Árvores Filogenéticas utilizando o MEGA - Manual MEGA Profº Anderson Alvarenga Pereira

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TEORIA	
  E	
  PRÁTICA	
  DA	
  SISTEMÁTICA	
  FILOGENÉTICA	
  –	
  BCA506	
  	
  PROF.	
  ANDERSON	
  ALVARENGA	
  PEREIRA	
  	
  	
  
CONSTRUÇÃO	
  E	
  INTERPRETAÇÃO	
  DE	
  ÁRVORES	
  FILOGENÉTICAS	
  
UTILIZANDO	
  O	
  MEGA	
  
	
  
	
  
Resumo:	
  
	
  Evolução	
   pode	
   ser	
   definida	
   diferentemente	
   sob	
   diversos	
   contextos.	
   Pode	
   ser	
  definido	
  como	
  variações	
  no	
  pool	
  de	
  genes	
  de	
  uma	
  população,	
  como	
  mudanças	
  no	
  material	
  genético	
  e	
  passado	
  para	
  prole,	
  como	
  o	
  desenvolvimento	
  de	
  uma	
  forma	
  biológica	
   a	
   partir	
   de	
   uma	
   pré	
   existente	
   devido	
   à	
   ação	
   de	
   seleção	
   natural	
   nas	
  mutações.	
  Uma	
  das	
  forças	
  que	
  direcionam	
  a	
  evolução	
  é	
  a	
  seleção	
  natural,	
  na	
  qual	
  “unidades”	
  mutantes	
  serão	
  eliminadas	
  ou	
  fixadas	
  em	
  uma	
  população	
  de	
  acordo	
  com	
  o	
  ambiente	
  ou	
  condições	
  de	
  reprodução,	
  que	
  seleciona	
  a	
  sobrevivência	
  do	
  mais	
  adaptado.	
  Filogenética	
  é	
  o	
  estudo	
  da	
  história	
  evolucionária	
  dos	
  organismos	
  vivos	
  (e	
  alguns	
  “não	
   vivos”)	
   utilizando	
   diagramas	
   em	
   foma	
   de	
   arvore	
   que	
   representa	
   os	
  organismos.	
   Uma	
   filogenia	
   ou	
   arvore	
   filogenética	
   é	
   uma	
   representação	
   das	
  relações	
   genealógicas	
   entre	
   as	
   espécies,	
   entre	
   os	
   genes,	
   entre	
   populações	
   ou	
  mesmo	
   entre	
   indivíduos	
   da	
   mesma	
   espécie.	
   Essa	
   análise	
   pode	
   ser	
   realizada	
  utilizando	
  diversas	
   informações	
   sobre	
  o	
  organismo,	
   como	
  utilização	
  de	
   fósseis,	
  características	
   morfológicas,	
   bioquímicas	
   e	
   o	
   material	
   genético.	
   Com	
   a	
  disponibilização	
   do	
   sequenciamento	
   das	
   macromoléculas,	
   o	
   uso	
   do	
   material	
  genético	
  se	
  tornou	
  difundido	
  e	
  é	
  atualmente	
  o	
  mais	
  utilizado	
  para	
  determinar	
  as	
  relações	
  entre	
  os	
  organismos.	
  Para	
   realizar	
   uma	
   análise	
   filogenética	
   são	
   necessários	
   5	
   passos:	
   primeiro,	
  escolher	
   um	
   marcador	
   genético.	
   Segundo,	
   realizar	
   um	
   alinhamento	
   múltiplo.	
  Terceiro,	
  escolher	
  o	
  critério	
  e	
  o	
  modelo	
  evolutivo.	
  Quarto,	
  determinar	
  o	
  método	
  de	
   reconstrução	
   filogenética.	
   Quinto,	
   verificar	
   a	
   sustentabilidade	
   da	
   topologia	
  com	
  testes	
  estatísticos.	
  Por	
  ser	
  uma	
  inferência,	
  a	
  análise	
  filogenética	
  não	
  garante	
  a	
  topologia	
  correta	
  para	
  os	
  dados,	
  por	
  isso	
  se	
  faz	
  necessário	
  a	
  utilização	
  de	
  testes	
  estatísticos	
  para	
  sustentabilidade	
  de	
  topologia	
  como	
  o	
  índice	
  de	
  decaimento	
  e	
  o	
  Bootstrap.	
  Diversos	
  modelos	
  matemáticos	
  foram	
  desenvolvidos	
  para	
  representar	
  de	
  forma	
  realista	
   as	
   relações	
   entre	
   os	
  diversos	
   tipos	
  de	
  mutações	
   e	
   as	
   relações	
   entre	
   os	
  táxons	
   de	
   uma	
   topologia.	
   Os	
   critérios	
   para	
   análise	
   filogenética	
   são:	
   Máxima	
  Parcimônia	
   (	
   baseia-­‐se	
   na	
   reconstrução	
   das	
   topologias	
   no	
   menor	
   numero	
   de	
  “passos”,	
   ou	
   seja,	
   encontrando	
   o	
   caminho	
   mais	
   parcimonioso,	
   com	
   menor	
  número	
   de	
  mudanças),	
   Máxima	
   verossimilhança	
   (	
   embasado	
   na	
   probabilidade	
  condicional,	
   onde	
   a	
   melhor	
   topologia	
   é	
   aquela	
   que	
   maximiza	
   uma	
   função	
   de	
  probabilidade	
  de	
   f(dados|modelo),	
  onde	
  encontra	
  a	
   topologia	
  mais	
  provável	
  de	
  acordo	
   com	
   um	
   modelo	
   evolutivo),	
   Distância	
   (onde	
   são	
   calculadas	
   todas	
   as	
  “distâncias”	
  entre	
  as	
  sequências	
  de	
  acordo	
  com	
  modelos	
  evolutivos)	
  e	
  Bayesiano	
  (baseado	
   na	
   probabilidade	
   bayesiana,	
   onde	
   a	
   probabilidade	
   a	
   priori	
   pode	
   ser	
  introduzido	
  no	
  cálculo	
  da	
  melhor	
  arvore).	
  
Diversos	
   programas	
   foram	
   desenvolvidos	
   com	
   os	
   algorítimos	
   filogenéticos.	
   O	
  PAUP*	
   é	
   um	
   dos	
   mais	
   completos	
   e	
   abrange	
   os	
   3	
   critérios	
   (Distância,	
  Verossimilhança	
   e	
   Parcimônia),	
   entretanto	
   o	
   programa	
   é	
   comercializado.	
   O	
  Phyml	
   realiza	
   análises	
   por	
  máxima	
   verossimilhança.	
   O	
   Phylip	
   permite	
   análises	
  utilizando	
   modelos	
   de	
   distância	
   e	
   verossimilhança.	
   Por	
   motivos	
   didáticos,	
   foi	
  escolhido	
  o	
  MEGA	
  para	
  a	
   realização	
  das	
  aulas	
  práticas,	
  visto	
  que	
  os	
  programas	
  anteriores	
  não	
  possuem	
  interface	
  amigável	
  ao	
  usuário.	
  Utilizaremos	
  a	
  versão	
  4,	
  pois	
  a	
  versão	
  5	
  ainda	
  é	
  beta	
  (versão	
  de	
  teste,	
  possivelmente	
  com	
  BUGs)	
  Para	
  iniciar	
  o	
  programa	
  clique	
  2	
  vezes	
  no	
  ícone:	
  	
  	
  
	
  	
  	
  O	
  primeiro	
  passo	
  a	
  ser	
  feito	
  é	
  converter	
  o	
  seu	
  arquivo	
  de	
  alinhamento	
  n	
  formato	
  FASTA	
  para	
  o	
  formato	
  MEGA.	
  Para	
  isso	
  clique	
  em	
  FILE	
  e	
  depois	
  em	
  CONVERT	
  TO	
  MEGA	
  FORMAT.	
  Uma	
   janela	
   irá	
   se	
   abrir	
   onde	
   irá	
  navegar	
   até	
   o	
   seu	
   arquivo.	
  O	
  arquivo	
  irá	
  ser	
  gerado	
  na	
  janela	
  que	
  foi	
  aberta.	
  Salve	
  o	
  seu	
  arquivo	
  em	
  formato	
  mega	
  e	
  feche	
  a	
  janela.	
  	
  
	
  	
  Novamente	
  vá	
  em	
  FILE,	
  depois	
  em	
  OPEN.	
  Uma	
  janela	
  será	
  aberta,	
  onde	
  navegue	
  até	
  a	
  pasta	
  que	
  você	
  salvou	
  o	
  arquivo	
  em	
  formato	
  MEGA	
  e	
  carregue	
  o	
  arquivo.	
  O	
  programa	
   irá	
   perguntar	
   o	
   tipo	
   de	
   molécula	
   (NUCLEOTIDE)	
   e	
   se	
   é	
   codificante	
  (YES)	
  e	
  qual	
  o	
  código	
  genético	
  (STANDART).	
  Após	
   isso	
  o	
  programa	
  carregará	
  o	
  seu	
  alinhamento.	
  
	
  	
  	
  Verifique	
   se	
   seu	
   alinhamento	
   é	
   o	
   mesmo	
   que	
   você	
   carregou.	
   Caso	
   positivo	
  continuaremos	
  nossas	
  análises.	
  Apesar	
  de	
  possuir	
   interface,	
  o	
  MEGA	
  é	
  bastante	
  limitado.	
   Na	
   aba	
   PHYLOGENY,	
   depois	
   em	
   CONSTRUCT	
   PHYLOGENY	
   você	
  encontra	
   as	
   possibilidades	
   de	
   reconstrução	
   filogenética.	
   São	
   4.	
   NEIGHBOUR	
  JOINING,	
  MINIMAL	
  EVOLUTION,	
  MAXIMUM	
  PARSIMONY	
  e	
  UPGMA.	
  Na	
  verdade	
  são	
   apenas	
   2	
   critérios,	
   o	
   da	
   distancia	
   (Neighbor	
   joining,	
   Minimal	
   evolution	
   e	
  UPGMA)	
   e	
  máxima	
  parsimônia.	
   Iremos	
   construir	
   a	
   filogenia	
   com	
  os	
   2	
   critérios	
  (Neighbour	
  Joining	
  e	
  Máxima	
  Parsimônia).	
  Clique	
   na	
   aba	
   PHYLOGENY,	
   depois	
   em	
   CONSTRUCTPHYLOGENY	
   e	
   selecione	
  NEIGHBOUR	
  JOINING.	
  Uma	
  janela	
  irá	
  se	
  abrir	
  para	
  introduzirmos	
  os	
  parâmetros.	
  Em	
   PHYLOGENY	
   TEST	
   AND	
   OPTIONS	
   vamos	
   colocar	
   BOOTSTRAP	
   com	
   1000	
  replicatas.	
  Em	
  model,	
  como	
  ainda	
  não	
  testamos	
  o	
  melhor	
  modelo,	
  vamos	
  colocar	
  arbitrariamente	
   o	
   modelo	
   de	
   TAMURA-­‐NEI.	
   Entretanto,	
   quando	
   é	
   realizado	
   o	
  teste	
  para	
  verificar	
  o	
  melhor	
  modelo	
  é	
  possível	
  indicar	
  o	
  melhor	
  modelo	
  para	
  os	
  dados.	
   Em	
   PATTERN	
   AMONG	
   LINEAGES	
   vamos	
   colocar	
   DIFFERENT.	
   Deixare-­‐mos	
  RATES	
  AMONG	
  LINEAGES	
  no	
  default	
  pois	
  não	
  sabemos	
  o	
  parâmetro	
  alfa	
  da	
  distribuição	
  gama.	
  Esse	
  parâmetro	
  também	
  é	
  dado	
  quando	
  se	
  realiza	
  o	
  teste	
  do	
  melhor	
  modelo.	
  Após	
   colocarmos	
   os	
   parâmetros,	
   a	
   análise	
   pode	
   ser	
   inicializada	
   e	
   a	
   arvore	
  filogenética	
  é	
  então	
  construída	
  e	
  aparecerá	
  em	
  uma	
  nova	
  janela.	
  	
  
	
  	
  	
  Existem	
  diversas	
  ferramentas	
  para	
  a	
  edição	
  da	
  árvore.	
  Experimentem	
  cada	
  uma	
  delas	
   para	
   conhecer	
   suas	
   funções	
   e	
  melhorar	
   a	
   resolução	
  da	
   árvore.	
  Quando	
   a	
  arvore	
  estiver	
  de	
  acordo	
  com	
  a	
  sua	
  opção,	
  você	
  pode	
  salvar	
  clicando	
  em	
  IMAGE,	
  depois	
  em	
  SAVE	
  AS...,	
   onde	
  uma	
   janela	
   irá	
  aparecer	
  onde	
   indicará	
  qual	
  a	
  pasta	
  que	
   você	
   irá	
   salvar	
   o	
   arquivo.	
   Salve	
   também	
   árvore	
   num	
   arquivo	
   em	
   formato	
  NEWICK.	
   Vá	
   em	
   FILE,	
   EXPORT	
   CURRENT	
   TREE	
   (NEWICK).	
   Uma	
   janela	
   irá	
   se	
  abrir	
   onde	
   indicará	
   a	
   pasta	
   onde	
   você	
   irá	
   salvar	
   a	
   arvore.	
  Nomeie	
   o	
   arquivo	
   e	
  indique	
  a	
  extensão	
  .tre.	
  Para	
   realizar	
   a	
   análise	
   de	
   parcimônia	
   clique	
   na	
   aba	
   PHYLOGENY,	
   depois	
   em	
  CONSTRUCT	
  PHYLOGENY	
  e	
  selecione	
  MAXIMUM	
  PARSIMONY.	
  Uma	
  janela	
  irá	
  se	
  abrir	
  para	
   introduzirmos	
  os	
  parâmetros.	
   Em	
  PHYLOGENY	
  TEST	
  AND	
  OPTIONS	
  vamos	
   colocar	
   BOOTSTRAP	
   com	
   1000	
   replicatas.	
   Como	
   não	
   há	
   muito	
   o	
   que	
  otimizar	
  na	
  parcimônia,	
  vamos	
  realizar	
  a	
  análise.	
  	
  
	
  	
  Compare	
   as	
   árvores	
   geradas	
   por	
   cada	
   critério.	
   Elas	
   são	
   iguais?	
   Além	
   disso,	
   os	
  valores	
  do	
  bootstrap	
  são	
  idênticos?	
  Realize	
  a	
  análise	
  com	
  modelos	
  diferentes	
  e	
  compare	
  as	
  árvores	
  geradas	
  com	
  as	
  distâncias	
  diferentes.	
  
Realize	
   também	
   a	
   análise	
   com	
   UPGMA	
   e	
   compare	
   com	
   a	
   arvore	
   gerada	
   pelo	
  NEIGHBOUR	
  JOINING.	
  Após	
   realizarmos	
   o	
   teste	
   de	
  melhor	
  modelo	
   na	
   próxima	
   aula,	
   refazer	
   a	
   arvore	
  com	
  o	
  modelo	
  indicado	
  pelo	
  teste.