22_DIAGNOSTICO VIROLÓGICO

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Dr.Luis Carlos F. Carvalho
Depto. Patologia - UFMA
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Diagnóstico Laboratorial das Viroses
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 Diagnóstico Laboratorial das Viroses
 Introdução
 Isolamento e Identificação de Vírus
 Diagnóstico Sorológico das Infecções 
Virais
 Diagnóstico Molecular de Infecções 
Virais 
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Diagnóstico Laboratorial das Viroses 
 Introdução
 O diagnóstico de infecções virais é baseado em dois parâmetros:
 Isolamento e Identificação do vírus: 
 Através de sistemas vivos( cultura de células) nos quais os vírus são propagados.
 Detecção direta do vírus, antígenos e genomas virais.
 Sorologia: São utilizados métodos para detecção de anticorpos específicos, produzidos pelo hospedeiro em resposta à infecção viral.
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Isolamento e Identificação de vírus: 
A colheita do material deve ser feita na fase aguda da doença. 
 O material deve ser transportado imediatamente para o laboratório, mantido em temperatura baixa( gelo). No entanto, sem congelar. As partículas virais apresentam instabilidade a fatores ambientes.
 Quando o material for remetido para locais distantes, deve ser acondicionado em gelo seco. 
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Tipos de materiais indicados para exame virológico
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Inoculação experimental de vírus em sistemas hospedeiros
 Propagação de vírus em animais de laboratório
 Propagação de vírus em ovos embrionados
 Propagação de vírus em culturas de células
 Isolamento e Identificação de vírus: 
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Diagnóstico Laboratorial das Viroses
 Reação de Hemagluti-nação
Os vírus se ligam diretamente às hemácias formando agrupamentos visíveis.
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Diagnóstico Laboratorial das Viroses
 Reação de Hemadsorção
Uma suspensão de hemácias é adicionada à cultura e estas irão se ligar às proteínas virais expressas na superfície das células infectadas.
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 Finalidades
 Diagnosticar uma enfermidade causada por vírus.
 Identificar novos tipos de vírus isolados.
 Estudar epidemiologicamente o comportamento de uma virose numa dada comunidade.
Diagnóstico Laboratorial das Viroses
 Diagnóstico sorológico das infecções virais
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Diagnóstico Laboratorial das Viroses
 Teste de Neutralização 
Os vírus infecciosos quando interagem com o anticorpo específico são neutralizados e por conseguinte perdem a capacidade de infectar células permissivas
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Diagnóstico Laboratorial das Viroses
 Teste de Inibição da Hemaglutinação
A capacidade de hemaglutinação de um vírus é bloqueada quando esse vírus reage com o anticorpo específico
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 Teste de Fixação do Complemento
O complemento, um agente lítico, é fixado por um complexo Ag-Ac.
1ª fase: o Ac, Ag e o complemento são misturados e incubados.
2ª fase: O complexo formado por hemácia-Ac anti-hemácia é adicionado a mistura
Diagnóstico Laboratorial das Viroses
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Diagnóstico Laboratorial das Viroses
 Teste de Imunofluorescência Direta
Um conjugado de especificidade conhecida é adicinado as células infectadas por vírus que estão fixados numa lâmina de microscópio, ocorrendo formação de complexo Ag-Ac que é visualizado pela imunofluorescência
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 Teste de Imunofluorescência Indireta
1ª fase:Ac não marcados são adicionados a células infectadas fixadas a uma lâmina de microscópio. Após incubação, as lâminas são lavadas.
2ª fase:Um Ac imunoglobulina + fluoresceína é conjugado e visto a microscopia de fluorescência
Diagnóstico Laboratorial das Viroses
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 Teste de Aglutinação Passiva
Ag livres são agrupados com partículas carreadoras com Ac específicos
Diagnóstico Laboratorial das Viroses
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 Teste Imunoenzi-mático (ELISA)
Ac conjugados com enzimas.
O resultado é dado pela mudança de cor da reação.
Diagnóstico Laboratorial das Viroses
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 Immunoblotting - Western Blotting (WB)
Blotting significa transferência de DNA.
Separação das proteínas virais usando o método de eletroforese em gel.
Diagnóstico Laboratorial das Viroses
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Diagnóstico Laboratorial das Viroses 
 Diagnóstico Molecular de Infecções Virais
 Detecção Qualitativa do Ácido Nucléico Viral
 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
 Reação de Hibridização
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Diagnóstico laboratorial
Isolamento e identificação do vírus: alterações celulares na cultura.
Sorologia: presença de Acs.
Detecção direta do vírus, antígenos e genomas virais: ME, EIA para Ags, IF, WB, imunocitoquímica, técnicas de Biologia Molecular; identificação de inclusões celulares.
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Microscopia eletrônica
Adenovirus
Rotavirus
(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)
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Isolamento e identificação
Tipos de materiais indicados para propagação viral:
lavado de garganta
Aspirado de nasofaringe
Fezes
LCR
Swab retal
Biópsia cerebral
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Líquido de vesículas e pústulas
Raspado de úlceras ou crostas
Swab conjuntival
Sangue
Placenta
Urina recente
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Tipos de materiais a ser coletados para exame direto:
Aspirado de nasofaringe
Lavado de garganta
Biópsia cerebral
LCR
Biópsia de tecido cardíaco
Líquido pericárdico
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Líquido de vesícula ou pústula
Raspado de úlceras
Crostas
Esfregaço conjuntival
Soros
Fezes
Biópsia de tecido do feto
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Tipos de materiais indicados para exames virológicos post mortem:
Pulmão 
Swab traqueal
Sangue
Fígado
Baço
Líquido de vesículas
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Raspado de úlceras
Fezes
Swab de nasofaringe
Meninges
Cérebro
Medula espinhal
LCR
miocárdio
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Feto
Placenta
Líquido pleural
Rim
Líquido peritoneal
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Inoculação experimental
Cultura de células
Animais
Ovos embrionados
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Efeitos da propagação viral
Efeito citopático
Hemaglutinação 
Paralisia
Morte ou lesões degenerativas
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Left to Right: Cytopathic effect of HSV, enterovirus 71, and RSV in cell culture. Note the ballooning of cells in the cases of HSV and enterovirus 71. Note syncytia formation in the case of RSV. (Linda Stannard. University of Cape Town, Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital 
Efeitos citopáticos
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Animais de laboratório
Camundongo: arbovírus, vírus da raiva e alguns Coxsackievírus do grupo A.
Chimpanzés: vírus humanos (pesquisa)
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OVOS EMBRIONADOS
Vírus aviários
Vírus da influenza
Produção de vacinas
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Incubação: temperatura adequada, em torno de 62% de umidade.
Vias de inoculação: saco vitelino, cavidade amniótica, cavidade alantóica e membrana corioalantóica.
Obsevação da propagação: HA ou visualização de pocks na membrana corioalantóica.
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Cultura de células
Isolamento do vírus
Ensaios de infecciosidade
Estudos bioquímicos
Produção de vacinas e massa viral
	Podem ser animais ou humanas, primárias, diplóides ou heterodiplóides.
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Cultura de células
 
Cultura primária: cultura preparada diretamente de tecidos de um organismo, com ou sem passo inicial de fracionamento das células.
Cultura secundária: as células cultivadas foram retiradas de uma cultura primária, elas podem ser repetidamente subcultivadas desta forma, por semanas ou meses.
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 Linhagem de células
As células podem proliferar indefinidamente e poderão ser propagadas como uma linhagem de células;
 podem ser preparadas a partir de 
células cancerígenas
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 Linhagem de células
Tanto as linhagens de células transformadas quanto as de células não-transformadas são extremamente úteis na pesquisa celular, como fonte de grandes quantidades de células de um tipo uniforme;
As linhagens de células transformadas podem freqüentemente causar tumores, se injectadas num animal susceptível; 
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 Linhagem de células
A uniformidade genética de uma linhagem de células pode ser melhorada pela clonagemcelular, em que uma única célula é isolada e prolifera-se para formar posteriormente uma colónia; 
Podem ser armazenadas em azoto (N) líquido a - 196ºC, por um período muito longo e continuarem viáveis, quando descongeladas.
 
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Aplicações gerais da cultura celular
Produção de vacinas anti-virais;
Compreensão de fenómenos de neoplasia;
Estudo da Imunologia;
Ensaios de fármacos e cosméticos in vitro;
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Verificação da propagação viral:
Fenômeno citopático
Microscopia eletrônica
Interferência viral
Reação de hemaglutinação viral
Reação de hemadsorção
Reações sorológicas
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Identificação do vírus isolado – testes sorológicos
Teste de neutralização
Teste de inibição da hemaglutinação
Teste de fixação de complemento
Imunofluorescência direta e indireta
Aglutinação passiva
Teste de imunoperoxidase
Teste imunoenzimático
Immunoblotting
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Inibição da hemaglutinação
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Fixação de complemento
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Inibição da hemaglutinação
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Aglutinação passiva
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HEMAGLUTINAÇÃO
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Imunofluorescência direta
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Imunofluorescência
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Imunoperoxidase
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Imunoperoxidase
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ELISA
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ELISA
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ELISA
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ELISA
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ELISA
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WESTERN BLOTTING
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WESTERN BLOTTING
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WESTERN BLOTTING
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WESTERN BLOTTING
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WESTERN BLOTTING
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Immunoblotting
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Diagnóstico molecular
Detecção qualitativa:
PCR
Reação de hibridização
Southern blotting; northern blotting; dot blotting
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
Determinação da seqüência de ácido nucleico viral
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Southern blotting
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Western blotting
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Hibridização de ácidos nucleicos
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Diagnóstico molecular
Quantificação de ácido nucleico viral:
PCR
NASBA
Captura híbrida
bDNA
Indicador de prognóstico
Avaliação da resposta terapêutica
Avaliação do risco de transmissão viral
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Captura híbrida
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bDNA
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Sonda de Captura
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Sonda de Captura
Sonda
Preamp
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Sonda de Captura
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Superfície do poço
Sonda de Captura
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Target Probe *
Preamplifier *
Microwell
Target RNA
Capture
Probe
Microwell Capture Probe
Amplifier * with hybridized
Label Probes
* components containing Iso-C/Iso-G
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LIBERAÇÃO DO ÁCIDO NUCLEICO
ISOLAMENTO
AMPLIFICAÇÃO
(mimetiza a transcrição)
DETECÇÃO
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LEITURA
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LEITURA
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Diagnóstico molecular
Genotipagem:
Seqüenciamento
RFLP (polimorfismo de fragmentos de DNA em gel de agarose após eletroforese)
Southern blotting
Hibridização reversa - LiPA
DNA-EIA
SSCP (análise do polimorfismo da conformação de DNA fita simples)
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sequenciamento
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Dr.Luis Carlos F. Carvalho
Depto. Patologia - UFMA
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Quimioterapia antiviral
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Os agentes quimioterápicos antivirais podem ser divididos em 3 categorias:
Agentes que inativam diretamente o vírus (não apresentam valor terapêutico).
Agentes antivirais: inibem a replicação do vírus no nível celular, interrompendo um ou mais passos do ciclo de vida do vírus.
Imunomoduladores: podem alterar a resposta imune do hospedeiro.
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Limitações no uso de drogas antivirais
Efeitos colaterias
Pequeno espectro de atividade
Fase latente da infecção viral
Tratamento é efetivo somente 
no começo da infecção
Cepas de vírus resistentes às drogas
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Espectro de atividade dos mais utilizados compostos antivirais
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Análogos de nucleosídeos
Quando estes análogos de nucleosídeos são tri-fosforilados eles são incorporados na cadeia crescente do DNA e o alongamento da cadeia não pode mais acontecer devido a falta de um grupo 3’OH
que não é reconhecido pela polimerase.
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Mecanismo de ação dos principais compostos antivirais
As células apresentam as propriedades associadas à sua origem com por exemplo células nervosas estabelecem sinapse com outras, células derivadas do musculo esquelético contraem espontaneamente na placa de cultura Citar exemplos:
células derivadas do músculo esquelético embrionário fundem-se para formar fibras musculares gigantes, que contraem espontaneamente na placa de cultura; células nervosas lançam axônios que são electricamente excitáveis e fazem sinapse com outra célula nervosa;
células epiteliais que formam extensas lâminas com muitas das propriedades de um epitélio intacto.
Dadas as condições apropriadas a maior parte das células animais e vegetais poderão viver, multiplicar-se até mesmo expressar propriedades diferenciadas numa placa de cultura de tecidos. As células podem ser observadas num microscópio ou analisadas bioquimicamente e os efeitos da adição ou remoção de moléculas específicas, tais como hormonas ou factores d crescimento, podem ser explorados
Células da pele humana, por exemplo, duram por vários meses em cultura, dividindo-se apenas 50 a 100 vezes antes de morrerem. Tem sido sugerido que este limite de tempo de vida está relacionado com o limite de tempo de vida do animal do qual a célula se derivou.
Linhagem de células preparadas a partir de células cancerígenas diferem de várias formas das preparadas a partir de células normais.
Por exemplo, as linhagens de células cancerígenas frequentemente crescem sem se fixarem a uma superfície, proliferam em densidades muito mais altas em placas de cultura.
Uma das utilidades mais importantes de clonagem celular é o isolamento de linhagens de células mutantes com defeitos em genes específicos. O estudo de células defectivas em uma determinada proteína revela, frequentemente, um pouco da função desta proteína nas células normais.