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* ENZIMAS Profa. Giselle Zenker Justo 2013 * ESTRUTURA E FUNÇÃO CATÁLISE ENZIMÁTICA * ? O que são enzimas? * Reações de combustão Sacarose é estável se deixada exposta ao ar! Quais as razões para esta diferença? * CATALISADORES BIOLÓGICOS ENZIMAS Aumentam significativamente a velocidade das reações (105 – 1017 vezes). Ex: Decomposição do H2O2 * Não são consumidas na reação. E + S E + P Atuam em concentração muito baixa. Número de renovação ou transformação = no de moléculas de S convertidas em P por uma única molécula de E em uma dada unidade de tempo. Ex: Catalase ENZIMAS * ENZIMAS Condições de reações (pH, T, Pressão) mais brandas do que catalisadores químicos. Alta especificidade (eficiência catalítica deriva da ligação do S ao sítio ativo da E). Não formam produtos secundários. Concentração e atividade reguladas. Atividade depende da integridade da conformação. * G<0 reação espontânea Lentas e Inespecíficas Para que as reações químicas ocorram é necessário que os reagentes entrem em contato rompimento e formação de ligações As reações somente ocorrem se houver colisão favorável, ou seja, o choque deve ocorrer com E suficiente e orientação espacial apropriada. Qualquer fator que no colisões favoráveis, velocidade da reação. * Velocidade da reação no colisões favoráveis * 3 formas de aumentar a velocidade das reações: Catalisadores: não atuam sobre o no de colisões, mas sua ação baseia-se na formação de um caminho alternativo, que requer um menor consumo de energia menor E de ativação * Posição de equilíbrio não é afetada pelo catalisador e não apresenta efeito termodinânico global! G’0 não é afetado * ENZIMAS Na ausência de catálise, reações químicas de importância biológica não ocorreriam numa escala de tempo compatível com a vida! Essenciais a todos os processos biológicos! Algumas doenças são causadas por deficiências em enzimas específicas. Outras são causadas por excesso de atividade de uma enzima Alvos terapêuticos! Medidas de atividade enzimática são utilizadas no diagnóstico de algumas doenças Biomarcadores! Úteis em inúmeros processos industriais Importância econômica! * Vias Metabólicas dependem da atuação coordenada de Enzimas! Desenvolvimento da Bioquímica! * Proteínas RNA * Ribozimas RNAs com atividade catalílica Função: Catalisar a quebra e remoção de parte de sua própria molécula. Aplicações: Podem atuar como enzimas de restrição, clivando fragmentos específicos de RNA, podendo ser utilizadas como ferramentas em Engenharia Genética. Possuem capacidade de inativar um RNA não desejado, como por exemplo os oncogenes. Poderiam ser utilizadas como medicamentos antivirais, por exemplo, contra o retrovírus da AIDS, através do desenvolvimento de vetores adequados para o seu transporte até as células alvo. * Localização Celular * Enzimas de Membrana x Citoplasmáticas * Flt3 Enzimas de Membrana (várias regiões com diferentes funções) * Enzimas Citoplasmáticas (hidrofilicidade dos aa externos) * Propriedades das Enzimas Sítio ativo Especificidade Cofatores / coenzima Eficiência catalítica * substrato sítio ativo enzima Sítio Catalítico * S Sítio ativo * (a) Ausência de enzima (b) Sítio ativo da enzima complementar ao substrato (c) Sítio ativo da enzima complementar ao estado de transição Substrato Estado de Transição Produtos * Especificidade pelo Substrato O sítio de ligação ao substrato consiste em geral de uma cavidade na superfície da proteína que é geometricamente complementar ao substrato. Os aa do sítio ativo se organizam de maneira a interagir com o substrato. Após a ligação ao substrato, ocorre um ajuste induzido no sítio ativo da enzima. * Estereoespecificidade As enzimas são altamente estereoespecíficas nas reações que catalisam! Lembrar que as enzimas são quirais por natureza (formadas apenas por L-aa) e, por isso, seus sítios ativos são assimétricos! A tripsina, por exemplo, hidrolisa polipeptídeos formados por L-aa, mas não tem efeito sobre aqueles formados por D-aa. * Catálise: interações fracas entre S e E dirigem a catálise enzimática. Entropia: liberdade de rotação de 2 moléculas em solução. Efeito de Solvatação: estabilização do S. Distorção do S Ajuste Induzido: mudança conformacional da E após ligação do S. Fatores Termodinâmicos e Físicos contribuem para G: * Redução na Entropia * Ajuste Induzido * Energia de Ligação Contribui para a Especificidade de Reação e Catálise Especificidade: deriva da formação de múltiplas ligações fracas. Ligações iônicas Ligações hidrogênio Interações de Van der Waals Interações hidrofóbicas * Enzimas diferentes apresentam diferentes graus de especificidade Por exemplo: pepsina: hidrolisa ligações peptídicas em resíduos aromáticos (triptofano, fenilalanina e tirosina). tripsina: reconhece apenas ligações peptídicas formadas por arginina ou lisina. * * Cofatores * * * * Coenzimas * Coenzimas * Classificação das Enzimas CLASSE SUBCLASSE * Óxido Redutases Transferases Hidrolases Esterases Peptidases Fosfatases Fosfolipases Transaldolases Fosfomutases Quinases Sintases Peroxidases Oxidases Desidrogenases Transferência de e- Transferência de grupos Transferência de grupos funcionais para a água (hidrólise) CLASSE SUBCLASSE * Nomenclatura de enzimas As enzimas são classificadas de acordo com as reações que catalisam. Muitas são denominadas pela adição do sufixo –ase ao nome do substrato ou a uma frase que descreva sua atividade: Urease catalisa hidrólise da uréia. DNA polimerase catalisa a polimerização de nucleotídeos para sintetizar o DNA. * Outras são denominadas por nomes ligados a sua descoberta antes que a reação catalisada fosse conhecida: pepsina, lisozima. Com o aumento do número de enzimas descobertas, tornou-se necessário um sistema para uma classificação mais eficiente: Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB) nomear e classificar Nomenclatura de enzimas * Nomenclatura de enzimas - IUB Cada enzima código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada: 1° dígito - classe 2° dígito - subclasse 3° dígito - sub-subclasse 4° dígito - substrato IUB = ATP:glicose fosfotransferase * Geradas por splicing alternativo permitindo variações estruturais como posicionamento de aa mais hidrofóbicos na região N-terminal e o direcionamento dessas E para tecidos específicos. Podem apresentar > ou < suscetibilidade a inibidores e moduladores positivos. Podem apresentar > ou < afinidade pelo S. Isoenzimas ou Isoformas Proteínas que catalisam a mesma reação química. * Exemplo: Glicoquinase x Hexoquinase Fígado Músculo < afinidade pelo S > afinidade pelo S utiliza glicose para produzir E órgão exportador de glicose reflete o papel desses órgãos no metabolismo de CHO * Fatores que afetam a atividade enzimática: Temperatura pH Concentração de substrato Concentração de enzima * Fatores que afetam a atividade enzimática: Temperatura pH Concentração de substrato Concentração de enzima * Temperatura e pH * Fatores que afetam a atividade enzimática: Temperatura pH Concentração de substrato Concentração de enzima * CINÉTICA ENZIMÁTICA * Fatores que afetam a atividade enzimática: Temperatura pH Concentração de substratoConcentração de enzima * Mas como estudar o efeito da [S] sobre a velocidade da reação enzimática se [S] varia com o tempo? A concentração de substrato afeta a velocidade de uma reação enzimática Aproximação Medir a velocidade inicial (v0), quando a concentração de [S] é muito maior que a [E] Concentração de Substrato * * Km: afinidade da E pelo S Efeito da [S] sobre v0 * Etapas da Reação Enzimática LENTA (limitante) RÁPIDA [P] negligenciável no início da reação * [ES] não é facilmente medida experimentalmente. O que fazer? Assume-se que a velocidade inicial da reação reflete um estado estacionário em que [ES] é constante (velocidade de formação de ES é igual à velocidade de quebra). v0 = ½ Vmáx Km + [S] = 2[S] * Quanto menor for o valor de Km, maior será a afinidade da enzima pelo substrato * Como determinar Km e Vmáx experimentalmente? Transformada de Lineweaver-Burk ou Gráfico Duplo-Recíproco * Gráfico duplo-recíproco equação de reta * kcat “turnover number” = número de transformação Número de moléculas de S convertidas em produto por unidade de tempo em uma única molécula de E saturada com o S O número de renovação enzimática é equivalente à constante de velocidade da etapa limitante da velocidade da reação * kcat * Eficiência Catalítica constante de especificidade comparação das eficiências catalíticas entre enzimas diferentes Há um limite superior para kcat/Km, imposto pela velocidade em que E e S podem difundir em solução aquosa. Este limite é da ordem de 108 a 109 M-1 s-1. Enzimas com valores de constante de especificidade próximos a este são descritas como tendo atingido a perfeição catalítica. * Eficiência Catalítica * Fatores que afetam a atividade enzimática: Temperatura pH Concentração de substrato Concentração de enzima * Concentração de Enzima Variando-se a [E], a velocidade sempre irá variar, qualquer que seja a [S]. [E]=2E como [S] está em excesso: [S] – [2ES] [S] * Concentração de Enzima Velocidade da reação é diretamente proporcional à [E]. * Mecanismos de Catálise Catálise Ácido-base Catálise Covalente Catálise por Íon Metálico * Catálise Covalente (participação de nucleófilos) e Ácido-base (grupos H+ ou OH-) * Catálise por Íons Metálicos Enzimas ativadas por metais associam-se fracamente (interações iônicas) a íons metálicos da solução (função estrutural), podendo auxiliar na orientação do S, estabilizar cargas no estado de transição e mediar reações de oxiredução. Anidrase carbônica * INIBIÇÃO ENZIMÁTICA * INIBIDORES ENZIMÁTICOS São substâncias que diminuem a atividade enzimática. Alguns são constituintes normais das células. Outros são estranhos ao metabolismo. Cumprem um papel regulador importante. * Inibição Enzimática 1. Irreversível: modificação covalente e definitiva no sítio ativo 2. Reversível: - Competitiva - Não-competitiva Aplicações: Estrutura da enzima Compreensão das vias metabólicas Mecanismo de catálise Processos patológicos Fármacos * Reagem quimicamente com as enzimas levando a inativação praticamente definitiva. Exemplo: Compostos organofosforados (inseticidas, pesticidas): formam ligações covalentes com grupos –OH de resíduos Ser. inibem acetilcolinesterase lacrimejamento, salivação, diarréia, tremores, broncoconstrição, distúrbios cardiorrespiratórios, bradicardia e depressão do SNC. INIBIDORES IRREVERSÍVEIS * INIBIDORES IRREVERSÍVEIS Ex: Inibição da quimotripsina pelo diisopropilfluorofosfato Esta inibição levou à conclusão que o resíduo Ser195 é essencial à atividade catalítica * INIBIDORES IRREVERSÍVEIS Gases Neurotóxicos (Sarin, Tabun) inibem a acetilcolinesterase irreversivelmente, levando ao bloqueio da transmissão de impulsos nervosos. Corticosteróides inibem a fosfolipase, reduzindo a disponibilidade de ácido araquidônico, afetando a síntese dos eicosanóides (prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos e leucotrienos): atuam como “hormônios locais” participam da regulação de diversos processos fisiológicos: contração da musculatura lisa regulação da pressão arterial dilatação dos brônquios contração uterina reações inflamatórias dor e febre coagulação sanguínea * Pontos de inibição de agentes anti-inflamatórios e/ou analgésicos * Ex: Inibição das enzimas cicloxigenases pelo acetilsalicilato INIBIDORES IRREVERSÍVEIS Aspirina: transfere irreversivelmente seu grupo acetil para grupo –OH de um resíduo Ser da molécula de cicloxigenase, inativando-a. * Inibidores Específicos da COX-2 * Penicilina inibidor irreversível. inibidor específico de enzimas da síntese da parede bacteriana (transpeptidase), provocando a lise das células que estão desprovidas de parede. INIBIDORES IRREVERSÍVEIS Agente terapêutico atua sobre uma enzima que o parasita apresenta, mas o indivíduo hospedeiro não * Omeprazol® inibidor irreversível da enzima K+/H+ ATPase (bomba de prótons) das células parietais gástricas. A longo prazo, câncer gástrico (?) Xenical® inibe a lipase pancreática, impedindo a absorção de aproximadamente 30% da gordura alimentar no intestino delgado. Efeitos colaterais: evacuação solta, diminuição da absorção de vitaminas lipossolúveis (A, D, E e K) INIBIDORES IRREVERSÍVEIS * Competem com o substrato pelo sítio ativo da enzima. Moléculas que apresentam estrutura química semelhante à do S. Ligam-se ao sítio ativo da E, produzindo um complexo enzima-inibidor (EI), semelhante ao complexo enzima-substrato (ES). O complexo EI nunca gera produto. A Vmáx é atingida e o valor de Km aumenta aparentemente, uma vez que o inibidor está competindo com o substrato. INIBIDORES REVERSÍVEIS COMPETITIVOS * Inibição Competitiva * Alteração de parâmetros cinéticos pelo Inibidor Competitivo [S] desloca o I e Vmáx é atingida * Duplo-recíproco -1/Km * INIBIDORES COMPETITIVOS Ácido fólico (sintetizado por bactérias) fator de crescimento essencial Sulfonamida e derivados como sulfapiridina e sulfatiazol ligam-se à enzima bacteriana e são anexadas na síntese do folato no lugar do PABA, gerando um “falso folato”, que não é eficaz como cofator na síntese de bases nitrogenadas. Ex: ação das sulfas como bactericidas * AZT (tratamento da AIDS) INIBIDORES COMPETITIVOS compete com timidina * Alopurinol (Tratamento da Gota) DNA/RNA Nucleosídeos Remoção da ribose + desaminação Xantina oxidase Xantina (G) ácido úrico (produto final excretado por seres humanos) Xantina oxidase hipoxantina (A) Gota Purínicos: A e G e Pirimidínicos: C, T e U * Viagra (Tratamento da Disfunção Erétil) * Intoxicação por Metanol Metanol Formaldeído * Não apresentam qualquer semelhança estrutural com o substrato da reação que inibem. Ligam-se a radicais que não fazem parte do sítio ativo; o inibidor se liga à cadeia lateral de um determinado aminoácido, inativando a enzima reversivelmente. Cineticamente, há uma redução aparente na [E]. KM não muda, porém, Vmáx é reduzida. Ex: metais pesados: Hg+2, Pb+2, Ag+ (reagem com grupos –SH de proteínas). Pouco específicos e amplo espectro de ação. INIBIDORES REVERSÍVEIS NÃO-COMPETITIVOS * Inibição NÃO-Competitiva * Alteração de parâmetros cinéticos pelo Inibidor NÃO-Competitivo * sem inibidor e com inibidores Duplo-recíproco * Enzimas cujas concentrações plasmáticas são alteradas em determinadas condições patológicas * Inibidor Substrato Enzima Doença * CPK = creatina quinase LDH = lactato desidrogenase HBDH = -hidroxibutirato desidrogenase Cinética de liberação de enzimas cardíacas no soro após infarte do miocárdio
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