Aula prática - Clonagem in silico

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AULA PRÁTICA: CLONAGEM IN SILICO 
 
 
Introdução: 
 
 O pDRAW é uma das inúmeras ferramentas de Bioinformática disponíveis para os 
biologistas moleculares. Ele permite realizar diversas tarefas, como: clonagem virtual de 
DNA; análise de sítios de restrição; busca por sítios específicos de metilação, anelamento de 
primers e corte por enzimas; pesquisa e tradução de Open Reading Frames (ORFs), cálculo de 
temperaturas de anelamento para PCR, geração de géis de agarose virtuais, entre outras. Ele 
pode ser baixado gratuitamente no site < http://www.acaclone.com/ >. 
 Nessa aula, o pDRAW será utilizado no planejamento de um experimento de 
clonagem gênica. Para isso, sequências de um vetor plasmidial (pUC19) e de um inserto 
(insulina humana) serão editadas e analisadas. 
 
Métodos: 
 
1) Abrir o programa pDRAW. 
 
Etapa 1: Edição do plasmídeo 
 
2) Adicionar a sequência do vetor pUC19 (M77789.2) 
File > New > Enter New Sequence 
 
3) Editar a sequência do vetor. 
Edit > DNA name, properties and annotations 
 
 Na guia DNA information: Nomear e caracterizar o plasmídio. 
 Na guia Annotation data: Nomear e caracterizar o plasmídio. 
- Origem de replicação (Origin): ORI / 852 a 1466 pb 
- Marca de seleção (Tick mark): AmpR 1626 a 2486 pb 
- OperonLAC (Promotor): LAC / 146 a 469 pb 
- Sítio múltiplo de clonagem (Insert): MCS / 233 a 284 pb 
 
Qual a importância de cada uma dessas regiões para o vetor de clonagem? 
 
4) Selecionar a(s) enzima(s) de restrição para a análise. 
Settings > Enzyme selection 
 
 Na guia Explicitly select: Observar o universo de enzimas disponível e suas 
respectivas possibilidades de corte. Selecionar algumas e visualizar o resultado 
(Clicar em Explicitly selected enzymes only; Apply, Ok). Desfazer as 
alterações (Clicar em Deselect all; Explicitly selected enzymes only; Apply, 
Ok). 
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO 
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA 
ÁREA DE GENÉTICA 
 Na guia Min / Max cuts: Alterar para o máximo de 1 corte e visualizar o 
resultado (Clicar em Explicitly selected enzymes only; Apply, Ok). Repetir o 
procedimento, delimitando a região para o MCS. 
 Por fim, selecione a enzima EcoRI. 
 
Por que EcoRI foi selecionada para a realização da clonagem? Na ausência 
desta, que outra(s) enzima(s) poderia(m) substituí-la? Por quê? 
 
5) Salvar a sequência. 
File > Save 
 
Etapa 2: Edição do inserto 
 
6) Adicionar a sequência da insulina humana (AH002844.1) 
File > New > Enter New Sequence 
 
7) Editar a sequência do vetor. 
Edit > DNA name, properties and annotations 
 
 Na guia DNA information: Nomear e caracterizar o inserto. 
 Na guia Annotation data: Nomear e caracterizar o inserto. 
 
8) Selecionar a enzima de restrição para análise. 
Settings > Enzyme selection 
 
 Na guia Explicitly select: Selecionar EcoRI. 
 
Quantos sítios de restrição para EcoRI existem nessa sequência? Quantos 
sítios essa sequência deveria apresentar para EcoRI? Onde? Por quê? 
 
9) Adicionando sítios de restrição para a enzima EcoRI no inserto (5’- GAATTC -3’). 
Edit > Edit sequence 
 
10) Salvar a sequência. 
File > Save 
 
Etapa 3: Clonagem das sequências 
 
11) Adicionar as sequências. 
 File > New > Cloning of sequences 
 
 Na guia First fragment: Importar o fragmento pUC19 editado e selecionar os 
sítios de restrição para a clonagem (EcoRI; position 284; DNA is circular). 
NÃO pressionar OK! 
 Na guia Second fragment: Importar o fragmento da insulina editado e 
selecionar os sítios de restrição para a clonagem (EcoRI; 5’ position 1; 3’ 
position 340). Pressionar OK. 
 
Onde ocorreu a inserção da insulina no vetor? Qual a consequência fenotípica 
para as bactérias que irão receber esse constructo? 
 
Etapa 4: Simulação de uma corrida eletroforética 
 
Qual o critério para a seleção da enzima usada na digestão do híbrido 
vetor+inserto, para verificar o resultado final da clonagem via gel de agarose? 
 
12) Selecionar as enzimas capazes de diferenciar o vetor religado do vetor + inserto. 
Selecione também EcoRI. 
Settings > Enzyme selection (Selecionar as enzimas; Clicar em Explicitly selected 
enzymes only; Apply, Ok) 
 
13) Visualizar o padrão de fragmentos da digestão no gel de eletroforese. 
View > Agarose Gel Electrophoresis (Clicar em Show bp) 
 
Como você interpreta o resultado? O que aconteceria se o DNA extraído 
contivesse apenas o plasmídeo?