CICLO DOS ÁCIDOS TRICARBOXÍLICOS

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O Ciclo de Krebs
	 Maior via de produção de energia
  
  A completa oxidação do Piruvato a CO2 inicia com a conversão do Piruvato a Acetil-CoA com redução do NAD+.
 
  Todas as enzimas são mitocondriais e estão em estreita proximidade com as enzimas da cadeia respiratória.
 
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  Metabólitos alimentam o ciclo com Acetil-CoA e são oxidados para produzir energia.
	
  Elétrons são transferidos do ciclo para o NAD+ e FAD e passados ao O2 pela cadeia transportadora de elétrons.
 
  ATP é gerado pelo processo de fosforilação oxidativa.
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OXIDAÇÃO DO PIRUVATO A ACETIL-CoA 
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	  Não faz parte do TCA mas é obrigatória para a entrada dos carboidratos no ciclo.
	 
  Reação irreversível nos tecidos animais por ter um ∆G’ muito negativo. (∆G’ = -8,0 Kcal/mol)
					
	 Razão pela qual os ácidos graxos não podem ser convertidos em açúcar.
 
	
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	  Complexo da piruvato desidrogenase
	 E1= piruvato desidrogenase, (24 subunidades)
	 E2= dihidrolipoil transacetilase, (24 subunidades)
	 E3= dihidrolipoil desidrogenase, (12 subunidades
 
	  5 vitaminas são necessárias para formação de Acetil-CoA:
		  TPP – Tiamina Pirofosfato
  Ácido Lipóico
	  FAD – Riboflavina
	  CoA-SH – Ácido Pantotênico
	  NAD - Ácido Nicotínico
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  REGULAÇÃO DO COMPLEXO PIRUVATO DESIDROGENASE
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Lesão bioquímica
Avitaminose B1 (beri-beri)
Deficiência de
Vit. B1
Deficiência de TPP
Aumento da conc. de
Ác. pirúvico e ác. lático
no sangue.
Inibição da 1a
fase da descarboxilação
do Ácido pirúvico.
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 REAÇÕES DO CICLO DE KREBS
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 CITRATO CINTASE
	 Reação exergônica – expontânea em direção ao citrato 
	 Energia proveniente da hidrólise da ligação Tioéster–CoA 
	 Citrato – 1º intermediário do TCA  é a etapa limitante do ciclo 
	 A velocidade é determinada pela disponibilidade de Acetil-CoA e Oxaloacetato, é inibida por Succinil-CoA.
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ACONITASE 
	 Requer Ferro (Fe++) 
	 Requer um agente redutor (Glutation ou Cisteina) 
	Isomerização do Citrato a Isocitrato  
	Citrato é um substrato pobre para oxidação 
	Então aconitase isomeriza citrato para produzir isocitrato que tem um –OH secundário, o qual pode ser oxidado
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ISOCITRATO DESIDROGENASE 
	 Requer especificamente NAD+ ou NADP+ 
	 É fortemente inibida por NADH e ATP 
	 A forma mitocondrial é acentuadamente ativada pelo ADP (reduz o KM para o isocitrato) 
	 Descarboxilação Oxidativa do isocitrato produz α-cetoglutarato 
	 O primeiro CO2 e NADH + H+ são produzidos 
	 Requer Mn++ ou Mg+ 
	 O ∆G’ = -5 Kcal/mol desloca o equilíbrio no sentido do α-cetoglutarato
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α-CETOGLUTARATO DESIDROGENASE
	 Reação similarmente idêntica ao Complexo Piruvato Desidrogenase. 
	 5 coenzimas usadas TPP, CoASH, ácido Lipóico, NAD+, FAD. 
	 O segundo CO2 e NADH + H+ são formados
	 ATP, GTP, NADH e Succinil-CoA inibem o complexo
 
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SUCCINIL-CoA SINTASE
 
	 Específica para o GDP 
	 GTP + ADP → ATP + GDP
	 A produção do GTP é um exemplo de fosforilação a nível de substrato 
	 Sua síntese é dirigida pela hidrólise de um éster de CoA 
	 O Succinil-CoA representa um ponto de ramificação metabólica → intermediários podem entrar e sair do Ciclo
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SUCCINATO DESIDROGENASE
	 Uma oxidação envolvendo FAD – é exemplo de proteína com centros de Ferro-Enxofre (Fe+2↔Fe+3) 
	A enzima é fortemente ligada à membrana interna mitocondrial 
	 É específica para o FAD
	Esta enzima é atualmente parte da via de transporte de elétrons na membrana mitocondrial interna 
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	Os elétrons transferidos do succinato p/ FAD (p/ formar FADH2) são passados diretamente a ubiquinona (UQ) na via de transporte de elétrons 
 
	Enzima inibida pelo malonato e oxaloacetato e ativada por ATP, Pi e Succinato
	O malonato é usado como um eficiente inibidor do TCA experimentalmente
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FUMARASE
 
	 Exibe especificidade absoluta para o trans-insaturado
 
	 Hidratação através da ligação dupla 
	 
	 adição-trans de elementos da água através da ligação Dupla 
	 Reação estereoespecífica
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MALATO DESIDROGENASE 
	 A Malato Desidrogenase é estereoespecífica para o L-esterioisômero. 
	 Uma oxidação dependente de NAD+
	 O carbono que será oxidado é o que também recebe o -OH na reação prévia 
	 Esta reação é dispendiosa energéticamente  
	 ΔGo' = +30 kJ/mol (+7.1 Kcal/mol) – o equilíbrio é deslocado em direção ao malato
	 A reação da citrato sintase puxa o equilíbrio em direção ao oxaloacetato, completa o ciclo. 
	
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	  Numa volta completa do TCA são formados:
		  2CO2 e 2H2O 
		  3 NADH + 3H+ 
		  1 FADH2.
		  1 GTP  fosforilação a nível de substrato	 
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	  Durante a oxidação completa da glicose a CO2 e H2O são produzidos:
		 2 moléculas de ATP (Glicólise)
		 2 NADH + 2H+ (Glicólise)
		 6 NADH + 6H+ (TCA) 
		 2 FADH2 (TCA)
		 2 ATP
		 2 NADH + 2H+ (Piruvato  AcetilCoA)
		  Cada NADH + H+ origina 3ATP e 3H2O 
		  Cada FADH2 origina 2ATP e 2H2O 
	
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	  Rendimento líquido de ATP durante a oxidação completa da Glicose a CO2 e H2O 
		  10 NADH + 10H+ x 3ATP = 30 ATP
		  2 FADH2 x 2ATP 		= 4 ATP
		  4ATP				= 4ATP
					TOTAL = 38 ATP
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Natureza Anfibólica do Ciclo
	  TCA funciona no catabolismo e fornecendo intermediários para as vias anabólicas:
		 -cetoglutarato Síntese dos aminoácidos
		 Oxaloacetato Aspártico e Glutâmico
		 Citrato  Síntese dos ácidos graxos
		 Succinil-CoA  Síntese do HEME
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CONTROLE DO CICLO 
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	Relação entre o estado metabólico de uma célula e o ATP/ADP e NADH/NAD+
	 Células em repouso: usam pouca energia
	  ATP e  ADP  Relação ATP/ADP  1
	  NADH e  NAD+  Relação NADH/NAD+  1 
 
	 Sinal para desligar as enzimas responsáveis para gerar energia.
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	 Células em estado metabólico ativo 
	 usam muita energia
	 ATP e  ADP  Relação ATP/ADP  1
  NADH e  NAD+  Relação NADH/NAD+  1 
 Liga enzimas responsáveis para gerar 	 energia
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TRANSPORTE DE ELÉTRONS
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Transporte de Elétrons
	 O transporte de elétrons constitui a principal origem das atividades celulares
	 A cadeia de transporte de elétrons exibe duas características notáveis:
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	  Várias etapas na transferência de elétrons sugere liberação parcelada de energia
  Os íons H+ são absorvidos e liberados em alguns passos, sugerindo que as trocas de prótons estão envolvidas na conservação de energia
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	Na membrana mitocondrial interna, estão localizados os três complexos proteicos que formam a cadeia respiratória: 
	NADH-desidrogenase
	Complexo citocromo b-c1
	Citocromo oxidase
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 Entre esses, as moléculas Ubiquinona e Cit. C.
  Nessa membrana está também a ATP-sintase
  A fosforilação do ADP está acoplada à respiração como um mecanismo de recuperação de energia
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COMPONENTES DA CADEIA RESPIRATÓRIA
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Os elétrons fluem do menor para o maior potencial de redução
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Complexo I (NADH-CoQ redutase)
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Complexo I
	 Formado por 26 cadeias polipeptídicas
  Grupos prostéticos
	 Flavina mononucleotídeo (FMN)
		  Capaz de receber 2 prótons e 2 elétrons
	  Reduzido a forma FMNH2 por NADH
  6 ou 7 centros Ferro – Enxofre
		  Capazes de transportar elétrons
	 	  Fe+3 para Fe+2
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 É uma das três reações responsáveis pelo bombeamento de H+  Gera um gradiente de H+ 
	  NADH + H+ + CoQNAD+ + CoQH2
	 				 G’ = -19,4 Kcal/mol
		Libera energia suficiente para fosforilar o ADP a ATP
					
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Complexo II (Succinato-CoQ redutase)
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	  Succinato desidrogenase
 		  Enzima da membrana interna mitocondrial
		  Ciclo do ácido cítrico
		  Succinato oxidado à Fumarato
		  Redução de FAD (grupo prostético) à 		 FADH2
			  Transporte de 2 prótons e 2 elétrons
		
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		 Centros Fe-S e citocromo b560
 	  Transporte de elétrons
			  Prótons voltam a matriz
			  Não há contribuição para a formação 		 de gradiente de prótons
		  Go’ Succinato  CoQ é pequeno
 		  Complexo II não atinge parte externa da 	 membrana interna
		 G’ = -3,2 Kcal/mol  não é suficiente para 			 	 fosforilar o ADP a ATP
	
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Coenzima Q ou ubiquinona
Molécula hidrofóbica
Mobilidade na membrana
 2 Prótons e 2 elétrons
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CoQ Como Ponto de Convergência dos Elétrons
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Citocromos
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Citocromos
	  Transportadores de elétrons
			  Grupo heme (Ferro)
			  Fe+2 Fe+3
 			  Membrana interna mitocôndria
 		  Membrana Retículo Endoplasmático
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Complexo III – CoQ-citocromo c redutase
	  Componentes do Ciclo Q
 		  Citocromo b562 e b566
		  Centro Fe-S
 		  Citocromo c1
	  CoQ
 		  Traz elétrons dos Complexos I e II ao III
	  Citocromo c
 		  Proteína periférica que transporta elétrons do
		 complexo III para o IV
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	  Transfere elétrons da CoQ para Cit c1
	 
	  Parte integrante da membrana mit. 	 	 Interna
	  Ocorre bombeaamento de H+
		 
	  G’ = -8,2 Kcal/mol  libera energia 	suficiente para fosforilar o ADP a ATP
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Complexo IV – Citocromo c oxidase
	  Componentes
		  Citocromo c
		  3 íons cobre divididos em dois grupos
			 CuA/CuA
			 CuB
 				  Forma oxidada – Cu+2 cúprica
				  Forma reduzida – Cu+ cuprosa
		  Heme a a3 
	  Sítio catalítico da enzima
 		  CuB e citocromo a3 (Fe+3  Fe+2 )
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	  É parte integrante da membrana mitocondrial interna
	  Ocorre bombeamento de H+ 
 	  G’ = -26,3 Kcal/mol  libera energia 	suficiente para fosforilar o ADP a ATP
	  O2 é o aceptor final de elétrons
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Transferência de elétrons no complexo IV
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Formas Reativas de Oxigênio
	  Radicais livres
		  Íons de oxigênio não reduzidos completamente
		  Superóxido – O2-
 		  Peróxido – O2-2
 		  Peróxido de hidrogênio – H2O2
	  Estratégias de defesa
		  Enzima Superóxido dismutase
		 2 O2- + 2 H+ O2 + H2O2
		  Enzima Catalase
		 2H2O2 O2 + 2H2O
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Inibidores da Cadeia Respiratória
	NADH  Q  Citb  Citc1  Citc  Cit(a + a3)  O2 
 
	 Rotenona/Amital
	NADH  Q  Citb  Citc1  Citc  Cit(a + a3)  O2 
 
			 Antimicina A		 Cianeto/Co/Azida Sódica
 	NADH  Q  Citb  Citc1  Citc  Cit(a + a3)  O2 
 
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FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA
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	  A fosforilação do ADP está acoplada à respiração aeróbica como um mecanismo para recuperação de energia
	Relação P/O = 3 para o NADH
	Relação P/O = 2 para o FADH2
	
	  A mitocondria é o centro da fosforilação
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Acoplamento da fosforilação e o transporte de elétrons
  O transporte de elétrons do NADH para o O2 é a fonte de energia usada para fosforilar o ADP
	  A fosforilação de cada mol de ADP necessita de 7,3 Kcal.
		
 
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O gradiente eletroquímico de prótons gerado durante o Transporte de elétrons é usado para a síntese de ATP através do complexo ATP-sintase
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Energia liberada durante o transporte de elétrons do NADH até o O2
 
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AGENTES QUE INTERFEREM COM A FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA
	 Desacopladores:
	  m-clorocarbonilocianetofenilo-hidrazona 	(CCP)
	  carboxicianeto-4-(trifluorometoxi)- 	fenilhidrazona (FCCP)
	  2,4-dinitrofenol (DNP)
	  Valinomicina
	  Proteína desacopladora (termogenina)
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Inibidores e Desacopladores
	
	Inibidores:
 Impedem tanto o transporte de elétrons como a fosforilação oxidativa.
	Desacopladores:
	Estimulam o transporte de elétrons mas impedem a fosforilação oxidativa.
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Papel do ADP
1.5 mmol ADP
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Consumo de Oxigenio pelas Mitocondrias
carboxicianeto-4-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona (FCCP
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ADP e Pi são substratos para a ATP-Sintase 
	Succinato é o substrato da Succinato Desidrogenase
	Cianeto (CN-) é uma droga que inibe a Citocromo Oxidase (inibe o transporte de elétrons)
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	 Venturicidina, Oligomicina inibem o Complexo Fo (inibem a ATP-Sintase)
 
	 DNP é um carreador de prótons hidrofóbicos (desacoplam a fosforilação do transporte de elétrons)
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Aproveitamento do NADH gerado na glicólise 
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