700706 TeseLocusCeoruleus

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Universidade de Lisboa 
Faculdade de Medicina de Lisboa 
 
 
 
 
 
 
LOCUS CERULEUS HUMANO: 
MAPEAMENTO DOS NEURORECEPTORES 
DOPAMINÉRGICOS D1 E D2 
 
 
 
 
 
Joana Adelaide Mota de Oliveira de Barbas Regala 
 
 
 
 
 
Dissertação de Mestrado em Neurociências 
 
 
 
 
2013 
 
Universidade de Lisboa 
Faculdade de Medicina de Lisboa 
 
 
 
 
 
 
LOCUS CERULEUS HUMANO: 
MAPEAMENTO DOS NEURORECEPTORES 
DOPAMINÉRGICOS D1 E D2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Joana Adelaide Mota de Oliveira de Barbas Regala 
 
 
Dissertação de Mestrado orientada pelo Professor Doutor Gonçalves Ferreira 
 
 
 
 
Mestrado em Neurociências 
 
 
 
2013 
 
A impressão desta dissertação foi aprovada em reunião do conselho científico dia 19 de Novembro de 2013 
 
i 
 
 
 
RESUMO 
Fundamentos: O Locus Ceruleus (LC) humano é um núcleo situado na porção dorsal superior 
da protuberância, envolvido em múltiplos circuitos neuroquímicos. As suas aferências 
dopaminérgicas são fundamentais para o estado de vigila e são provenientes sobretudo da 
área tegmental ventral (via mesocerúlica) e da substância cinzenta periaquedutal. Num estudo 
anterior, concluímos que o LC humano é um núcleo mais estreito (± 1,3 mm) e mais longo (± 
14mm) do que previamente descrito. 
Objetivos: Estudo da distribuição diferencial dos subtipos de receptores dopaminérgicos D1 e 
D2 (D1R e D2R) ao longo da extensão do LC humano e a nível intracelular. 
Material e Métodos: 8 LC obtidos de 4 troncos cerebrais (TC) humanos. Fixação, dissecção e 
inclusão em parafina dos TC; execução de cortes seriados e referenciados no micrótomo 
perpendicularmente ao pavimento do IV ventrículo e à linha média; marcação 
imunohistoquímica dos subtipos D1R e D2R e coloração com hematoxilina como controlo 
histológico; observação da marcação dos neurónios do LC ao microscópio de fluorescência; 
análise da distribuição de D1R e D2R ao longo de toda a extensão do LC e a nível intracelular 
e da sua co-localização celular; estudo da proporção relativa de D1R e D2R através da análise 
quantitativa da respetiva imunoreactividade, através de programa informático adequado (Image 
J 1.44®); análise estatística dos dados pelo teste de Wilcoxon (α<0,05). 
Resultados e Conclusões: Os D2R são significativamente mais abundantes que os D1R no 
LC humano (p ≤ 0,004). Os D2R estão presentes na generalidade dos neurónios, encontrando-
se em amplos compartimentos citoplasmáticos, incluindo a nível dos grânulos de 
neuromelanina, bem como na porção proximal das dendrites e membrana citoplasmática. Os 
D1R têm uma distribuição mais escassa e esparsa, sobretudo no terço superior do LC, 
expressando-se em neurónios pobres em grânulos de neuromelanina, em compartimentos 
intracitoplasmáticos mais restritos. A co-localização de ambos os neuroreceptores é pouco 
frequente. 
Palavras-Chave: Locus Ceruleus, neuromelanina, receptores dopaminérgicos, tronco cerebral, 
humanos. 
 
 
 
 
 
ii 
 
 
 
ABSTRACT 
Background: Locus coeruleus (LC) is a brainstem (BS) nucleus located in the upper dorsal 
pons, involved in several neurochemical circuits. Its dopaminergic afferents from ventral 
tegmental area (via mesocoerulear) and periaqueductal gray matter play a key role in promotion 
of arousal. In a previous study, it was concluded that the human LC is narrower (± 1.3 mm) and 
longer nucleus (± 14mm) than previously described. 
Objectives: To study the differential distribution of D1 and D2 dopaminergic receptors subtypes 
(D1R and D2R) along the human LC length and at subcellular level. 
Material and Methods: 8 LC obtained from 4 human BS. Fixation, dissection and paraffin 
embedding of BS; serial sections on the microtome perpendicular to the fourth ventricle floor 
and the midline planes; immunohistochemical labeling of D1R and D2R subtypes and staining 
with hematoxylin for histological control; observation on fluorescence microscope; analysis of 
differential D1R/D2R distribution along the entire length of the LC and at subcellular level; 
analysis of cellular co-localization; study of the relative proportion of each subtype receptor by 
quantitative analysis of the respective immunoreactivity through a computer program (Image J 
® 1.44); statistical analysis of data by the Wilcoxon test (α <.05). 
Results and Conclusions: D2R are significantly more abundant than D1R in the human LC (p 
≤ 0.004). D2R are globally present in all neurons in large cytoplasmatic compartments, namely 
at neuromelanin granules as well as in the proximal dendrites and cytoplasmatic membrane. 
D1R have a sparser and scarcer distribution, mainly in the upper third of the LC, in neurons 
poor in neuromelanin granules, in more restricted intracytoplasmatic compartments than D2R. 
The co-localization of both neuroreceptors was seldom seen. 
Key-words: Locus Ceruleus, neuromelanin, dopaminergic receptors, brainstem, humans. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
iii 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
APOVL – Área pré-optica ventrolateral 
ATV - Área tegmental ventral 
AVC – Acidente vascular cerebral 
LC - Locus Ceruleus 
D1R – Receptores dopaminérgicos do subtipo D1 
D2R - Receptores dopaminérgicos do subtipo D1 
FLC - Fator libertador de corticotrofina 
GABA – “Gamma-aminobutyric acid” 
GABA-A - (receptores) Gabaérgicos do subtipo A 
5-HT1A – (receptores) Serotoninérgicos do subtipo 1A 
5-HT2C – (receptores) Serotoninérgicos do subtipo 2C 
IL-1β – Interleucina 1β 
mRNA – “Messenger ribonucleic acid” 
NDR - Núcleo dorsal da rafe 
NPP - Núcleo pedúnculo-pôntico 
NPrH – Núcleo prepósito do nervo hipoglosso 
NTDL - Núcleo tegmentar dorso-lateral 
NTM - Núcleo tuberomamilar 
NMDA – “N-methyl-D-aspartate” 
OXR1 – Receptor de orexina do subtipo 1 
OXR1 - Receptor de orexina do subtipo 2 
REM – “Rapid eye movement” 
RMf - Ressonância magnética funcional 
TC – Tronco cerebral 
TSE – “Turbo Spin-Echo” 
Nota: As palavras entre aspas pretendem identificar termos com denominação anglo-saxónica. 
ÍNDICE GERAL 
 
RESUMO i 
ABSTRACT ii 
LISTA DE ABREVIATURAS iii 
ÍNDICE GERAL 1 
1. INTRODUÇÃO 3 
1.1. Importância Funcional e Clínica do LC …………………………………………………….3 
1.1.1. Ciclo Sono-Vigília ……………………………………………………………………...3 
1.1.2. Tónus Muscular ………………………………………………………………………..5 
1.1.3. Ansiedade, Pânico, Memória e Cognição …………………………………………..5 
1.1.4. Nocicepção ……………………………………………………………………………..6 
1.1.5. Funções Autonómicas, Hipotalâmicas, Neuroendócrinas e Reflexas …………..6 
1.1.6. Síndrome de Abstinência aos Opiáceos …………………………………………….8 
1.1.7. Epileptogénese ………………………………………………………………………...81.1.8. Doenças do Desenvolvimento ………………………………………………………..8 
1.1.9. Doenças Neurodegenerativas ………………………………………………………..8 
1.2 Anatomia Estereotáxica do LC Humano ……………………………………………..10 
1.3 Caracterização Neuroquímica do LC …………………………………………………….15 
1.3.1 Aferências e Neuroreceptores do LC ………………………………………………15 
1.3.2 Receptores Dopaminérgicos do LC ………………………………………….……..16 
2. OBJETIVOS 16 
 
 
 
 - 2 - 
 
3. MATERIAL E MÉTODOS 17 
3.1 Material ………………………………………………………………………………………17 
3.2 Métodos …………………………………………………………………………………...…18 
 3.2.1 Recolha e processamento das peças anatómicas ……………………………….18 
3.2.2 Processamento anatómico e histoquímico …………………………………….….18 
 3.2.3 Análise qualitativa da localização imunohistoquímica 
diferencial de D1R e D2R …………………………………………………………………. 20 
 3.2.4 Análise semiquantitativa de D1R e D2R…………………………………………. 20 
4. RESULTADOS 21 
4.1 Especificidade dos anticorpos anti D1R e D2R ……………………………………………21 
 4.2 Localização imunohistoquímica dos receptores 
dopaminérgicos (D1R e D2R) ……………………………………………………………………22 
5. DISCUSSÃO 29 
6. CONCLUSÕES 30 
BIBLIOGRAFIA 31 
AGRADECIMENTOS 37 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 3 - 
1. INTRODUÇÃO 
O LC é um núcleo da formação reticular do tronco cerebral humano e é o principal núcleo 
noradrenérgico do sistema nervoso central [16]. Foi descoberto em 1786 pelo anatomista 
francês Félix Vicq-d’Azyr. O seu nome deriva do latim locus coeruleus, que significa “mancha 
azul”, dada a sua coloração azul acinzentada à vista macroscópica do TC. Esta pigmentação 
deve-se à presença de grânulos de melanina no interior do citoplasma das células do LC 
[54,80]. Assim, os neurónios do LC humano são facilmente identificáveis em microscopia óptica 
nos cortes histológicos corados com hematoxilina, visto tratarem-se de neurónios de tamanho 
médio, com grânulos de neuromelanina no citoplasma (fig.1). 
 
Figura 1 – Imagem de corte histológico corado com hematoxilina, onde se observa um aglomerado de neurónios 
pigmentados junto ao sulco limitante do triangulo protuberancial do pavimento do IV ventrículo, correspondente ao LC. 
A maior parte do conhecimento atual acerca da morfologia, localização precisa e circuitos 
funcionais em que o LC está envolvido, deriva de extrapolações de dados experimentais 
obtidos em modelos animais, existindo poucos estudos efetuados em material humano [3, 4, 
15, 18, 32, 36, 37, 38, 40, 44, 47, 51, 56, 71, 74, 75, 76]. 
1.1 Importância Funcional e Clínica do LC 
1.1.1 Ciclo Sono-Vigília 
O LC é um dos principais núcleos responsável pelo estado de vigília [2, 3, 23, 62], através de 
projeções excitatórias para diversas áreas corticais do cérebro e de múltiplas conexões com 
outros núcleos moduladores da rede neuronal de regulação do ciclo sono/vigila (fig.2). O seu 
nível de atividade correlaciona-se estreitamente com o grau de vigília. 
As projeções noradrenérgicas do LC exercem uma ação excitatória sobre outros núcleos 
promotores do estado de vigília, tais como o NPP [6], o NTDL e neurónios serotoninérgicos do 
NDR a nível do tronco cerebral [36], núcleos intralaminares do tálamo e neurónios colinérgicos 
do prosencéfalo basal [7, 20]. Estas projecções têm também um efeito inibitório sobre 
neurónios GABAérgicos promotores do sono a nível do prosencéfalo basal e da APOVL do 
hipotálamo [68]. O LC exerce um efeito inibitório sobre o sono REM provavelmente através da 
inibição de um subgrupo de neurónios do NPP (fig.2). Este efeito supressor do LC sobre o sono 
REM está bem documentado por electroencefalogramas em humanos [33]. Estudos em 
roedores demonstram que as aferências orexinérgicas provenientes do hipotálamo lateral são 
 - 4 - 
fundamentais neste efeito supressor do sono REM (sobretudo a hipocretina 1) [10], 
promovendo a vigília, bem como têm um efeito facilitador do tónus muscular dos membros 
inferiores (hipocretina 1 e 2) [37]. Deficiências no sistema orexinérgico têm sido associadas a 
perturbações do sono, tais como a narcolepsia [65]. Existem também aferências 
dopaminérgicas facilitadoras do estado de vigila provenientes da ATV [18, 46] (via 
mesocerúlica) e da substância cinzenta periaquedutal [43]. Os neurónios histaminérgicos do 
NTM do hipotálamo projetam-se para o LC, actuando sobre receptores de histamina H3, 
inibindo a libertação de noradrenalina [40]. Ao contrário de outros núcleos hipotalâmicos o LC 
não se projecta reciprocamente para o NTM. Os neurónios do NTM estão activos no estado de 
alerta e quiescentes durante o sono, estando sob a influência das aferências GABAérgicas 
provenientes da APOVL [40]. Assim a ação inibitória das projeções do NTM para o LC restringe 
a atividade dos seus neurónios durante o estado de vigília. Durante o sono REM, o LC recebe 
aferências inibitórias dos neurónios GABAérgicos da APOVL do hipotálamo [53, 72] e do 
núcleo PrH [74]. 
 
 
Imagem adaptada de E. R. Samuels and E. Szabadi* Current Neuropharmacology, 2008, 6, 254-285 
LC – Locus coeruleus (LC); VTA – área tegmental ventral (ATV); VLPO – área pré-óptica ventro-lateral (APOVL); TMN 
– núcleo tuberomamilar (NTM); PPT – núcleo pedúnculo-pontico (NPP); LH/PF – hipotálamo lateral (HL)/área 
perifornical (PF); Th – tálamo; in - interneurónios GABAérgicos. 
 
Figura 2 – Rede neuronal reguladora do ciclo sono/vigília. 
Os núcleos promotores do estado de vigília estão representados a cinzento e os núcleos promotores do sono estão 
representados a branco. O LC promove a vigília através de projeções excitatórias diretas para o córtex cerebral e para 
núcleos promotores de vigília, tal como o NPP, e através de projeções inibitórias para núcleos promotores do sono, tais 
como a APOVL. O LC também inibe a subpopulação de neurónios do NPP promotores do sono REM. O núcleo dorsal 
da rafe promove a vigília através da ativação do córtex cerebral, sendo este efeito atenuado pela estimulação da 
interneurónios GABAérgicos que inibem a ATV e o LC. A ATV promove a vigília sobretudo através da ativação do LC e 
do HL. A APOVL promove o sono através da inibição do TMN e do LC. 
 
 
Assim, um aumento na actividade do LC favorece o aparecimento de sinais 
electroencefalográficos de vigília [8] e exerce um efeito inibitório sobre o sono REM, 
provavelmente através da inibição do grupo de neurónios colinérgicos do NPP responsáveis 
pelo sono REM [31]. 
Hipotálamo 
Tronco 
cerebral Sono 
REM 
 - 5 - 
O estado de coma em doentes pós-AVC tem também sido associado a lesões ao nível da 
porção dorsal superior da protuberância correspondente à região do LC [57]. 
1.1.2 Tónus Muscular 
O LC regula alterações do tónus muscular durante a transição sono/vigília. Os neurónios doLC 
projetam-se diretamente para os motoneurónios gama nos cornos anteriores da medula 
espinhal, facilitando o tónus muscular postural durante a vigília. As aferências orexinérgicas 
para o LC e para os motoneurónios gama são fundamentais para este mecanismo [33, 48] 
(Fig.3). Na transição para o sono e na cataplexia os neurónios do LC ficam inativos, removendo 
o efeito facilitador do tónus muscular [48, 77]. 
 
Imagem adapatada de Ronald McGregor & Jerome M Siegel; Illuminating the locus coeruleus: control of posture and 
arousal; Nature Neuroscience 13, 1448–144 (2010) 
R – núcleo rubro; PaR – núcleo pararubrico; LC – Locus Ceruleus; 7N – VII nervo craniano; IO – núcleo olivar inferior 
 
Figura 3 - Locus Ceruleus e regulação do tónus muscular. 
A imagem ilustra os principais elementos que participam na regulação do tónus muscular, mostrando um corte sagital 
do tronco cerebral e um corte axial da medula espinhal. Os neurónios orexinérgicos têm um efeito excitatório sobre o 
LC e sobre os motoneurónios, facilitando o tónus muscular. A perda de tónus muscular no sono REM e na cataplexia 
resulta não só da perda da facilitação do tónus muscular mas também de uma inibição GABAérgica e glicinérgica dos 
motoneurónios pela área inibitória bulbar. Os neurónios glutamatérgicos na área inibitória pôntica, ativos durante o 
sono REM, facilitam a libertação de GABA e glicina pela área inibitória bulbar e inibem o LC através de interneurónios 
GABAérgicos. 
1.1.3 Ansiedade, Pânico, Memória e Cognição 
O LC intervém também nos mecanismos de adaptação ao stress e ao pânico, em virtude das 
conexões recíprocas que estabelece com o núcleo amigdalino. Estudo efetuados em modelos 
animais revelaram que a apresentação de paradigmas indutores de stress leva à libertação de 
vários neurotransmissores ao nível do LC, tais como a noradrenalina, a serotonina e o FLC, 
ativando-os [68]. Esta activação acompanha-se de aumento do nível de vigília, ativação 
simpática e inibição do sono REM. Estudos de RMf em humanos voluntários demonstraram a 
ativação do LC quando submetidos a paradigmas indutores de estados de stress/medo [42]. A 
resposta de susto, com contracção involuntária dos músculos faciais perante estímulos súbitos, 
por exemplo sonoros, deve-se às projeções pelo LC para os motoneurónios do núcleo motor do 
facial [32]. 
Área inibitória 
bulbar 
Área inibitória 
pontica 
 - 6 - 
Modelos de controlo cognitivo postulam um papel modulatório chave do sistema 
noradrenérgico do LC. Perante estímulos emocionais são ativados circuitos motivacionais e 
cognitivos através das projecções do LC para o núcleo accumbens, córtex pré-frontal e 
hipocampo, sendo as duas últimas responsáveis pela atenção selectiva e formação de 
memórias com conotação emocional, respetivamente. O papel do LC na cognição relacionada 
com o stress é complexo e multimodal. As projeções noradrenérgicas potenciam a memória de 
trabalho atuando em receptores α2 adrenérgicos. No entanto a excessiva ativação 
noradrenérgica pode prejudicar a memória de trabalho ao ligar-se aos receptores de baixa 
afinidade α1 adrenérgicos. Foi estudado o efeito da ativação do LC em humanos, através da 
administração de um fármaco estimulante (modafinil), na execução de tarefas cognitivas, com 
monitorização neuroimagiológica por RMf. A administração de modafinil foi associada a 
aumento da execução de tarefas relacionadas com a activação do LC e do córtex pré-frontal. 
Estes resultados confirmam o papel do sistema noradrenérgico do LC na função do córtex pré-
frontal e no controlo cognitivo em humanos [50]. 
Assim, o LC tem sido implicado em patologias neuropsiquiátricas, tais como perturbações de 
ansiedade e pânico, stress pós-traumático, persistência de memórias traumáticas [14] e 
sintomas ansiogénicos presentes em síndromes depressivas [9]. 
1.1.4 Nocicepção 
O LC é também um dos centos moduladores da nocicepção, tal como a substância cinzenta 
peri-aquedutal e os núcleos da rafe. O LC recebe aferências de estímulos termoálgicos, é 
modulado por projecções da substância cinzenta periaquedutal e do núcleo paragigantocelular 
do bulbo [66] e emite fibras descendentes que actuam em interneurónios encefalinérgicos 
situados nos cornos cinzentos posteriores da medula (laminas II e V de Rexed), que inibem os 
impulsos nociceptivos, modulando desta forma os seus efeitos analgésicos [59]. 
1.1.5 Funções Autonómicas, Hipotalâmicas, Neuroendócrinas e Reflexas 
O LC desempenha um papel fundamental na regulação de funções autonómicas, em conjunto 
com outros núcleos noradrenérgicos do tronco cerebral, tais como os núcleos noradrenérgicos 
A1/A5. 
O LC exerce influência sobre o sistema nervoso autónomo através de projeções para o núcleo 
paraventricular do hipotálamo que por seu turno envia múltiplas projeções para os neurónios 
pré-ganglionares simpáticos localizados nos cornos laterais da medula espinhal e para os 
neurónios pré-ganglionares parasimpáticos dos nervos cranianos [68]. O LC também emite 
projeções diretas inibitórias para neurónios pré-ganglionares parassimpáticos, atuando sobre 
recetores α2 adrenérgicos [68]. 
O padrão de ativação distinto do LC, consoante os estímulos, leva a supor a existência de duas 
subpopulações distintas de neurónios relacionadas com efeitos simpático-excitatórios e 
parassimpático-inibitórios (fig.4). Assim, estímulos nóxicos (álgicos, aumento excessivo da 
temperatura ambiental), bem como aferências da via mesocerúlica resultam na ativação 
relativamente seletiva de neurónios do LC pré-simpáticos, levando a midríase, sem inibição do 
 - 7 - 
reflexo fotomotor ou de outros reflexos parassimpáticos, tais como a salivação. Por outro lado, 
estados de ansiedade, provavelmente mediados pela ativação da amígdala, levam à ativação 
preferencial de neurónios inibitórios pré-parasimpáticos e à inibição dos reflexos fotomotor e da 
salivação. 
A atividade do LC é influenciada por alterações térmicas ambientais através das aferências 
provenientes do núcleo pré-óptico do hipotálamo. A ativação do LC por temperaturas 
ambientais elevadas associa-se a ativação do sistema nervoso simpático, manifestando-se por 
aumento da frequência cardíaca, sudorese, tremor fisiológico das extremidades [1] e redução 
do tempo de recuperação do reflexo fotomotor [41]. A estimulação cutânea térmica também 
aumenta a actividade do LC através de aminoácidos excitatórios provenientes do núcleo 
paragigantocelular [29]. No entanto alterações crónicas de temperatura induzem diminuição da 
atividade do LC, traduzindo-se por diminuição da expressão da tirosina hidroxilase, enzima 
fundamental na regulação da síntese de catecolaminas e por aumento da expressão de 
receptores α2 adrenérgicos, no caso de exposição crónica ao frio [21, 25]. 
O LC é um núcleo fundamental na regulação da temperatura em resposta a infeções, sendo a 
sua ativação regulada pela IL-1β [49, 68]. 
O LC está envolvido na regulação neuroendócrina através de projeções para os núcleos 
paraventricular e arqueado do hipotálamo e inibe a secreção de prolactina [66, 68]. 
O LC tem também um efeito inibitório direto no centro vasomotor, no entanto a ativação do LC 
resulta em aumento moderado da frequência cardíaca e tensão arterial, indicando a 
predominância do efeito do aumento do tónus simpático [54, 68]. O LC também exerce um 
efeito excitatório sobre o centro respiratório aumentando a frequência respiratória [30]. 
 
 
 
Imagem adaptada de E. R. Samuels and E. Szabadi* Current Neuropharmacology, 2008, 6, 254-285 
Figura 4 - Hipotética subdivisão funcional dos neurónios do LC com distintos efeitos no sistema nervosoautónomo. 
Vigília Ansiedade 
Estímulos 
nóxicos 
Actividade 
parassimpática 
Actividade 
simpática 
ATV 
 
Amígdala 
 - 8 - 
1.1.6 Síndrome de Abstinência aos Opiáceos 
O LC é a principal estrutura anatómica o tronco cerebral envolvida na síndrome de abstinência 
aos opiáceos. O uso prolongado de opiáceos, que actuam a nível dos receptores μ dos 
neurónios do LC, leva a uma dessensibilização dos mesmos, contribuindo para a habituação. 
Quando a administração de opiáceos cessa, o LC liberta noradrenalina em altas quantidades, 
causando uma ativação simpática exuberante, responsável pelos sintomas de abstinência, tais 
como taquicárdia, sudorese, tremores, agitação psicomotora, ansiedade, pânico e alucinações 
[59]. 
1.1.7 Epileptogénese 
Destaca-se também o efeito supressor do LC sobre as crises convulsivas. Existe evidência que 
o mecanismo anti-convulsivo resultante da estimulação do nervo vago é mediado em grande 
parte pela estimulação indireta do LC, através das aferências excitatórias provenientes do 
núcleo do feixe solitário [38]. Em animais, a lesão do LC anula o efeito terapêutico da 
estimulação do nervo vago [38]. A estimulação do nervo vago é também utilizada nas 
síndromes depressivas refratárias ao tratamento farmacológico [52]. 
1.1.8 Doenças do Desenvolvimento 
Nas perturbações do espectro autista, postula-se que ocorra uma desregulação do sistema 
noradrenérgico do LC, que é atenuada durante intercorrências febris [49], visto que se verifica 
uma melhoria clínica comportamental em algumas crianças autistas em contexto de febre [49]. 
No caso particular da síndrome de Rett, pensa-se que o LC seja um alvo crítico de disfunção, 
contribuindo para a disfunção ventilatória e cognitiva. Modelos animais com mutação do gene 
MECP2 exibem redução da transcrição do mRNA da tirosina hidroxilase nas células do LC e 
alterações morfológicas das espinhas dendríticas [64]. 
O efeito terapêutico da atomoxetina, inibidor seletivo da recaptação de noradrenalina utilizado 
no tratamento da perturbação de hiperatividade e défice de atenção, pode estar relacionado 
com a facilitação das projeções noradrenérgicas provenientes do LC [28]. 
1.1.9 Doenças Neurodegenerativas 
Existem alterações anatomopatológicas no LC associadas a várias doenças 
neurodegenerativas, incluindo doença de Parkinson, paralisia supranuclear progressiva, 
esclerose lateral amiotrófica, coreia de Huntington, doença de Alzheimer e doença de Pick [46, 
68]. 
Na doença de Parkinson ocorre uma perda neuronal significativa no LC, que se traduz por 
diminuição do sinal da neuromelanina em RM. Estudos pos-mortem de indivíduos com doença 
de Parkinson revelam que esta depleção celular é mais acentuada nas células do LC que nos 
neurónios da pars compacta substância nigra [81], com aparecimento precoce de corpos de 
Lewy. Ocorrem também outras alterações nos componentes pré e pós sinápticos das sinapses 
ao nível do LC, tumefacção do citoplasma, alteração da morfologia das mitocôndrias e 
encurtamento e diminuição da arborização das dendrites. Existe evidência experimental que as 
 - 9 - 
projecções noradrenérgicas do LC exercem um efeito neuroprotetor sobre os neurónios 
dopaminérgicos da substância nigra [70], tendo um efeito facilitador sobre a via nigro-estriada 
[71] e modulando desta forma os circuitos extrapiramidais. Os sintomas depressivos que 
acompanham estas doenças neurodegenerativas podem dever-se em parte à diminuição de 
inervação noradrenérgica do sistema límbico [63]. 
Também na doença de Alzheimer, estudos pos-mortem confirmam uma perda neuronal 
precoce a nível do LC, sendo esta mais extensa do que a perda dos neurónios colinérgicos do 
núcleo basal de Meynert, correlacionando-se melhor com a duração da doença [12, 24] e 
ocorrendo também alterações morfológicas nos neurónios do LC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 10 - 
1.2 Anatomia Estereotáxica do LC Humano 
A descrição topográfica do LC humano foi publicada pela primeira vez em 1809 por Reil [55, 
78], no entanto, a sua localização e configuração tridimensional (3-D) exatas (i.e. a sua 
anatomia estereotáxica), bem como a variabilidade dos seus contornos estiveram muito tempo 
por definir. 
O LC, tal como outros núcleos do TC, não é diretamente visualizável nos exames de 
neuroimagem convencional [11, 13], à exceção das ponderações de alto campo magnético (T1-
TSE) ou de campo ultra-alto que detetam o sinal da neuromelanina [35]. O conhecimento da 
anatomia estereotáxica do LC tem um potencial interesse para a sua localização precisa in vivo 
e para a aplicação das suas referências 3-D em múltiplos procedimentos, tais como a 
implantação de sondas estereotáxicas e a dissecção microcirúrgica do tronco cerebral. 
Por isso, procedeu-se ao estudo da anatomia estereotáxica do LC humano [22] de acordo com 
um sistema de referências ortogonais adequado [19, 26, 27], constituído pela linha média, pelo 
pavimento do IV ventrículo e pela transição bulbo-protuberancial. 
Foram estudados 40 LC provenientes de 20 TC humanos adultos, de ambos os sexos (sexo 
masculino:9; sexo feminino:11), com idades compreendidas entre os 29 e os 92 anos. Estes 
foram submetidos a cortes isotópicos seriados num criomicrótomo, de forma normalizada, 
perpendiculares à linha média e ao pavimento do IV ventrículo, com referenciação de posição 
para possibilitar a localização e a reconstrução 3-D. Os cortes histológicos foram corados com 
hematoxilina-eosina e procedeu-se à localização 3-D das células do TC em relação ao sistema 
de referências ortogonais referido (fig.5). 
 
 A B 
Figura 5 
5A - Referenciação bidimensional (2-D) de um corte histológico, digitalizado em macroscópio com objectiva plan-
apocromática e câmara fotográfica digital acoplada, com marcação da posição da linha média (X-X’), do pavimento do 
IV ventrículo (Y-Y’) e do nível crânio-caudal do corte (Z-Z’); 5B - Marcação, na imagem digitalizada, das células do LC 
com referenciação 2-D automática. 
 
 
Determinaram-se os contornos de cada LC a partir da respetiva distribuição celular 
bidimensional (2-D), utilizando-se os contornos de inclusão de 90 e 95% das células (fig.6) e 
fez-se a reconstrução 3-D dos contornos do LC a partir da integração dos contornos 2-D 
(Fig.8). 
 
 - 11 - 
 Figura 6 – Contornos 2-D da densidade celular. 
Traçado dos contornos bidimensionais do LC no mesmo plano, com referenciação 2-D (inclusão de 95% das células). 
 
Procedeu-se à análise comparada da variabilidade 2-D intercasos do LC, plano a plano, 
através dos contornos coplanares correspondentes a 50, 75, 90 e 95% das células respectivas 
e da variabilidade 3-D, a partir da reconstrução dos contornos 2-D plano a plano (fig. 7). Para o 
estudo da variabilidade baseado na distribuição das células do LC, cada metade do tronco 
cerebral (esquerdo e direito) foi considerado como um caso distinto. 
 Figura 7 – Lado esquerdo: sobreposição dos contornos 2D (inclusão 
de 95, 90, 75, 50% das células) para o estudo da variabilidade intercasos. 
 
Constatou-se que os comprimentos médios (± desvio padrão) da protuberância e do LC são 
respetivamente 26,4±1,59mm e 14,1±1,11mm, nos indivíduos do sexo masculino, e de 
27,4±1,36mm e 14,9±1,4mm nos indivíduos do sexo feminino. Verificou-se marcada 
variabilidade das dimensões do LC de indivíduo para indivíduo, sem evidente assimetria 
esquerda/direita. O comprimento do LC variou entre 12,0mm e 17,0mm, sendo a média do 
comprimento do LC de 14,5±1,3mm. A largura média foi de 1,4±0,2mm e a altura (dorso-
ventral) média foi de 1,3±0,2mm. 
Na globalidade, o LC pode encontrar-seentre 7,5mm e 27,5mm acima da transição bulbo-
protuberancial. Os níveis acima da transição bulbo-protuberancial situados entre 14,0mm e 
21,5mm são comuns a todos os LC; os níveis situados entre 13,5mm e 14,0mm e entre 
21,5mm e 23mm são comuns a 90% dos casos e os níveis situados entre 13mm e 13,5mm e 
entre 23,5mm e 24mm são comuns a 80% dos casos (tabela 1). 
 
 
 
 
 
 
 - 12 - 
 
 
 
Tabela 1 – Distribuição crânio-caudal dos 20 pares de LC. 
As diferentes gradações de cores representam a distribuição dos pares de LC ao longo da protuberância, 
correspondendo aos níveis de inclusão de 100% dos casos (cinzento), 90% dos casos (amarelo) e 80% dos casos 
(laranja). 
 
 
 Figura 8 – Reconstrução 3-D do LC humano 
 
 
28 36 36
27 35 35 32
41 41 26 40 34 34 34 42 31
40 39 25 39 33 33 33 41 30
39 38 32 24 38 32 32 32 40 37 30 29
38 37 31 23 37 31 31 31 31 39 36 29 28
40 37 36 30 22 36 30 30 30 30 38 35 28 27
39 37 35 35 29 21 33 35 29 29 29 29 37 34 27 26
38 35 34 34 28 20 32 29 34 28 28 28 36 28 36 33 26 25
36 49 34 33 33 27 19 31 28 33 27 27 27 35 27 35 32 25 24
35 48 32 32 32 26 18 30 27 32 26 26 26 34 26 34 31 24 23
34 46 31 31 31 25 17 29 26 31 25 25 25 33 25 33 30 23 22
32 45 29 30 30 24 16 28 25 30 24 28 24 24 32 24 32 29 22 21
31 43 28 29 29 23 15 27 24 29 23 27 23 23 31 23 31 28 21 20
30 42 26 28 28 * 14 26 23 28 22 26 22 22 30 22 30 27 20 19
28 40 25 26 27 * 13 25 22 27 21 25 21 21 29 21 29 26 19 18
27 39 23 25 26 20 12 24 21 26 20 24 20 20 28 20 28 25 18 17
26 37 22 24 25 * 11 23 20 25 19 23 19 19 27 19 27 24 17 16
24 36 20 23 24 * 10 22 19 24 18 22 18 18 26 18 26 23 16 15
23 34 19 22 23 17 9 21 18 23 17 21 17 17 25 17 25 22 15 14
22 33 17 21 22 16 8 20 17 22 16 20 16 16 24 16 24 21 14 13
20 31 16 20 21 15 7 19 16 21 15 19 15 15 23 15 23 20 13 12
19 30 14 19 19 14 6 18 15 20 14 18 14 14 22 14 22 19 12 11
18 28 13 17 18 13 5 17 14 19 13 17 13 13 21 13 21 18 11 10
16 27 12 16 17 12 4 16 13 18 12 16 12 12 20 12 20 17 10 9
15 25 9 15 16 11 3 15 12 17 11 15 11 11 19 11 19 16 9 8
14 24 8 14 15 10 2 14 11 16 10 14 10 10 18 10 18 15 8 7
12 22 7 13 14 9 1 13 10 15 9 13 9 9 17 9 17 14 7 6
11 21 5 12 13 8 12 9 14 8 12 8 8 16 8 16 13 6 5
10 19 4 11 7 11 8 13 7 11 7 7 15 15 12 5 4
8 18 2 10 6 10 7 12 6 10 14 14 11 4 3
16 1 9 6 11 5 9 13 13 10 3
15 8 5 10 8 12 12 9 2
13 7 4 9 7 11 11 8 1
12 6 3 8 6 10
5 2 7 5 9
4 1 4 8
3 7
2 6
1 5
4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 
 + 27,5 mm 
+ 7,5 mm 
+ 21,5 mm 
+ 14,0 mm 
+ 13,5 mm 
+ 23,5 mm 
+ 24 mm 
+ 13 mm 
 - 13 - 
O centro anatómico do LC humano encontra-se, em média, a uma distância de 3,2±0,3mm da 
linha média (mínimo; 2,6mm; máximo: 3,7mm), a 1,1±0,2mm do pavimento do IV ventrículo 
(mínimo: 0,8mm; máximo: 1,6mm) e a 18,5±1,5mm (mínimo: 15,0mm; máximo: 20,5mm) do 
plano da transição bulbo-protuberancial. 
Relativamente à configuração 3-D verificou-se que o LC humano tem uma forma 
grosseiramente cilíndrica, mais alongada do que previamente descrita, divergindo no sentido 
caudal a partir da transição do ¼ superior para os ¾ inferiores e afastando-se 
progressivamente da linha média e do pavimento do IV ventrículo (fig.9). Na zona central as 
células do LC encontram-se mais concentradas na porção média do núcleo. 
 
 
Figura 9 – Reconstrução 3-D do LC e variabilidade intercasos do nível crânio-caudal. 
9A – Vista frontal – eixo X representa o plano da linha média; 9B – Vista lateral – eixo Y representa o plano do 
pavimento do IV ventrículo. 
 
 
 
Demonstrou-se que não existe correlação entre tamanho do LC, o sexo e a idade dos 
indivíduos estudados e a altura da protuberância. O estudo de variabilidade intercasos 2-D e 3-
D revelou que este núcleo tem uma localização espacial dispersa em torno de uma zona 
central comum a todos os casos e que esta dispersão é globalmente concêntrica, 
predominando na extremidade caudal (fig.10). 
A 
B 
 - 14 - 
 
Figura 10 - Variabilidade intercasos, contornos e referenciação 3-D 
 
Concluiu-se que o LC humano é um núcleo simétrico, de configuração aproximadamente 
cilíndrica, mais longo do que previamente descrito (14,5±1,3mm), com localização sub-
ependimária na metade superior do pavimento do IV ventrículo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
X: 0 mm 
+ Z: 7,5 mm 
 - 15 - 
1.3 Caracterização Neuroquímica do LC 
1.3.1 Aferências e Neuroreceptores do LC 
Os circuitos neuroquímicos que o LC integra estão extensamente estudados em animais, mas 
há poucos estudos em humanos. Os métodos geralmente aplicados para o estudo das 
projecções eferentes, baseiam-se sobretudo em técnicas de degenerescência axonal e 
transporte axonal anterógrado e retrógrado, cuja aplicação em humanos é inviável em 
condições de colheita de material autóptico. O estudo das aferências em encéfalos humanos 
pos-mortem é mais aplicável, visto que os neuroreceptores sofrem um processo de autólise 
pos-mortem mais lenta que os neurotransmissores. 
De entre os principais tipos de receptores conhecidos no LC destacam-se os adrenérgicos: α1, 
α2 e β. Em roedores, a distribuição dos receptores α1 e α2 ao longo do eixo antero-posterior do 
LC é heterogénea, no que respeita à sua densidade e à afinidade pelos ligandos [54]. Apesar 
de os receptores α2 terem uma distribuição difusa pelo sistema nervoso central, em modelos 
animais parecem ter um papel preponderante a nível do LC, na inibição da libertação de 
noradrenalina relativamente a outras áreas do sistema nervoso central e, tal como o córtex [5] 
também a nível do LC predominam os receptores do subtipo α2A [54]. Tendo em conta a 
ativação do LC em situações de ansiedade e pânico, possivelmente alguns agentes 
farmacológicos tais como os agonistas α2 e β-bloqueantes, medeiam os seus efeitos 
ansiolíticos ao atuarem nos seus receptores-alvo a nível do LC. 
Os receptores serotoninérgicos também estão amplamente documentados no LC de animais, 
sobretudo dos subtipos 5-HT2C e 5-HT1A [54]. Em animais, agonistas dos receptores 5-HT1A 
medeiam a inibição do LC [54], sendo possivelmente este o mecanismo dos ansioliticos 
agonistas dos receptores 5-HT1A em humanos. 
Estão também documentados terminais dopaminérgicos a nível do LC, que estabelecem 
sinapses axono-dendríticas e axonossomáticas com os neurónios do LC, onde se encontram 
receptores dopaminérgicos D1 e D2 [44, 54]. A dopamina tem um efeito ativador sobre o LC, 
contribuindo para a promoção do estado de vigília. 
Os receptores de orexina estão documentados em quantidade abundante ao nível do LC, 
predominando o subtipo OXR1 em animais roedores [65]. Está também documentada uma 
forma de narcolepsia hereditária autossómica recessiva, em aninais caninos, associada a 
mutações dos receptores do subtipo OXR2 [10]. 
Em animais, estão presentes receptores de FLC no LC, existindo também evidência da sua 
presença em humanos. Um estudo em encéfalos pos-mortem de individuos com antecedentes 
de Perturbação Depressiva Major revelou uma maior quantidade de terminais nervosos FLC 
imunorreactivos, comparativamente com encéfalos controlo de indivíduos saudáveis [9]. 
Os receptores ópioides μ são fundamentais nos mecanismos de dependência a drogas e os 
receptores histaminérgicos H3 medeiam os circuitos da sedação [68]. 
Existem outros receptores com uma importância fulcral na modulação da activação e inibição 
do LC, tais como os receptores de glutamato NMDA e não NMDA, receptores GABA-A, e os 
receptores de acetilcolina [68].- 16 - 
1.3.2 Receptores Dopaminérgicos do LC 
As aferências dopaminérgicas são fundamentais na modulação do ciclo sono/vigília, tal como 
sugerem estudos de microdiálise reversa, em que a aplicação de dopamina tem uma acção 
excitatória sobre neurónios promotores da vigília do LC, inibindo o sono [15]. 
As aferências dopaminérgicas do LC provêm sobretudo da ATV, constituindo a via 
mesocerúlica, já documentada em vários estudos [18, 47, 69, 56]. O envolvimento da ATV na 
promoção da vigília em humanos é suportado pela evidência de que a ativação da ATV produz 
dessincronização electroencefalográfica cortical acompanhada por aumento do estado de 
alerta [17]. 
Tem sido proposto que os inibidores da recaptação de dopamina utilizados no tratamento da 
sonolência excessiva associada à narcolepsia, tais como o modafinil, levam à ativação do LC 
através da via mesocerúlica [66]. Um estudo em modelo animal [60] revelou que tanto os 
antagonistas dos neuroreceptores dopaminérgicos D1 como os D2 bloqueiam o efeito promotor 
da vigília de baixas doses do deste fármaco. No entanto, na presença de doses elevadas, 
apenas os antagonistas dos receptores D2 atenuam o seu efeito. Estes resultados sugerem 
que ambos os receptores dopaminérgicos são fundamentais para o efeito promotor de vigília 
deste fármaco, desempenhando os receptores D2 um papel mais preponderante. Os mesmos 
autores demonstraram recentemente o papel essencial dos receptores D2 na manutenção da 
vigília, sem no entanto interferirem na regulação homeostática do sono não-REM [61]. 
Existem duas famílias de receptores dopaminérgicos: os receptores D1-like que inclui os 
subtipos D1 e D5; e os receptores D2-like que inclui os subtipos D2, D3 e D4. Os subtipos D1 e 
D2 são os mais abundantes no sistema nervoso central. Estudos de quantificação do mRNA 
dos receptores dopaminérgicos efetuados em encéfalo de roedor revelam que existe um franco 
predomínio de receptores D2 a nível do LC [45, 76]. 
 
 
 
2. OBJETIVOS 
 
Estudo da localização imunohistoquímica dos neuroreceptores dopaminérgicos dos subtipos 
D1 e D2 (D1R e D2R) ao longo da extensão do LC humano e a nível intracelular 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 17 - 
3. MATERIAL E MÉTODOS 
3.1 Material 
Foram estudados 8 LC provenientes de 4 encéfalos de indivíduos adultos de ambos os sexos, 
sem deformação anatómica ou histológica aparente, sem antecedentes de doença neurológica 
conhecidos, obtidos por autópsia nas primeiras 48h pos-mortem, após consulta do Registo 
Nacional de Não Dadores (RENNDA), provenientes da Delegação de Lisboa do Instituto 
Nacional de Medicina Legal. 
Equipamento e reagentes 
 Contentores para armazenamento dos encéfalos 
 Paraformaldeído a 8% 
 Instrumentos de dissecção 
 Suporte em acrílico para normalização da posição do bloco anatómico 
 Parafina 
 Meio de inclusão 
 Peças de metal para molde de inclusão de parafina 
 Micrótomo Leica RM22555 
 Reagentes, material de laboratório e equipamento para histologia 
 Anticorpos primários: anticorpo policlonal criado em coelho anti-receptor dopaminérgico D1 
(D1DR (H-109): sc-14001®); anticorpo monoclonal criado em rato anti-receptor 
dopaminérgico D2 (D2DR (B-10): sc-5303®) 
 Anticorpos Secundários: anticorpo criado em caprino anti-IgG de coelho para os receptores 
D1 (Alexa Fluor® 568 goat anti-rabbit IgG (H+L) *2 mg⁄mL*); anticorpo criado em caprino 
anti-IgG de rato para os receptores D2 (Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (H+L) *2 
mg⁄mL*) – (ver tabela 2) 
 Computador com software adequado para arquivo e processamento digital de imagens e 
software para quantificação de imunofluorescência (Image J®) 
 Microscópio de Fluorescência Leica DM 2000, com câmara Leica DFC 420C 
 Microscópio Confocal Zeiss LSM 510 Meta ® 
 Frigorífico Electrolux e arca frigorífica Whirlpool 
 
Fluorocrómo 
do anticorpo 
secundário 
λ de 
excitação 
(nm) 
λ de 
emissão 
(nm) 
 
Filtro 
λ de 
excitação 
(nm) 
λ de 
emissão 
(nm) 
 
Cor 
 
Anticorpo 
primário 
Alexa Fluor 
488 
495 519 L5 440-520 497-557 Verde Anti-DR2 
Alexa Fluor 
568 
578 603 N2.1 515-560 590 Vermelho Anti-DR1 
Tabela 2 – Representação dos fluorocrómos utilizados para a marcação de D2R e D1R, respetivos filtros do 
microscópio de fluorescência Leica DM 2000 e cor com que são visualizados. Indicam-se também os comprimentos 
de onda (λ) de excitação e emissão dos fluorocrómos e respetivos filtros. 
NOTA: Utilizou-se o corante fluorescente DAPI para marcação do DNA nuclear, visível no filtro A, correspondente à luz 
azul (λ de excitação 358 nm e λ de emissão de 461 nm). 
 
 - 18 - 
3.2 Métodos 
3.2.1 Recolha e processamento das peças anatómicas 
 Obtenção dos encéfalos por autópsia de rotina, nas primeiras 48h após a morte; 
 Fixação dos encéfalos usando uma solução de paraformaldeído a 8%, durante um 
período entre 3 a 4 semanas; 
 Dissecção dos blocos anatómicos (troncos cerebrais), por secção do mesencéfalo, 
pedúnculos cerebelosos e bulbo raquidiano; 
 Medição das alturas das protuberâncias; 
 Colocação de agulhas transfixivas de referência. 
3.2.2 Processamento anatómico e histoquímico 
 Fixação definitiva do bloco durante mais de 48 horas em solução de formol e sucrose; 
 Processamento automático do bloco, que incluiu desidratação e saturação em parafina 
líquida; 
 Inclusão do bloco em parafina líquida num molde adequado, em posição referenciada e 
normalizada (de forma a que a linha média do TC e o pavimento do IV ventrículo sejam 
perpendiculares aos planos de corte) e solidificação por arrefecimento em ar ambiente; 
 Remoção do molde e das agulhas de referência e colocação do bloco na platina do 
micrótomo Leica RM22555; 
 Execução de cortes isotópicos seriados no micrótomo com a espessura de 5 μm 
perpendicularmente à linha média do TC e ao pavimento do IV ventrículo, ao longo de 
toda a protuberância. Em cada série de 500 µm (100 cortes) são colhidos 3 cortes 
uniformemente espaçados; 
 Marcação imunohistoquímica com fluorescência para D1R e D2R (vide protocolo de 
imunofluorescência*). 
 Caracterização da especificidade dos anticorpos: 
 Controlos negativos obtidos pela marcação imunohistoquímica das células do 
LC com omissão do anticorpo primário; 
 Controlos positivos obtidos pela marcação imunohistoquímica de tecido 
cerebral rico em receptores dopaminérgicos (estriado ventral – núcleo 
accumbens); 
 Controlo histológico e citológico para melhor visualização dos neurónios com 
neuromelanina, através da coloração de um corte histológico em cada série com 
hematoxilina. 
 
 
 
 
 - 19 - 
* Protocolo de Imunofluorescência 
Todos os reagentes foram equilibrados para a temperatura ambiente (20-25ºC) antes da 
imunomarcação e todas as incubações foram efectuadas à temperatura ambiente. 
 1. Desparafinização e reidratação 
 Desparafinização das lâminas colocando-as em 2 banhos de xilol limpo durante 5 
minutos cada; 
 Lavagem das lâminas num banho de acetona durante 5 minutos; 
 Lavagem sucessiva, durante 3 minutos, em: etanol absoluto (2 banhos), etanol 
95% (1 banho) e água destilada. 
2. Recuperação antigénica 
 Aquecimento de tampão citrato em banho-maria a 95-100C 
 Incubação das lâminas no recipiente com tampão durante 25 minutos; 
 Arrefecimento à temperatura ambiente durante 25 minutos o recipiente com o 
tampão 
 Lavagem das lâminas com solução tampão (PBS) durante 2 minutos. 
3. Bloqueio de ligações não específicas 
 Colocação das lâminas num banho de tampão limpo durante 2 minutos; 
 Remoção do excesso de tampão; 
 Delimitaçãodo tecido com a caneta hidrofóbica; 
 Incubação com Image-iT™ FX signal enhancer durante 30 min; 
 Decantação da mistura e lavagem 2x em PBS, durante 2 min cada; 
 Aplicação da solução de Bloqueio em quantidade suficiente para cobrir o tecido; 
 Incubação durante 15 minutos; 
4. Incubação com o anticorpo primário 
 Aplicação do anticorpo primário diluído a 1:200; 
 Incubação durante 60 minutos; 
 Lavagem 3x em PBS, durante 2 min cada. 
5. Incubação com o anticorpo secundário 
 Remoção do excesso de tampão e limpar as lâminas como anteriormente; 
 Aplicação do Anticorpo Secundário diluído 1:200; 
 Incubação durante 60 minutos; 
 Lavagem 3x em PBS, durante 2 min cada. 
6. Coloração 
 Aplicação da solução preparada do Fluorocrómo; 
 Incubação durante 30 minutos; 
 Protecção das lâminas da luz a partir deste passo; 
 Lavagem 3x em PBS, durante 2 min cada. 
7. Contra coloração 
 Imersão das lâminas num banho de Hematoxilina de Mayer (20-30 segundos); 
 Lavagem em banho de água destilada; 
 - 20 - 
 Banho das lâminas em água de amónia 1%. 
 Banho de água destilada durante 2-5 min; 
8. Montagem 
 Aplicação de ProLong® Gold + DAPI (4’6’-diamidino-2-fenilindol); 
 Colocação de lamela. 
 Armazenamento das lâminas em ambiente escuro entre - 20ºC e 4ºC 
 
3.2.3 Análise qualitativa da localização imunohistoquímica diferencial de D1R e D2R 
 Observação das lâminas histológicas ao microscópio de fluorescência óptica; 
 Análise da distribuição diferencial de D1R e D2R ao longo da extensão do núcleo, 
aferindo se existem regiões preferenciais de localização; 
 Análise dos compartimentos intracelulares em que se localizam os neuroreceptores; 
 Análise da co-localização dos neuroreceptores através da sobreposição de imagens 
obtidas no microscópio de fluorescência e observação da marcação imunohistoquímica 
ao microscópio confocal. 
3.2.4 Análise semiquantitativa de D1R e D2R 
 Semiquantificação da imunoreactividade observada para D1R e D2R no Image J 1.44®: 
 Um número de cortes histológicos, uniformemente espaçados, foram selecionados 
em cada LC estudado, de acordo com a qualidade da preservação histológica e 
qualidade da marcação imunohistoquímica; 
 As zonas de imunoreactividade foram identificadas e selecionadas para cada 
subtipo de receptor, nas ampliações de 200 – 400x; 
 
 Os resultados foram expressos em unidades arbitrárias de fluorescência. 
 Análise da distribuição da imunoreactividade observada para D1R e D2R ao longo da 
extensão craniocaudal em cada um dos LC estudados; 
 Representação da imunoreactividade diferencial para D1R e D2R para cada um dos LC 
estudados, em diagrama de extremos e quartis; 
 Em cada LC, os valores da imunoreactividade para ambos os subtipos D1R e D2R, 
foram submetidos ao teste de Wilcoxon (α <0,05), para comparar as diferenças. 
Para a análise qualitativa e semiquantitativa da distribuição de D1R e D2R cada LC (direito e 
esquerdo) foi considerado como um caso distinto. 
 
 
 
 - 21 - 
4. RESULTADOS 
 
Os 4 encéfalos estudados foram provenientes de indivíduos sem antecedentes de patologia 
neurologia conhecida, de ambos os sexos, com idades compreendidas entre 40 e 78 anos 
(tabela 3). 
Tronco Cerebral 
(TC) 
Idade 
(anos) 
Sexo Altura da protuberância 
(mm) 
Tempo de fixação 
(semanas) 
TC1 78 masculino 28 3 
TC2 40 feminino 30 4 
TC3 59 feminino 28 4 
TC4 57 masculino 26 3 
Tabela 3 – Dados demográficos dos indivíduos e respectivos tempos de fixação dos encéfalos. 
4.1 Especificidade dos anticorpos anti D1R e D2R 
A especificidade dos anticorpos primários anti-D1R e anti-D2R usados neste estudo já foi 
previamente caracterizada em estudos de Western Blotting, imunoprecipitação, 
imunohistoquímica e imunofluorescência [78, 79]. 
Neste estudo, para a determinação da especificidade dos anticorpos anti-receptores (D1R e 
D2R) utilizaram-se dois critérios: aplicação da marcação imunohistoquímica no núcleo 
accumbens humano, visto tratar-se de uma região do cérebro rica em D1R e D2R [76], 
funcionando como controlo positivo (fig.10); e a aplicação da marcação imunohistoquímica no 
LC humano com omissão do anticorpo primário, funcionando como controlo negativo (fig.11). 
 
 
 A B 
 
Figura 10 - Marcação imunohistoquímica com fluorescência de D2R e D1R (A e B, respetivamente) no núcleo 
accumbens humano. 
 
 
 
 
D2 D1 
1000x 1000x 
 - 22 - 
A B C 
Figura 11 - Marcação imunohistoquímica com fluorescência, com omissão do anticorpo primário para D2R e D1R nas 
células do LC humano. 
11A – Ausência de marcação para D2R; 11B – Ausência de marcação para D1R; 11C – Marcação do DNA nuclear 
com DAPI. 
 
Confirmou-se a presença de imunoreactividade no núcleo accumbens humano e a ausência de 
imunoreactividade nos controlos negativos da marcação imunohistoquímica do LC humano. 
Estes dados confirmam que a imunoreactividade obtida para D1R e D2R com os anticorpos 
utilizados é específica. 
 
4.2 Localização imunohistoquímica de D1R e D2R 
Verificou-se imunoreactividade para D2R na generalidade dos neurónios do LC, em toda a 
extensão crânio-caudal do núcleo. A nível intracelular, observou-se uma marcação com aspeto 
granulado fino a nível do citoplasma, da porção proximal dos prolongamentos dendríticos e da 
membrana citoplasmática. A marcação observa-se em extensas áreas de citoplasma, 
estendendo-se para além dos compartimentos citoplasmáticos contendo grânulos de 
neuromelanina e sendo a sua intensidade independente da presença dos grânulos de 
neuromelanina (fig. 12 e 13). 
Relativamente aos D1R, verificou-se uma marcação bastante mais esparsa comparativamente 
com os D2R. Na maioria dos cortes histológicos observados não se verificou qualquer 
imunoreactividade para D1R (fig. 12). As células do LC que exibem marcação para D1R são 
habitualmente neurónios com pouco conteúdo de grânulos de neuromelanina. A nível 
intracelular, a marcação aparece predominantemente a nível do citoplasma, aglomerada em 
compartimentos citoplasmáticos mais restritos, comparativamente com D2R (fig.13). Em alguns 
neurónios também se verificou marcação a nível da porção proximal dos prolongamentos 
dendríticos e a nível da membrana citoplasmática (fig. 16A). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
D2 D1 DAPI 
400x 400x 400x 
 - 23 - 
 
 
12A – LC 1 direito 
 
12B - LC 3 esquerdo 
 
12C - LC 2 esquerdo 
 
Figura 12 – Marcação imunohistoquímica com fluorescência das células do LC em cortes histológicos em que apenas 
se verificou marcação para D2R. 
Em cada caso ilustrado (A, B e C) apresenta-se sequencialmente da esquerda para a direita um corte histológico 
corado com hematoxilina e um corte histológico adjacente com marcação simultânea para D2R e D1R no filtro N5 (luz 
verde) para visualização de D2R e no filtro N2.1 (luz vermelha) para visualização de D1R. 
12A e 12B (ampliação 400x) – Os neurónios do LC exibem uma marcação com aspeto ponteado em extensas áreas de 
citoplasma, estendendo-se para além dos compartimentos contendo grânulos de neuromelanina (setas amarelas). 
12C (ampliação 200x) – Verifica-se imunoreactividade em todas as células do LC a nível do citoplasma e dos 
prolongamentos dendríticos (setas vermelhas). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hematoxilina 
Hematoxilina 
Hematoxilina 
D2R 
D2R 
D2R 
D1R 
D1R 
D1R 
400x 
400x 
200x 
400x 
400x 
200x 
400x 
400x 
200x 
 - 24 - 
 
 
13 A – LC 3 esquerdo 
 
13 B – LC 2 esquerdo 
 
13 C - LC 1 direito 
 
Figura 13 – Marcação imunohistoquímica com fluorescênciadas células do LC em cortes histológicos em que se 
verificou marcação para ambos os neuroreceptores de dopamina D2R e D1R. 
Em cada caso ilustrado (A, B e C) apresenta-se sequencialmente da esquerda para a direita um corte histológico 
corado com hematoxilina e um corte histológico adjacente com marcação simultânea para D2R e D1R no filtro N5 (luz 
verde) para visualização de D2R e no filtro N2.1 (luz vermelha) para visualização de D1R. 
12A e 12B (ampliação 200x) – Os D2R estão presentes na generalidade das células em áreas de citoplasma que se 
estendem para além dos compartimentos contendo grânulos de neuromelanina e também a nível dos prolongamentos 
dendrínticos (setas vermelhas); Os D1R estão presentes em células pobres em grânulos de neuromelanina em 
compartimentos citoplasmáticos mais restritos (setas verdes). 
12C (ampliação 400x) – Todas as células do LC exibem imunoreactividade para D2R; as células que exibem 
imunoreactividade para D1R são pobres em grânulos de neuromelanina (seta verde). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hematoxilina 
Hematoxilina 
Hematoxilina 
200x 
200x 
400x 
200x 
200x 
400x 
D2R 
D2R 
D2R D1R 
D1R 
D1R 
200x 
200x 
400x 
 - 25 - 
Nos 6 LC em que se procedeu à análise semiquantitativa dos neuroreceptores dopaminégicos 
(Fig.14) verificou-se que os D2R são significativamente mais abundantes que os D1R 
(p≤0,004). 
 
 
 p = 0,000 
 
 
 p = 0,002 
 
 
 p = 0,004 
 
Figura 14 – Representação gráfica em diagrama de extremos e quartis com caixa de bigodes do diferencial da 
imunoreactividade expressa em unidades arbitrárias de fluorescência para D2R (barra azul) e D1R (barra vermelha). 
Em cada par de LC (1, 2 e 3) foi analisado um dado número de cortes histológicos uniformemente espaçados ao longo 
da extensão cranio-caudal do núcleo (13, 9 e 8, respetivamente). Para comparar as medianas da imunoreactividade foi 
aplicado o teste de Wilcoxon, obtendo um resultado estatíticamente significativo (p value ≤0,004). 
LC 1 direito LC 1 esquerdo 
LC 2 direito LC 2 esquerdo 
LC 3 direito LC 3 esquerdo 
 - 26 - 
 
Analisando a distribuição ao longo da extensão crânio-caudal do núcleo com os dados da 
análise semiquantitativa confirma-se que os D2R estão presentes ao longo de todo o eixo 
crânio-caudal do LC, enquanto os D1R estão presentes de forma muito mais escassa. 
Verificou-se mais imunoreactividade para D2R na porção central do LC enquanto a 
imunoreactividade para D1R observou-se mais no terço superior do LC (fig. 15). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15 – Representação gráfica da imunoreactividade quantificada para D2R e D1R em unidades arbitrárias de 
fluorescência, ao longo da extensão cranio-caudal do núcleo. 
 
 
 
 
 
Relativamente à análise da co-localização dos neuroreceptores verifica-se que a maioria dos 
neurónios do LC expressa apenas um subtipo de neuroreceptor, no entanto alguns neurónios 
expressam ambos os subtipos (fig. 16 e 17). 
 
 
 
 
 
 
 
LC 1 direito 
LC 2 direito 
LC 3 direito 
LC 1 esquerdo 
LC 2 esquerdo 
LC 3 esquerdo 
Cranio-caudal 
 - 27 - 
 
 
 
16 A 
 
 
 
16 B 
Figura 16 – Análise da co-localização de D2R e D1R, através da sobreposição das imagens observadas ao 
microscópio de fluorescência, com o auxílio de um programa informático para processamento de imagens. 
16 A – Verifica-se imunoreactividade para D2R na generalidade dos neurónios, observando-se neurónios que co-
expressam D1R a nível do citoplasma e prolongamentos dendríticos (setas brancas). 
16 B – Observa-se um neurónio que expressa apenas D1R. 
 
Hematoxilina D2R 
D1R D2R + D1R 
400x 
400x 400x 
400x 
Hematoxilina D2R 
D1R D2R + D1R 
400x 400x 
400x 400x 
 - 28 - 
 
 A B 
 
Figura 17 – Imagem de marcação imunohistoquímica com fluorescência para D2R e D1R ao microscópio confocal. 
17 A - Neurónios do LC que expressam apenas D2R (seta amarela) ou D1R (seta vermelha). 
17 B - Neurónios do LC que expressam apenas D2R. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 29 - 
 
5. DISCUSSÃO 
A pertinência deste estudo surgiu na sequência do estudo previamente realizado [22] em que 
se concluiu que o LC humano é um núcleo mais longo do que previamente descrito. Tendo em 
conta que os circuitos neuroquímicos do LC em humanos estão ainda pouco estudados, 
avançou-se para o estudo do mapeamento de D1R e D2R no sentido de caracterizar a sua 
distribuição ao longo da extensão crânio-caudal do núcleo e a nível intracelular. 
Um dos principais achados foi a predominância significativa de D2R comparativamente com 
D1R. Este achado é consistente com os resultados de estudos em roedores, que revelam 
maior expressão de mRNA dos D2R a nível do LC [45, 76] e evidenciam um papel 
preponderante dos D2R na promoção da vigília comparativamente com os D1R [60]. 
A análise semiquantificada da imunoreactividade aplicada neste estudo tem alguns vieses, que 
se relacionam com os seguintes fatores: os cortes histológicos analisados foram escolhidos em 
função da sua integridade histológica e histoquímica; a análise foi efetuada nas ampliações 200 
– 400X, o que impossibilita a abrangência de toda a área axial do LC em cada plano; a 
imunoreactividade quantificada para cada um dos subtipos de neuroreceptor dopaminérgico é 
validada pelo observador. Neste contexto, a maior imunoreactividade global obtida para D2R 
ao nível da porção central do LC deve-se possivelmente ao fato de os neurónios se 
encontrarem mais concentrados nesta porção do núcleo [22]. 
A nível intracelular constatou-se uma distribuição predominante a nível citoplasmático para 
ambos os subtipos D2R e D1R, com pouca marcação a nível da membrana celular, verificando-
se para o caso dos D2R uma marcação extensa a nível do citoplasma que se sobrepõe aos 
compartimentos contendo grânulos de neuromelanina. 
Outros estudos já documentaram a localização predominantemente intracelular dos D2R [39, 
58, 75]. Um estudo com marcação imunocitoquímica revelou que na ausência de estimulação 
dopaminérgica, os D2R localizam-se em amplos compartimentos citoplasmáticos que 
correspondem sobretudo ao reticulo endoplasmático, com pouca contribuição do aparelho de 
Golgi ou de vesículas endossomáticas [58]. Estão descritas duas isoformas de D2R - a 
isoforma longa, D2Ra e a isoforma curta, D2Rb - que resultam de mecanismos de splicing 
alternativos do mRNA que alteram o tamanho da terceira loop citoplasmática do receptor. Os 
D2Rb localizam-se de forma difusa ao longo do toda a extensão do reticulo endoplasmático, 
enquanto os D2Ra encontram-se concentrados na região perinuclear [58]. A retenção dos 
DR2a no retículo endoplasmático induz a sua vacuolização, provavelmente induzida pela 
ativação da proteína G heterotrimérica ao qual estão acoplados, sendo plausível que os D2R 
desempenhem parte da sua função a nível intracelular [58]. Neste estudo, a razão para a fraca 
imunoreactividade verificada a nível da membrana celular não ficou completamente 
esclarecida; as etapas de fixação, permeabilização e incubação com o anticorpo per se não 
parecem ter influenciado, tendo-se colocado a hipótese da existência de um fator que 
prejudique o adequado acesso do anticorpo primário ao seu epitopo quando o receptor se 
localizaa nível membranar, tal como componentes da matriz extracelular [58]. 
 - 30 - 
O facto de se observar marcação também a nível dos grânulos de neuromelanina leva a crer 
que os receptores D2 localizam-se também a nível das membranas destes grânulos, nos 
neurónios do LC humano. Sabe-se que os grânulos de neuromelanina são organitos derivados 
da linha lisossómica que também contém algumas chaperonas moleculares derivadas do 
reticulo endoplasmático, tais como a calnexina [73]. 
Relativamente aos D1R, dados de imunocitoquímica em neurónios do córtex frontal em 
humanos saudáveis revelam que estes se localizam a nível citoplasmático e da membrana 
celular [39]. Um outro estudo em neurónios do córtex pré-frontal de macacos revela que os 
D1R se localizam sobretudo a nível do retículo endoplasmático, seguido do aparelho de Golgi e 
em vesículas localizadas na porção proximal dos prolongamentos dendríticos, bem como na 
membrana plasmática da porção distal das dendrites [51]. 
No presente estudo fica por esclarecer a escassa marcação obtida a nível da membrana 
citoplasmática, podendo estar relacionada com fatores já evocados acima noutros estudos. 
Para o reconhecimento preciso dos compartimentos intracelulares em que se localizam D1R e 
D2R nos neurónios do LC seria necessária a observação dos cortes histológicos em 
microscopia eletrónica ou aplicação de corantes adequados para a identificação dos organitos 
intracelulares em que se verificou marcação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 31 - 
 
6. CONCLUSÕES 
Os subtipos D1R e D2R revelaram um padrão distinto de distribuição ao longo da extensão do 
LC humano e a nível intracelular. 
Os D2R estão presentes na generalidade dos neurónios do LC, verificando-se uma marcação 
constante ao longo de todo o eixo cranio-caudal do núcleo, enquanto os D1R têm uma 
distribuição mais esparsa, verificada no terço superior do LC. 
A nível intracelular, ambos os subtipos de receptores dopaminérgicos se expressam a nível do 
citoplasma, prolongamentos dendríticos e membrana celular, no entanto com franco 
predomínio a nível intracitoplasmático. 
Os D2R localizam-se em amplas áreas do citoplasma, incluindo os compartimentos 
citoplasmáticos contendo grânulos de neuromelanina e nos prolongamentos dendríticos. Os 
D1R encontram-se sobretudo em células com pouco conteúdo de neuromelanina, localizando-
se em compartimentos citoplasmáticos mais restritos e também nos prolongamentos 
dendríticos. 
Habitualmente os neurónios expressam um só subtipo de neuroreceptor, sendo a co-
localização de ambos os neuroreceptores menos frequentemente observada. 
A análise semiquantitativa dos subtipos D2R/D1R confirmou que os D2R são significativamente 
mais abundantes (p≤0,004) no LC humano. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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