Aulas práticas de MICRO odonto ufpr

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AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA - PROVA 1 2016 – ODONTO 
CONTAGEM DE MICROORGANISMOS 
Existem várias condições em que é conveniente quantificar a população microbiana de uma 
determinada amostra como na análise de eficiência de agentes microbianos, em práticas higiênico-
sanitárias e para empregar técnicas para quantificar a população de microorganismos na água e nos 
alimentos. 
PRÁTICA 01 – AVALIAÇÃO DA MICROBIOLOGIA DO AR 
 
 
BACTÉRIAS EM ASSOCIAÇÃO COM ANIMAIS 
Divisão da placa de petri em quatro partes. 
PRÁTICA 02 – AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE SUPERFÍCIE 
A pele possui uma MICROBIOTA RESIDENTE, ou seja, existem microorganismos que vivem lá 
como o S. aureus e o Sepidermidis. Também existe a MICROBIOTA TRANSITÓRIA que pode ocorrer por 
contaminação durante o trabalho de profissionais como médicos, enfermeiros e dentistas. A microbiota 
normal permanece após lavar as mãos, já a transitória é eliminada 
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PRÁTICA 03 – MORGFOLOGIA BACTERIANA – COLORAÇÃO 
Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. O íon que dá a cor é 
chamado de radical cromóforo, então os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon 
positivo. A célula bacteriana é negativamente carregada e atrai corante básico. Os corantes básicos mais 
comuns são cristal de violeta, azul de metileno e safranina. Essa coloração é importante porque permite 
a visualização das células, a caracterização de alguns componentes intracelulares e podem levar a 
diferenciação entre os grupos de microorganismos. Tem três tipos de coloração: 
COLORAÇÃO SIMPLES cuja proposta é apenas tornar a forma e a estrutura básica das células 
mais visíveis; COLORAÇÃO DIFERENCIAL que o corante reage diferencialmente com os diferentes tipos 
de bactérias, como por exemplo, na coloração de gram e álcool e a COLORAÇÃO ESPECIAL que são 
utilizadas para corar partes específicas como esporos, flagelos ou cápsulas. 
A coloração de gram foi desenvolvida em 1884 por Hans Cristian Gram e é uma das mais 
importantes utilizadas no laboratório. Ela divide as bactérias em GRAM+ e GRAM-. Tem bactérias 
capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta + iodo que ficam violetas (gram+) e tem as 
bactérias que não retém e ficam vermelhas (gram-). As bactérias de gram+ tem uma camada de 
peptídeoglicano mais espessa que as de gram-. 
 
 
 
 
 
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ESPORULAÇÃO 
Algumas bactérias se originam em condições ambientais mais resistentes e são chamadas de ESPOROS. 
A célula que origina o esporo se desidrata e forma uma parede grossa, sua atividade metabólica fica muito 
reduzida, por isso alguns esporos podem permanecer em dormência durante anos até encontrar um ambiente 
adequado e poder se reidratar e gerar uma bactéria ativa, que se reproduz por divisão binária. Os esporos são 
muito resistentes ao calor e não morrem quando colocados na água em ebulição, por isso os laboratórios que 
precisam trabalhar com assepsia usam a autoclave. A indústria de enlatados toma cuidado para eliminar a 
bactéria Clostridium butulinum que produz o botulismo, infecção fatal. 
PRÁTICA 04 
 
 
 
MÉTODO DE ALBERT-LAYBOURN (coloração) 
 
O método de Albert-Laybourn existe porque algumas bactérias têm corpúsculos citoplasmáticos 
nas regiões polares (corpúsculos metacromáticos ou corpúsculos de Babes Enst) da célula bacilar, que se 
coram pelo Lugol forte (de cor marrom), evidenciando em contraste com o corpo bacilar, que se cora 
em verde-azulado pela solução de Laybourn. Tais características encontramos nas Corinebactérias, 
Difteróides e Lactobacilos. Tal método possibilita um diagnóstico presuntivo da doença pela 
microscopia ótica. 
 
PRATICA 05 
1. Preparação do esfregaço 
2. Preparar um esfregaço homogêneo, delgado e fixado. 
3. Cobrir o esfregaço por + ou – 5 minutos com a solução de Albert-Laybourn 
4. Escorrer (sem lavar) 
5. Cobrir com solução de Lugol forte por + ou – 2 minutos 
6. Lavar e secar 
7. Observar em objetiva de imersão (100x) 
8. Óleo de cedro 
 
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN 
O diagnóstico das Micobactérias patogênicas (Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium 
leprae), por bacterioscopia direta é feito através dos métodos os de coloração de Ziehl-Neelsen e de 
Kinyoun, os quais utilizam a característica destas bactérias de possuírem paredes celulares com alto 
teor de lipídeos (cerca de 60%, principalmente de Ácido micólico), que quando tratadas pelo corante 
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FUCSINA FENICADA, coram-se de VERMELHO e persistem ao descoramento subseqüente por uma 
solução de Álcool-ácido forte (diferenciador). É por isto que são conhecidas por BACILOS ÁLCOOL-ÁCIDO 
RESISTENTES (BAAR). As outras bactérias, que não possuem tais paredes celulares ricas em lipídeos, e 
têm a sua coloração pela Fucsina descorada pela solução de Álcool-ácido e coram-se em azul pela 
coloração de fundo do Azul de metileno (contra-corante). 
PRATICA 06 – MÉTODO DE COLORAÇÃO A QUENTE 
1. Preparar um esfregaço homogêneo, delgado e identificado em uma nova lâmina desengordurada, 
limpa e seca; 
2. Deixar secar à temperatura ambiente; 
3. Fixar o material do esfregaço passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen; 
4. Cobrir a totalidade da superfície do esfregaço com solução de FUCSINA FENICADA, previamente 
filtrada; 
5. Deixar agir por cerca de 5 minutos, aquecendo brandamente utilizando algodão umedecido em álcool 
ou com a chama do bico de Bunsen, passando lentamente por baixo da lâmina, até que se PRODUZA 
EMISSÃO DE VAPORES e, quando estes são visíveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operação até 
completar três emissões sucessivas. Evitar a fervura e secagem do corante (adicionar mais corante se 
preciso, dentro deste período para evitar que a lâmina seque porque o esfregaço precisa estar coberto 
permanentemente durante o aquecimento). Este aquecimento deve ser intermitente, pois é 
importante manter a solução aquecida durante o tempo previsto; 
6. Lavar em água corrente para eliminar a Fucsina. 
7. Cobrir toda a superfície do esfregaço com a solução de Álcool-ácido. Tomar a lâmina entre o polegar e 
o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, de modo que o Álcool-ácido vá descorando 
suavemente a Fucsina. Se o esfregaço estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se 
novamente. CONSIDERA-SE DESCORADO O ESFREGAÇO, QUANDO SUAS PARTES MAIS GROSSAS 
CONSERVAREM SOMENTE UM LIGEIRO TOM ROSADO. Essa operação dura dois minutos; 
8. Lavar a lâmina da mesma forma como se procedeu depois da coloração com a Fucsina, com cuidado 
para não desprender a película; 
9. Cobrir toda a superfície do esfregaço com solução de Azul de metileno durante 30 segundos a 1 
minuto; 
10. Lavar, da mesma forma como se indicou para a Fucsina, tanto o esfregaço como a parte inferior da 
lâmina; 
 
11. Colocar a lâmina com o esfregaço para cima, sobre o papel limpo, para secar à temperatura 
ambiente ou estufa a 35º C; 
12. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100 x). 
 
 
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ANTIBIOGRAMA – METODO DE DIFUSÃO DE ÁGUAR OU MÉTODO DE KIRBY BAUER 
Os quimioterápicos são agentes químicos utilizados nos tratamentos de doenças e os 
antibióticos são substâncias produzidas por microorganismos capazes de inibir ou matar outros. A 
maioria dos antibióticos produzida por fungos Penicillium cephalosporium e por bactérias Bacillus 
streptomyces. Antes de indicarmosum antibiótico é necessário checar a suscetibilidade do 
microorganismo ao agente prescrito, assim podemos minimizar a dispersão de capas resistentes. Um 
dos métodos para fazer essa checagem é método dos discos do papel de filtro, também chamado de 
Kirby Bauer. 
PRÁTICA 07 
Material: 
Culturas bacterianas Salina estéril para diluição Placas de Agar 
Discos de antibióticos Swabs Pinça esterilizada 
Escala de Marc Farland 
 
 
 
 
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EVIDENCIAÇÃO DE ESPIROQUETAS NA PLACA DENTÁRIA 
As espiroquetas são bactérias presentes na placa bacteriana, no cálculo dentário e nas bolsas 
periodontais. Podem ser visualizadas através do método de Fontana-Tribondeau. As espiroquetas são 
divididas em duas famílias principais: Spirochaetaceae e uma outra de importância como patógenos 
humanos: Treponemaceae. Sendo que está última tem como principais gêneros: Treponema, Borrelia e 
Leptospira. E esta família possui como características gerais: bacilos longos e delgados, espiralados e 
GRAM negativo, apresentando flagelos que dão mobilidade à bactéria. 
Treponema 
Tem espirais delgadas, que giram em torno dos endoflagelos. As espirais são tão delgadas que 
não são facilmente observadas. Não se coram bem por corantes de anilina, podem ser visualizadas em 
tecidos quando corados por um método de impregnação pela prata. Não são cultiváveis em meios 
artificiais, ovos embrionados ou cultura de tecidos e d dessecação mata as espiroquetas, assim como a 
elevação de temperatura de 42º C. 
Borrelia 
É espiralada, irregular, extremamente flexível e move-se tanto por rotação quanto por 
contorção. Cora-se facilmente por corantes bacteriológicos, bem como por corantes hematológicos, 
como os métodos de Giemsa. São cultiváveis em meios líquidos. 
Leptospira 
Não apresenta flagelos, apresentam um filamento axial delgado. São vistas ao M.E, a 
microscopia de campo escuro e não se cora facilmente, embora pode ser impregnada com a prata e por 
coloração de Giemsa. Crescem em meios sólidos com proteínas. 
 
CÁLCULO DENTAL 
Ele desempenha um papel principal na manutenção e agravamento da doença periodontal. Isto, 
pela sua capacidade de manter a placa em íntimo contato com o tecido gengival, criando assim áreas 
onde a remoção de placa se torna muito difícil. O cálculo supragengival e subgengival consiste em placa 
mineralizada coberta por um leito bacteriano não mineralizado. O cálculo dental pode ser DEFINIDO 
como um depósito aderente em vias de calcificação ou calcificado sobre os dentes ou outras estruturas 
sólidas presentes na cavidade oral. O cálculo supragengival refere-se ao cálculo coronário à margem 
gengival e visível na cavidade oral. Ocorre mais freqüentemente e em maior quantidade nas superfícies 
bucais dos molares superiores e nas superfícies linguais dos dentes anteriores da mandíbula. O cálculo 
subgengival refere-se àquele que se forma abaixo da margem gengival, em bolsas periodontais e, 
portanto, não é visto no exame oral. Ele é usualmente denso e duro, marrom escuro ou esverdeado a 
preto, de consistência petrificada e extremamente aderida à superfície dental. Os cálculos supra e 
subgengivais ocorrem geralmente concomitantemente, mas um pode estar presente sem o outro. 
Composição: O cálculo é um depósito mineralizado com um conteúdo inorgânico semelhante ao osso, 
dentina ou cemento. O cálculo supragengival é constituído por 70 a 90% de sais inorgânicos, sendo o 
cálcio e o fósforo os constituintes principais (fosfato de cálcio, carbonato de cálcio, fosfato de 
magnésio). A parte inorgânica é formada por estruturas cristalinas, como os cristais de hidroxiapatita. 
Na parte orgânica encontra-se uma mistura de células epiteliais descamadas, leucócitos, complexos 
protéico-polissacarídeos e diversos tipos de microrganismos, semelhantes ao da placa dental. 
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Estrutura: Sua estrutura é dominada por pequenos sais inorgânicos, com formato de agulhas. Quando 
observados ao microscópio eletrônico, apresentam-se com estrutura lamelada, porosa, cristais em 
forma de agulha, superfície rugosa coberta por uma camada de placa bacteriana não mineralizada. Essa 
cobertura varia de acordo com o tipo de cálculo: no supragengival predominam os microrganismos 
filamentosos e no subgengival; cocos, bastonetes e microrganismos filamentosos. 
Formação de cálculo: O cálculo é a placa dental mineralizada. A calcificação inicia-se pela ligação dos 
íons cálcio aos complexos carboidratos-proteínas da matriz orgânica e subseqüente precipitação de sais 
cristalinos de fosfato de cálcio. Nem toda placa sofre calcificação e os microrganismos não são 
essenciais para formar o cálculo. O acúmulo de placa serve como matriz orgânica para a mineralização. 
A precipitação de sais começa cerca de 1 a 14 dias após a formação de placa, inicia-se como focos ao 
longo da superfície interna da placa supragengival adjacente ao dente, esses focos aumentam de 
tamanho e se fundem formando massas sólidas. As fontes minerais para o cálculo supragengival provem 
da saliva e do cálculo subgengival, do fluido gengival ou exsudatos. 
Significado etiológico do cálculo: É difícil separar os efeitos do cálculo dos efeitos da placa, pois o cálculo 
é sempre coberto por uma camada não mineralizada de placa dental. 
Pratica 08 – EVIDENCIAÇÃO DE ESPIROQUETAS PELO MÉTODO DE FONTANA-TRIBONDEAU 
É um método de impregnação de espiroquetas, não é um método de coloração, já que a espiroqueta 
não será corada, e sim, sofrerá uma impregnação na sua parede celular. 
- Com uma alça bacteriológica, pegar um pouco de solução que contém o tártaro e colocar sobre a 
lâmina. 
- A fixação do esfregaço se faz pelo calor, que é responsável pela desnaturação das proteínas de 
superfície da espiroqueta, permitindo assim, que esta se fixe a lâmina. Deve-se aquecer a lâmina até que o 
esfregaço adquirir aspecto esbranquiçado. 
- Mordençar com solução de Tanino (mordente), aquecendo até a emissão de vapores. O calor, neste 
caso, é fundamental para que sejam formados poros na parede celular das espiroquetas. Esses poros serão os 
locais por onde o mordente (tanino) irá penetrar e mais posteriormente, a solução de nitrato de prata 
amoniacal 
- Lavar com água corrente e depois com água destilada, para eliminar o excesso do mordente. 
- Cobrir com solução de nitrato de prata amoniacal (solução impregnadora) e aquecer a te a emissão de 
vapores durante meio minuto. Essa solução impregnadora vai se ligar ao tanino, originando a cor negra que 
será visualizada ao microscópio na objetiva de 100 vezes. 
- Lavar com água e secar com o papel sem esfregar. 
- Pingar óleo para a visualização na lente de imersão.