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CEDERJ Proteínas IV (Enovelamento Protéico)

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Proteínas IV: enovelamento protéico
C E D E R J117
M Ó D U LO 3 - AULA 14
Proteínas IV: enovelamento protéico
Na aula anterior usamos como exemplo o cadarço de sapato amarrado com
o objetivo de mostrar como seria a estrutura terciária de uma proteína. Agora
vamos discutir os mecanismos que fazem com que o cadarço se amarre e se
mantenha amarrado e o modo pelo qual isso se processa.
Objetivos
• Aprender como se processa o enovelamento protéico e conhecer as prote-
ínas que auxiliam no enovelamento protéico.
No caso do nosso exemplo, é a mão da pessoa que amarra o sapato. E na
célula? Quem desempenha a função da mão que ajuda as proteínas a se enovelarem?
Será que existe uma “mão”, algum elemento que auxilie este processo, ou será que
as proteínas se enovelam sozinhas?
Enovelamento Protéico: o experimento de Anfinsen
Um experimento interessante e simples realizado para responder a esta última
questão, data da década de 60 e foi conduzido por Christian Anfinsen.
Este pesquisador estudou a via de enovelamento da ribonuclease A, uma
enzima que quebra o RNA em ribonucleotídeos. Esta enzima é um monômero,
isto é, possui apenas uma subunidade, com quatro pontes de enxofre que ajudam
a manter a sua estrutura terciária mais rígida.
Em condições adequadas de pH, e na ausência de agentes perturbadores da
estrutura de proteínas, a ribonuclease se encontra no estado nativo (N) e apresen-
ta atividade enzimática.
1o passo do experimento:
Anfinsen, para desenovelar completamente esta proteína, usou dois agentes
drásticos que perturbam a estrutura das proteínas: a uréia (agente desnaturante) e
o βββββ mercaptoetanol (agente redutor de pontes de enxofre). Na presença destas
duas substâncias, a estrutura terciária da ribonuclease é desconstruída e ela passa
para um estado conhecido como desenovelado (D) ou desnaturado.
ESTADO NATIVO
É o estado natural das
proteínas no qual suas
estruturas terciária e
secundária (e quaternária,
se houver) se encontram
íntegras. Neste estado,
elas estão aptas a
desempenhar sua função.
ESTADO DESNATURADO
É o estado das proteínas
quando parte ou a
totalidade de sua
estrutura foi perdida pela
ação de agentes químicos,
como a uréia. Quando
são sintetizadas nos
ribossomas, as proteínas
se encontram no estado
desnaturado e tendem a
passar para o estado
nativo em curto tempo.
RIBONUCLEOTÍDEOS
São as unidades
formadoras do RNA
(uracila, citosina,
guanina, adenina).
A ribonuclease é capaz
de quebrar uma
molécula de RNA em
seus constituintes
menores, isto é,
em ribonucleotídeos.
ENOVELAR
Assumir a
conformação nativa.
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Proteínas IV: enovelamento protéico
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BIOQUÍMICA IQUÍMICA I
Veja a Figura 14.1:AGENTE
DESNATURANTE
É aquele capaz de
perturbar o estado
nativo das proteínas.
Pode ser de natureza
química (uréia ou
cloreto de
guanidina), ou
física (temperatura
ou pressão). Valores
extremos de pH
(ácido ou básico)
também podem
desnaturar as
proteínas. O que Anfinsen fez, neste momento, foi desenovelar a ribonuclease, dei-
xando-a em um estado muito parecido com aquele no qual ela se encontrava quando
saiu do ribossoma, após sua síntese dentro da célula, ou seja, o estado desenovelado
ainda sem estrutura e função.
2o passo do experimento
Qual foi, então, o próximo passo de Anfinsen? Ele usou a ribonuclease
desenovelada e fez uma diálise.
Na diálise, a proteína é colocada dentro de um saquinho que possui furinhos
muito pequenos. Este é colocado dentro de um compartimento com bastante
tampão, com o objetivo de lavar bem a proteína e remover os agentes
perturbadores ou drásticos, no caso a uréia e o β-mercaptoetanol, utilizados na
primeira etapa do experimento.
Como os furinhos são muito pequenos, na lavagem somente a uréia e o β-
mercaptoetanol passam para fora do saco, já que possuem tamanho muito inferior ao
da ribonuclease, que fica retida dentro do saquinho. Após várias horas de lavagem, a
uréia e o β-mercaptoetanol já não estão mais em contato com a enzima (Figura 14.2).
Figura 14.1: Desnaturação da ribonuclease A.
Figura 14.2: Diálise da ribonuclease.
-
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3o passo do experimento
Isto feito, como será que se encontra a ribonuclease? Anfinsen surpreendeu-se
quando, ao medir a atividade da ribonuclease que estava dentro do saquinho, obser-
vou que ela apresentava atividade quase idêntica à da proteína que não tinha sido
tratada com uréia e β-mercaptoetanol. Isto sugere que a ribonuclease que estava no
estado desenovelado se reenovelou sozinha, assumindo sua conformação original
(nativa) dotada de função. Até mesmo as quatro pontes de enxofre existentes entre
as cisteínas foram reformadas certinhas!
Conclusão do experimento
Com este experimento bastante simples, Anfinsen nos mostrou uma coisa
muito importante: a seqüência primária da proteína é que determina sua
estrutura terciária.
Em outras palavras, poderíamos dizer que as proteínas enovelam-se sozi-
nhas sem a ajuda de nenhum outro fator. No experimento de Anfinsen, nada mais
havia dentro do saquinho a não ser a própria ribonuclease e sua presença foi sufi-
ciente para que a proteína reassumisse sua conformação nativa e funcional. Vol-
tando ao exemplo do cadarço do sapato, seria como se o cadarço pudesse se amarrar
sozinho, sem a ajuda da mão!
Deduzimos, então, que mutações que alteram a seqüência primária das pro-
teínas podem comprometer a sua estrutura terciária e, conseqüentemente, sua
função.
Você seria capaz de imaginar como as mutações poderiam afetar a função
de uma proteína?
Seqüência primária da proteína � Estrutura terciária � Proteína Funcional
Graças a esta
descoberta, Anfinsen
recebeu o prêmio Nobel
em 1972.
MUTAÇÃO
É a substituição de um
aminoácido, na
proteína, por outro
alterando a sua
seqüência primária.
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BIOQUÍMICA IQUÍMICA I
Enovelamento protéico assistido
Em uma célula de Escherichia coli, uma proteína com 100 aminoácidos pode
ser sintetizada e montada em 5 segundos a 37oC. Entretanto, algumas proteínas
não sabem se enovelar sozinhas e precisam de uma “mãozinha”, como o cadarço
que precisa de uma mão para amarrá-lo.
Em nossas células, existem algumas proteínas denominadas chaperones
moleculares. A função das chaperones é interagir com as proteínas que necessi-
tam enovelar-se, auxiliando-as a assumir a conformação nativa. Elas podem ser
encontradas em organismos, desde bactérias até o homem.
Existem duas classes de chaperones moleculares:
Classe 1: Proteínas de Choque térmico
As chaperones desta classe são encontradas em células submetidas ao estresse
térmico e por isto são chamadas proteínas de choque térmico.
Elas se ligam às regiões hidrofóbicas das proteínas que ainda estão
desenoveladas, evitando que a proteína agregue. A agregação ocorre quando pro-
teínas desenoveladas (ou parcialmente enoveladas) interagem umas com as outras,
formando uma espécie de “maçaroca” dentro da célula (Figura 14.3). Obviamente,
esta “maçaroca” não é desejável, já que a proteína que nela se encontra não pode
desempenhar sua função.
CHAPERONES
MOLECULARES
Proteínas de
choque térmico e
seu papel no
enovelamento
protéico.
ESTRESSE TÉRMICO
Quando se expõe
células em cultura a
uma temperatura
mais elevada em
relação àquela que,
em geral, elas
necessitam para
crescer.
Figura 14.3: Enovelamento de uma
proteína após sua síntese (tradução)
no ribossoma. Observe que a
proteína pode se unir a outras
proteínas antes de completar o
enovelamento, formando agregadosindesejáveis dentro das células.
Entretanto, as proteínas de choque
térmico são capazes de atuar como
guardiãs e impedir a agregação, ao
evitar o contato entre duas proteínas
parcialmente enoveladas.
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Proteínas IV: enovelamento protéico
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A agregação de proteínas é um tema muito importante nos dias de hoje,
sendo a causa de várias doenças como a da “vaca louca” e a doença de Alzheimer,
por exemplo, que serão tratadas em mais detalhes na Aula 17.
Esta mesma classe de chaperones também está envolvida na manutenção de
determinadas proteínas no estado desenovelado, para que elas possam ser transpor-
tadas para o interior das organelas. Neste processo, as chaperones se grudam às
proteínas, assim que elas são liberadas nos ribossomas, mantendo-as esticadas e
sem estrutura até que elas cheguem na sua organela-alvo onde, então, se enovelam.
Classe 2: Chaperoninas
A esta classe pertencem as proteínas complexas que ajudam no enovelamento
das proteínas que não sabem se enovelar sozinhas.
Elas funcionam como uma espécie de concha que se abre permitindo a
entrada do peptídeo desenovelado, fechando-se em seguida. Quando fechada, é
criado um ambiente livre de água, permitindo que os resíduos de aminoácidos
apolares da proteína, que será enovelada, se encontrem e formem o miolo ou o
cerne da proteína nativa. Todo esse processo de “abre e fecha” das chaperoninas,
requer gasto de ATP. Veja Figura 14.4:
Na classe das chaperoninas, encontramos as proteínas denominadas
dissulfeto isomerase. Elas ajudam a formar as pontes de enxofre de proteínas
que estão se enovelando e que possuem estas pontes na sua conformação nativa.
No caso da ribonuclease, que possui quatro pontes de enxofre, estas se for-
mam sozinhas, conforme Anfinsen nos mostrou em seus experimentos. Entretanto,
nem todas as proteínas são tão “espertas” como a ribonuclease. Muitas delas, aque-
las que possuem pontes de enxofre, precisam de uma “mãozinha” da proteína
dissulfeto isomerase para que os pares de cisteína corretos se encontrem e formem
as pontes.
Figura 14.4: Estrutura da GroEL ES.
GROEL E GRO ES
DISSULFETO ISOMERASES
Ajudando a fazer pontes
de enxofre corretas
PEPTIDIL PROLIL
ISOMERASE
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Proteínas IV: enovelamento protéico
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BIOQUÍMICA IQUÍMICA I
Outra proteína dentro da classe das chaperoninas denomina-se peptidil prolil
isomerase. Esta chaperonina especializou-se na conversão dos isômeros da ligação
peptídica da prolina, que podem existir na forma cis ou trans.
Tal conversão é muito lenta, necessitando de uma “ajudinha”. Assim, a
prolil isomerase torna mais acelerada esta reação permitindo que a proteína se
enovele rapidamente.
Enfim, ninguém poderia imaginar que por trás de uma simples proteína exis-
tissem tantas histórias interessantes. Quando a gente come um bife ou mesmo
olha para as próprias mãos, onde existem milhares de proteínas, nem imagina que
trabalho a célula teve para sintetizá-las e montá-las. De qualquer forma, esta linha
de montagem deve funcionar perfeitamente, caso contrário a existência da vida
fica ameaçada.
ISOMERIZAÇÃO DAS
PROLINAS
Figura 14.5: Esquema do mecanismo de ação da proteína dissulfeto isomerase. Observe que ela é capaz
de desfazer as pontes de enxofre erradas ao fazer pontes de enxofre com a proteína de interesse. Desta
forma, a dissulfeto isomerase deixa livre as cisteínas corretas que devem fazer as pontes de enxofre
presente na proteína nativa.
Veja a Figura 14.5:
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Proteínas IV: enovelamento protéico
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Exercícios
1. Por que você acha que as chaperoninas precisam proteger os aminoácidos apolares
durante o enovelamento protéico? E os aminoácidos polares?
2. Explique, com suas palavras, quais foram as principais conclusões do experimento
de Anfinsen.
3. Um estudante de doutorado estudava o enovelamento de uma proteína de bactéria
que ele havia purificado. No entanto, ele observava que a proteína sempre agrega-
va em seus experimentos. O que você aconselharia a este estudante? Como resol-
ver o problema?
Resumo
Após ter aprendido os quatro níveis organizacionais das proteínas você viu,
nesta aula, como se processa o enovelamento protéico. Foi apresentado o
experimento do Anfinsen que mostrou como a estrutura primária da prote-
ína determina a sua estrutura terciária. Você também aprendeu como se
processa o enovelamento protéico assistido e as proteínas que nele atuam.
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