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Enzimas_2013_QI

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*
ENZIMAS
Profa. Giselle Zenker Justo
2013
*
ESTRUTURA E FUNÇÃO
CATÁLISE ENZIMÁTICA
*
?
O que são enzimas?
*
Reações de combustão
 Sacarose é estável se deixada exposta ao ar!
Quais as razões para esta diferença?
*
CATALISADORES BIOLÓGICOS
ENZIMAS
 Aumentam significativamente a velocidade das reações (105 – 1017 vezes).
Ex: Decomposição do H2O2 
*
 Não são consumidas na reação.
 E + S  E + P
 Atuam em concentração muito baixa.
Número de renovação ou transformação = no de moléculas de S convertidas em P por uma única molécula de E em uma dada unidade de tempo.
Ex: Catalase
ENZIMAS
*
ENZIMAS
 Condições de reações (pH, T, Pressão) mais brandas do que catalisadores químicos.
 Alta especificidade (eficiência catalítica deriva da ligação do S ao sítio ativo da E).
 Não formam produtos secundários.
 Concentração e atividade reguladas.
 Atividade depende da integridade da conformação.
*
G<0  reação espontânea
Lentas e Inespecíficas
Para que as reações químicas ocorram é necessário que os reagentes entrem em contato
 rompimento e formação de ligações
As reações somente ocorrem se houver colisão favorável, ou seja, o choque deve ocorrer com E suficiente e orientação espacial apropriada.
Qualquer fator que  no colisões favoráveis,  velocidade da reação.
*
Velocidade da reação  no colisões favoráveis
*
3 formas de aumentar a velocidade das reações:
Catalisadores: não atuam sobre o no de colisões, mas sua ação baseia-se na formação de um caminho alternativo, que requer um menor consumo de energia
 menor E de ativação
*
Posição de equilíbrio não é afetada pelo catalisador
e não apresenta efeito termodinânico global!
G’0
não é afetado
*
ENZIMAS
 Na ausência de catálise, reações químicas de importância biológica não ocorreriam numa escala de tempo compatível com a vida!
 Essenciais a todos os processos biológicos!
 Algumas doenças são causadas por deficiências em enzimas específicas. Outras são causadas por excesso de atividade de uma enzima  Alvos terapêuticos!
 Medidas de atividade enzimática são utilizadas no diagnóstico de algumas doenças  Biomarcadores!
 Úteis em inúmeros processos industriais  Importância econômica!
*
Vias Metabólicas dependem da atuação coordenada de Enzimas!
Desenvolvimento
da Bioquímica!
*
Proteínas
RNA
*
Ribozimas
RNAs com atividade catalílica
Função:
Catalisar a quebra e remoção de parte de sua própria molécula.
Aplicações:
 Podem atuar como enzimas de restrição, clivando fragmentos específicos de RNA, podendo ser utilizadas como ferramentas em Engenharia Genética.
 Possuem capacidade de inativar um RNA não desejado, como por exemplo os oncogenes.
 Poderiam ser utilizadas como medicamentos antivirais, por exemplo, contra o retrovírus da AIDS, através do desenvolvimento de vetores adequados para o seu transporte até as células alvo.
*
Localização Celular
*
Enzimas de Membrana x Citoplasmáticas
*
Flt3
Enzimas de Membrana
(várias regiões com diferentes funções)
*
Enzimas Citoplasmáticas
(hidrofilicidade dos aa externos)
*
Propriedades das Enzimas
 Sítio ativo
 Especificidade
 Cofatores / coenzima
 Eficiência catalítica 
*
substrato
sítio ativo
enzima
Sítio Catalítico
*
S
Sítio ativo
*
(a) Ausência de enzima
(b) Sítio ativo da enzima complementar ao substrato 
 
(c) Sítio ativo da enzima complementar ao estado
 de transição
 Substrato 
Estado de Transição
 Produtos 
 
*
 
Especificidade pelo Substrato
 O sítio de ligação ao substrato consiste em geral de uma cavidade na superfície da proteína que é geometricamente complementar ao substrato. 
 Os aa do sítio ativo se organizam de maneira a interagir com o substrato. 
 Após a ligação ao substrato, ocorre um ajuste induzido no sítio ativo da enzima.
*
 
Estereoespecificidade
 As enzimas são altamente estereoespecíficas nas reações que catalisam!
 Lembrar que as enzimas são quirais por natureza (formadas apenas por L-aa) e, por isso, seus sítios ativos são assimétricos!
 A tripsina, por exemplo, hidrolisa polipeptídeos formados por L-aa, mas não tem efeito sobre aqueles formados por D-aa.
*
Catálise: interações fracas entre S e E dirigem a
 catálise enzimática.
 Entropia: liberdade de rotação de 2 moléculas em
 solução.
 Efeito de Solvatação: estabilização do S.
 Distorção do S
 Ajuste Induzido: mudança conformacional da E após
 ligação do S. 
Fatores Termodinâmicos e Físicos contribuem para G: 
*
Redução na Entropia
*
Ajuste Induzido
*
Energia de Ligação Contribui para a
Especificidade de Reação e Catálise
Especificidade: deriva da formação de múltiplas ligações
 fracas.
 Ligações iônicas
 Ligações hidrogênio
 Interações de Van der Waals
 Interações hidrofóbicas
*
Enzimas diferentes apresentam
diferentes graus de especificidade
Por exemplo:
pepsina: hidrolisa ligações peptídicas em resíduos aromáticos (triptofano, fenilalanina e tirosina).
tripsina: reconhece apenas ligações peptídicas formadas por arginina ou lisina.
*
*
Cofatores
*
*
*
*
 
Coenzimas
*
 
Coenzimas
*
Classificação das Enzimas
CLASSE
SUBCLASSE
*
Óxido Redutases
Transferases
Hidrolases
 Esterases
 Peptidases
 Fosfatases
 Fosfolipases
 Transaldolases
 Fosfomutases
 Quinases
 Sintases
 Peroxidases
 Oxidases
 Desidrogenases
Transferência de e-
Transferência de grupos
Transferência de grupos funcionais para a água (hidrólise)
CLASSE
SUBCLASSE
*
 
Nomenclatura de enzimas
 As enzimas são classificadas de acordo com as reações que catalisam. 
 Muitas são denominadas pela adição do sufixo –ase ao nome do substrato ou a uma frase que descreva sua atividade:
 Urease catalisa hidrólise da uréia.
 DNA polimerase catalisa a polimerização de nucleotídeos para sintetizar o DNA.
*
 Outras são denominadas por nomes ligados a sua descoberta antes que a reação catalisada fosse conhecida: pepsina, lisozima.
 Com o aumento do número de enzimas descobertas, tornou-se necessário um sistema para uma classificação mais eficiente: 
Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB) 
 nomear e classificar
Nomenclatura de enzimas
*
Nomenclatura de enzimas - IUB
Cada enzima  código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada:
 1° dígito - classe
 2° dígito - subclasse
 3° dígito - sub-subclasse
 4° dígito - substrato
IUB = ATP:glicose fosfotransferase
*
 Geradas por splicing alternativo permitindo variações estruturais como posicionamento de aa mais hidrofóbicos na região N-terminal e o direcionamento dessas E para tecidos específicos.
 Podem apresentar > ou < suscetibilidade a inibidores e moduladores positivos.
 Podem apresentar > ou < afinidade pelo S.
Isoenzimas ou Isoformas
Proteínas que catalisam a mesma reação química.
*
Exemplo:
Glicoquinase x Hexoquinase
Fígado
Músculo
< afinidade pelo S
> afinidade pelo S
utiliza glicose
para produzir E
órgão exportador
de glicose
reflete o papel desses órgãos no metabolismo de CHO
*
Fatores que afetam a atividade enzimática:
 Temperatura
 pH 
 Concentração de substrato
 Concentração de enzima
*
Fatores que afetam a atividade enzimática:
 Temperatura
 pH 
 Concentração de substrato
 Concentração de enzima
*
Temperatura e pH
*
Fatores que afetam a atividade enzimática:
 Temperatura
 pH 
 Concentração de substrato
 Concentração de enzima
*
CINÉTICA ENZIMÁTICA
*
Fatores que afetam a atividade enzimática:
 Temperatura
 pH 
 Concentração de substratoConcentração de enzima
*
Mas como estudar o efeito da [S] sobre a velocidade da reação enzimática se [S] varia com o tempo? 
A concentração de substrato afeta a
velocidade de uma reação enzimática
Aproximação
Medir a velocidade inicial (v0), quando a concentração de [S] é muito maior que a [E] 
Concentração de Substrato
*
*
Km: afinidade da E pelo S
Efeito da [S] sobre v0
*
Etapas da Reação Enzimática
LENTA (limitante)
RÁPIDA
[P] negligenciável
no início da reação

*
[ES] não é facilmente medida experimentalmente. O que fazer?
 Assume-se que a velocidade inicial da reação reflete um estado estacionário em que [ES] é constante (velocidade de formação de ES é igual à velocidade de quebra).
v0 = ½ Vmáx  Km + [S] = 2[S]
*
Quanto menor for o valor de Km, maior será
a afinidade da enzima pelo substrato
*
Como determinar Km e Vmáx experimentalmente?
Transformada de Lineweaver-Burk
ou Gráfico Duplo-Recíproco
*
Gráfico duplo-recíproco  equação de reta
*
kcat
“turnover number” = número de transformação
Número de moléculas de S convertidas em produto por unidade de tempo em uma única molécula de E saturada com o S
O número de renovação enzimática é equivalente à constante de velocidade da etapa limitante da velocidade da reação
*
kcat
*
Eficiência Catalítica
constante de especificidade
comparação das eficiências catalíticas entre enzimas diferentes
 Há um limite superior para kcat/Km, imposto pela velocidade em que E e S podem difundir em solução aquosa. Este limite é da ordem de 108 a 109 M-1 s-1. 
 Enzimas com valores de constante de especificidade próximos a este são descritas como tendo atingido a perfeição catalítica.
*
Eficiência Catalítica
*
Fatores que afetam a atividade enzimática:
 Temperatura
 pH 
 Concentração de substrato
 Concentração de enzima
*
Concentração de Enzima
 Variando-se a [E], a velocidade sempre irá variar, qualquer que seja a [S].
[E]=2E  como [S] está em excesso: [S] – [2ES]  [S]
*
Concentração de Enzima
 Velocidade da reação é diretamente proporcional à [E].
*
Mecanismos de Catálise
 Catálise Ácido-base
 Catálise Covalente
 Catálise por Íon Metálico
*
Catálise Covalente (participação de nucleófilos)
e Ácido-base (grupos H+ ou OH-)
*
Catálise por Íons Metálicos
Enzimas ativadas por metais associam-se fracamente (interações iônicas) a íons metálicos da solução (função estrutural), podendo auxiliar na orientação do S, estabilizar cargas no estado de transição e mediar reações de oxiredução.
Anidrase carbônica
*
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
*
INIBIDORES ENZIMÁTICOS
São substâncias que diminuem a atividade enzimática. Alguns são constituintes normais das células. Outros são estranhos ao metabolismo.
Cumprem um papel regulador importante.
*
Inibição Enzimática
1. Irreversível: modificação covalente e
 definitiva no sítio ativo
2. Reversível:
 - Competitiva
 - Não-competitiva
Aplicações:
 Estrutura da enzima
 Compreensão das vias metabólicas
 Mecanismo de catálise
 Processos patológicos
 Fármacos
*
Reagem quimicamente com as enzimas levando a inativação praticamente definitiva. 
Exemplo:
Compostos organofosforados (inseticidas, pesticidas):
formam ligações covalentes com grupos –OH de resíduos Ser.
 
inibem acetilcolinesterase  lacrimejamento, salivação, diarréia, tremores, broncoconstrição, distúrbios cardiorrespiratórios, bradicardia e depressão do SNC.
INIBIDORES IRREVERSÍVEIS
*
INIBIDORES IRREVERSÍVEIS
Ex: Inibição da quimotripsina pelo diisopropilfluorofosfato
Esta inibição levou à conclusão que o resíduo Ser195 é essencial à atividade catalítica
*
INIBIDORES IRREVERSÍVEIS
Gases Neurotóxicos (Sarin, Tabun)  inibem a acetilcolinesterase irreversivelmente, levando ao bloqueio da transmissão de impulsos nervosos.
Corticosteróides  inibem a fosfolipase, reduzindo a disponibilidade de ácido araquidônico, afetando a síntese dos eicosanóides (prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos e leucotrienos): 
atuam como “hormônios locais” 
participam da regulação de diversos processos fisiológicos:
contração da musculatura lisa
regulação da pressão arterial 
dilatação dos brônquios 
contração uterina 
reações inflamatórias 
dor e febre 
coagulação sanguínea
*
Pontos de inibição de agentes anti-inflamatórios
e/ou analgésicos
*
Ex: Inibição das enzimas cicloxigenases pelo acetilsalicilato
INIBIDORES IRREVERSÍVEIS
Aspirina: transfere irreversivelmente seu grupo acetil para grupo –OH de um resíduo Ser da molécula de cicloxigenase, inativando-a.
*
Inibidores Específicos da COX-2
*
Penicilina  inibidor irreversível. 
  inibidor específico de enzimas da síntese da parede bacteriana (transpeptidase), provocando a lise das células que estão desprovidas de parede. 
INIBIDORES IRREVERSÍVEIS
Agente terapêutico atua sobre uma enzima que o
parasita apresenta, mas o indivíduo hospedeiro não
*
Omeprazol®  inibidor irreversível da enzima K+/H+ ATPase (bomba de prótons) das células parietais gástricas. 
A longo prazo, câncer gástrico (?)
Xenical®  inibe a lipase pancreática, impedindo a absorção de aproximadamente 30% da gordura alimentar no intestino delgado. 
Efeitos colaterais: evacuação solta, diminuição da absorção de vitaminas lipossolúveis (A, D, E e K) 
INIBIDORES IRREVERSÍVEIS
*
 Competem com o substrato pelo sítio ativo da enzima.
 Moléculas que apresentam estrutura química semelhante à do S. Ligam-se ao sítio ativo da E, produzindo um complexo enzima-inibidor (EI), semelhante ao complexo enzima-substrato (ES). O complexo EI nunca gera produto.
 A Vmáx é atingida e o valor de Km aumenta aparentemente, uma vez que o inibidor está competindo com o substrato. 
INIBIDORES REVERSÍVEIS COMPETITIVOS
*
Inibição Competitiva
*
Alteração de parâmetros cinéticos pelo
Inibidor Competitivo
 [S] desloca o I e Vmáx é atingida
*
Duplo-recíproco
-1/Km
*
INIBIDORES COMPETITIVOS
Ácido fólico (sintetizado por bactérias)
fator de crescimento essencial
Sulfonamida e derivados como sulfapiridina e sulfatiazol ligam-se à enzima bacteriana e são anexadas na síntese do folato no lugar do PABA, gerando um “falso folato”, que não é eficaz como cofator na síntese de bases nitrogenadas.
Ex: ação das sulfas como bactericidas
*
AZT (tratamento da AIDS)
INIBIDORES COMPETITIVOS
compete com timidina
*
Alopurinol (Tratamento da Gota)
DNA/RNA
Nucleosídeos 
Remoção da ribose +
desaminação
Xantina oxidase
Xantina (G)
ácido úrico
(produto final excretado por seres humanos)
Xantina oxidase
hipoxantina (A)
Gota
Purínicos: A e G e Pirimidínicos: C, T e U
*
Viagra (Tratamento da Disfunção Erétil)
*
Intoxicação por Metanol
Metanol
Formaldeído

*
 Não apresentam qualquer semelhança estrutural com o substrato da reação que inibem.
 Ligam-se a radicais que não fazem parte do sítio ativo; o inibidor se liga à cadeia lateral de um determinado aminoácido, inativando a enzima reversivelmente.
 Cineticamente, há uma redução aparente na [E]. KM não muda, porém, Vmáx é reduzida.
Ex: metais pesados: Hg+2, Pb+2, Ag+ (reagem com grupos –SH de proteínas).
Pouco específicos e amplo espectro de ação.
INIBIDORES REVERSÍVEIS
NÃO-COMPETITIVOS
*
Inibição NÃO-Competitiva
*
Alteração de parâmetros cinéticos pelo
Inibidor NÃO-Competitivo
*
sem inibidor e com inibidores
Duplo-recíproco
*
Enzimas cujas concentrações plasmáticas são
alteradas em determinadas condições patológicas
*
Inibidor Substrato Enzima Doença
*
CPK = creatina quinase 
LDH = lactato desidrogenase
HBDH = -hidroxibutirato desidrogenase
Cinética de liberação de enzimas cardíacas 
no soro após infarte do miocárdio

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