são amplamente difundidas, a RT-PCR (reverse transcriptase PCR) desenvolvida para amplificar RNA, onde nesse processo o RNA alvo é primeiramente convertido em DNA complementar (cDNA) pela ação de uma enzima transcriptase (RT) e este cDNA é amplificado por PCR (TANG; PERSING, 1999). Já a nested PCR, é a técnica onde são realizados variados ciclos de amplificação com um grupo de primers e o produto dessa amplificação é amplificado, utilizando-se outro grupo de primers dirigidos para uma seqüência que se encontra dentro da seqüência amplificada pelo primeiro grupo de primers. Se tratando do Polimorfismo de seqüências de DNA amplificadas ao acaso ou DNA polimórfico amplificado ao acaso (RAPD, random amplified polymorphic DNA ou AP- PCR, arbitrarily primed PCR), ocorre o uso de um único e pequeno primer, escolhido para amplificar DNA genômico em condições de baixa estringência, não sendo necessário o conhecimento prévio da região de ligação do primer. Apenas a regiões genômicas entre duas seqüências flanqueantes ao primer será amplificada, outra modificação se trata do Real time PCR, ou PCR em tempo real, que consiste em um sistema combinatório a utilização de um termociclador automatizado, com a habilidade de detectar, em tempo real, seqüências alvo utilizando a fluorescência com o uso de sondas, quando formados os produtos híbridos, por fim a técnica na qual se utiliza mais de um par de primers na mesma reação, o multiplex-PCR, possibilitando a amplificação simultânea de mais de uma seqüência de DNA (TANG; PERSING, 1999). Detecção Baseada em Ensaios Biológicos Nessa técnica a maiorias dos ensaios biológicos emprega uso de primatas (Macaca mullata), gatos e cobaias. As enterotoxinas são detectadas pela sua atividade emética in vivo ou in vitro (cultura de tecido). As amostrassuspeitas são aplicadas intragastricamente no modelo animal e os efeitos eméticos podem ocorrer em até cinco horas após ingestão, caso a amostra contenha alguma enterotoxina. O método trás desvantagens quanto à variação na sensibilidade dos animais, a inabilidade de diferenciação entre os sorotipos das enterotoxinas, o desenvolvimento de resistência em animais a repetidas administrações, e o alto custo dos ensaios (SANTILIANO, 2011). Nos gatos, EEC só de produzir efeitos eméticos quando utilizada cinco vezes acima da concentração de EEA ou EEB, outras substâncias tóxicas distintas da EE são encontrados no meio de cultura e são capazes de causar vômitos nestes animais, gerando assim resultados que requerem análises mais cruciais. A injeção cutânea de toxina após injeção intravenosa com azul de Evans (1%) em cobaias sensibilizadas com imunoglobulina E anti-EEB resulta na produção de uma área sensibilizada de aproximadamente 5 mm de diâmetro. Sendo assim possível detectar 10 pg de enterotoxina em dez a quinze minutos, porém é impraticável o uso deste ensaio para analisar um grande número de amostras para EEB (ANDRADE, 2009). Detecção Baseada em Ensaio Enzimático Imunoabsorvente Uma das ferramentas fundamental na detecção de agentes biológicos o ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) se baseasse nos princípios de interações antígeno- anticorpo, esse técnica permite uma fácil visualização de resultados e pode ser finalizado sem a adição de materiais radioativos. O ELISA foi introduzido por SAUNDERS; BARTLETT (1977) para detecção de EEA. Sua maior vantagem é a sensibilidade. Utiliza enzimas marcadoras, as quais devem apresentar grande estabilidade, especificidade, disponibilidade na forma pura, custo acessível e formar produto final quantificável. Variedades dessas técnicas Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1 - 1º Semestre 2012 Página 9 qualitativas para detecção de toxinas estão disponíveis no mercado, incluindo técnicas de ensaios imunoabsorventes radioativos e os kits EIA (enzyme immunosorbent assay), a disponíveis kits de métodos rápidos para a detecção de EE, sendo aqui citados alguns: SET-RPLA (Oxoid);BOMMELI SET-EIA (Dr Bommeli AG); RIDASCREEN SET (R- Biopharm GmbH);TRANSIA (Transia Dffchamb- SA) e o VIDAS- SET (bioMérieux). VERNOZY-ROZAND, compararam especificidade e sensibilidade de três kits (VIDAS SET - bioMérieux, VIDAS SET2 - bioMérieux e TRANSIA PLATE – Diffchamb, Lon, France) disponíveis no mercado para detecção de EE, onde em seus ensaios em diversos tipos de alimentos, como cozidos, produtos do mar crus, enlatados, líquidos, desidratados e derivados do leite. Nesses alimentos, apenas os crus apresentaram falso- positivos, com especificidade de 82% e 78%, para os kits, VIDAS SET e TRANSIA PLATE, concomitantemente. Tratando se da sensibilidade, o kit VIDAS SET2 foi o mais eficiente gerando resultados comparáveis com os imunoensaios Western blot ressaltando que os tempos necessários para realizar os ensaios são de oitenta minutos para VIDAS SET e VIDAS SET2 e cento e quarenta e cinco minutos para TRANSIA PLATE. Os dois primeiros, por serem automatizados, podem ser incorporados no programa Hazard Critical Controle Point, e serem usados para análise de enterotoxinas em larga escala. Os métodos quantitativos também estão presentes. Estudos estabeleceram um imunoensaio específico e quantitativo, utilizando anticorpos monoclonais num sistema, baseado no ELISA sanduíche, o ABSELISA (avidin-biotin sandwich ELISA). A ferramenta é sensível e confiável. Pesquisas desenvolveram um método sensível e mais rápido que utiliza um sistema de dois anticorpos onde um anticorpo policlonal anti- EEB está ligado a esferas magnéticas e o outro, um anticorpo monoclonal anti-EEB marcado, está ligado com Alexa flúor 647 (VERNOZY-ROZAND, 1996). A pesquisa científica com os microchips consiste em arranjos de microelementos individuais contendo várias sondas, os microchips permitem análises paralelas de amostras, para diversos parâmetros, utilizando baixas quantidades de material. No entanto, essas análises são feitas de forma sensível, segura e eficiente onde os resultados dos imunoensaios podem ser alcançados por vários métodos, como intensidade de fluorescência, pela intensidade de quimioluminescência da proteína conjugada a peroxidase e por espectrometria de massa direta dos elementos do microchip (LIMA, 2005). Detecção Por Western Blot A técnica Western blot é um método amplamente usado para análise de proteínas e, assim, tem sido usado para detectar EEA e EEC (ORDEM, 1992). Utilizando um imunoblot, as proteínas são separadas por tamanho usando a eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS) ou por ponto isoelétrico usando gel de enfoque isoelétrico, transferido para uma membrana, e posteriormente sendo incubada com anticorpos específicos. Assim como ELISA, o Western blot se baseia em detecção imunológica, apresentando duas vantagens para testes em alimentos. Primeiro, mesmo que o tratamento térmico possa causar agregados protéicos, os agregados são solubilizados e desenovelados em gel de SDS. E enfim, a reação cruzada entre antígenos pode ser caracterizada em Western blot, enquanto no ELISA, eles apenas aumentam o background (SANTILIANO, 2011). Detecção Por Aglutinação Em Látex Os testes de aglutinação em látex têm amplamente utilizados para vários alvos e mesmo não serem métodos padrões de detecção têm mostrado alta sensibilidade e especificidade, na comparação com outros métodos de detecção são mais céleres, o tempo varia de um minuto a dezesseis horas, econômicos e fáceis de utilizar, além de não necessitarem de equipamentos sofisticados ou reagentes de custos mais elevados. Nesse método de detecção, o anticorpo específico Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1 - 1º Semestre 2012 Página 10 ligado covalentemente ao látex é misturado com a amostra suspeita e é monitorado se há ou não aglutinação. A presença de antígeno na amostra permite reconhecimento pelo anticorpo e aglutinação do complexo formado no látex (LEE et al., 2004). Detecção por Imunodifusão O método de imunodifusão ou técnica de Ouchterlony foi desenvolvido por CASMAN e requer de três a dez dias para obtenção dos resultados. A proteína e um anticorpo específico difundem por um gel e a reação entre ambos, formando uma linha de precipitação característica de positividade. Este método detecta cerca de 500 ng/mL de enterotoxina no material suspeito. A técnica é aprovada pela Associação Oficial de Análises Químicas (AOAC), adotada pelo FDA (Food and Drug Administration) e é recomendada como método padrão para avaliação de novos ensaios. Variações do método são utilizadas nas técnicas de microlâmina e ótima sensibilidade em placa (IGARASHI et al., 1996). ANÁLISE COMPARATIVA ENTRE OS PRINCIPAIS MÉTODOS DE DETECÇÃO ELISA vem sendo o método mais amplamente empregado nas pesquisas de detecção de toxinas de S. aureus, por sua característica de ser um método rápido, sensível e que permite analisar um grande volume de amostras simultaneamente. Em contradição suas limitações ao uso, como a necessidade de equipamentos especiais para a visualização dos resultados, é relativamente caro para a análise de um pequeno número de amostras e alguns de seus componentes podem reagir inapropriadamente de acordo com a composição da amostra utilizada (ZOCCHE, 2011). Focalização isoelétrica e radioimunoensaio também podem detectar toxinas isoladas de pacientes, esta metodologia é altamente sensível, mas não muito específica na diferenciação das diferentestoxinas relacionadas à síndrome. ORDEN em suas pesquisas descreve uma técnica de imunoblotting combinada com um sistema de eletroforese semiautomatizada para a detecção de enterotoxinas em extratos alimentares. Consistindo em um teste rápido, onde as proteínas são detectadas com base na reação com anticorpos específicos e na determinação da massa molecular evitando-se assim o surgimento de resultados falso-positivos gerados pela interferência da proteína A e com proteínas contaminantes (ORDEN, 2004). Western Blot seria um método vantajoso para amostras de alimento. Alimentos depois de aquecidos podem apresentar agregação de proteínas que devem ser solubilizadas em gel contendo SDS o que desnaturaria o anticorpo, sendo ineficaz em testes de ELISA onde os anticorpos são aplicados diretamente sobre a proteína. Reações cruzadas podem ser identificadas, pois é possível visualizar o tamanho da proteína que é reconhecida pelo anticorpo utilizado. O teste de ELISA é muito utilizado por ser simples, sensível, rápido e disponível em vários kits comerciais, mas possui algumas limitações: não reage bem em amostras de alimentos aquecidos durante o processamento, podendo gerar resultado falso-negativo; dependendo do tipo de alimento, reações cruzadas podem acontecer gerando um resultado falso-positivo; e, peróxidos presentes naturalmente em certos alimentos podem reagir com os cromógenos presentes no ensaio de ELISA (SANTILIANO, 2011). O método de RPLA tem sido utilizado na detecção de toxinas de S. aureus, mostrando-se como um método simples e sensível para a detecção de TSST-1. Não é necessário o uso de equipamentos especiais para visualização dos resultados que são prontamente visíveis através da aglutinação das partículas de látex sensibilizadas quando na presença do antígeno alvo e utilizam quantidades mínimas de anticorpo para a sensibilização das partículas (IGARASHI et al., 1996). Diversos trabalhos têm relatado a utilização da técnica da PCR na detecção de EE, utilizando seqüências específicas para o gene codificante, ou através de sistemas de PCR multiplex. Estes sistemas permitiriam a detecção rápida e específica de diferentes Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1 - 1º Semestre 2012 Página 11 genes codificadores de exotoxinas em Staphylococcus spp. Esta técnica conviria na identificação de cepas portadoras dos genes para toxina e independe da expressão e secreção da toxina, onde seriam mais úteis os métodos imunológicos (LØVSETH; LONCAREVIC; BERDAL; 2004). CONCLUSSÃO As várias técnicas e ferramentas descritas na literatura para a detecção de enterotoxinas estafilocócicas, trazem vantagens e desvantagens. Os métodos biológicos apesar de serem técnicas empregadas nas primeiras investigações de EE, ainda são utilizados, entretanto, são inutilizáveis quando se deseja determinar a classe da toxina em questão e seu emprego e na detecção de enterotoxinas em um grande número de amostras se torna totalmente inexecutável. Na avaliação da melhor escolha para a detecção de EE os métodos os métodos imunoquímicos, como o Western blot, imunodifusão em ágar, ELISA, aglutinação em látex, PCR, microarranjos, alem de serem mais modernos são sensíveis, específicos, práticos, rápidos e bem vistos. E seu suas características proporcionam analisar um grande número de materiais, embora necessitem de certos equipamentos, reagentes e de padrões para resultados confiáveis. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDRADE, A. P.C. de. Identificação Bioquímica, Molecular e Pesquisa de Genes Codificadores de Enterotoxinas de Staphylococcus spp. Isolados de Queijo de Coalho. 2009. 71 f. 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