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AULA PRÁTICA: CLONAGEM IN SILICO Introdução: O pDRAW é uma das inúmeras ferramentas de Bioinformática disponíveis para os biologistas moleculares. Ele permite realizar diversas tarefas, como: clonagem virtual de DNA; análise de sítios de restrição; busca por sítios específicos de metilação, anelamento de primers e corte por enzimas; pesquisa e tradução de Open Reading Frames (ORFs), cálculo de temperaturas de anelamento para PCR, geração de géis de agarose virtuais, entre outras. Ele pode ser baixado gratuitamente no site < http://www.acaclone.com/ >. Nessa aula, o pDRAW será utilizado no planejamento de um experimento de clonagem gênica. Para isso, sequências de um vetor plasmidial (pUC19) e de um inserto (insulina humana) serão editadas e analisadas. Métodos: 1) Abrir o programa pDRAW. Etapa 1: Edição do plasmídeo 2) Adicionar a sequência do vetor pUC19 (M77789.2) File > New > Enter New Sequence 3) Editar a sequência do vetor. Edit > DNA name, properties and annotations Na guia DNA information: Nomear e caracterizar o plasmídio. Na guia Annotation data: Nomear e caracterizar o plasmídio. - Origem de replicação (Origin): ORI / 852 a 1466 pb - Marca de seleção (Tick mark): AmpR 1626 a 2486 pb - OperonLAC (Promotor): LAC / 146 a 469 pb - Sítio múltiplo de clonagem (Insert): MCS / 233 a 284 pb Qual a importância de cada uma dessas regiões para o vetor de clonagem? 4) Selecionar a(s) enzima(s) de restrição para a análise. Settings > Enzyme selection Na guia Explicitly select: Observar o universo de enzimas disponível e suas respectivas possibilidades de corte. Selecionar algumas e visualizar o resultado (Clicar em Explicitly selected enzymes only; Apply, Ok). Desfazer as alterações (Clicar em Deselect all; Explicitly selected enzymes only; Apply, Ok). UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA ÁREA DE GENÉTICA Na guia Min / Max cuts: Alterar para o máximo de 1 corte e visualizar o resultado (Clicar em Explicitly selected enzymes only; Apply, Ok). Repetir o procedimento, delimitando a região para o MCS. Por fim, selecione a enzima EcoRI. Por que EcoRI foi selecionada para a realização da clonagem? Na ausência desta, que outra(s) enzima(s) poderia(m) substituí-la? Por quê? 5) Salvar a sequência. File > Save Etapa 2: Edição do inserto 6) Adicionar a sequência da insulina humana (AH002844.1) File > New > Enter New Sequence 7) Editar a sequência do vetor. Edit > DNA name, properties and annotations Na guia DNA information: Nomear e caracterizar o inserto. Na guia Annotation data: Nomear e caracterizar o inserto. 8) Selecionar a enzima de restrição para análise. Settings > Enzyme selection Na guia Explicitly select: Selecionar EcoRI. Quantos sítios de restrição para EcoRI existem nessa sequência? Quantos sítios essa sequência deveria apresentar para EcoRI? Onde? Por quê? 9) Adicionando sítios de restrição para a enzima EcoRI no inserto (5’- GAATTC -3’). Edit > Edit sequence 10) Salvar a sequência. File > Save Etapa 3: Clonagem das sequências 11) Adicionar as sequências. File > New > Cloning of sequences Na guia First fragment: Importar o fragmento pUC19 editado e selecionar os sítios de restrição para a clonagem (EcoRI; position 284; DNA is circular). NÃO pressionar OK! Na guia Second fragment: Importar o fragmento da insulina editado e selecionar os sítios de restrição para a clonagem (EcoRI; 5’ position 1; 3’ position 340). Pressionar OK. Onde ocorreu a inserção da insulina no vetor? Qual a consequência fenotípica para as bactérias que irão receber esse constructo? Etapa 4: Simulação de uma corrida eletroforética Qual o critério para a seleção da enzima usada na digestão do híbrido vetor+inserto, para verificar o resultado final da clonagem via gel de agarose? 12) Selecionar as enzimas capazes de diferenciar o vetor religado do vetor + inserto. Selecione também EcoRI. Settings > Enzyme selection (Selecionar as enzimas; Clicar em Explicitly selected enzymes only; Apply, Ok) 13) Visualizar o padrão de fragmentos da digestão no gel de eletroforese. View > Agarose Gel Electrophoresis (Clicar em Show bp) Como você interpreta o resultado? O que aconteceria se o DNA extraído contivesse apenas o plasmídeo?
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