CITOMETRIA DE FLUXO 2016

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CITOMETRIA DE FLUXO
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PRINCÍPIOS BÁSICOS DE 
CITOMETRIA DE FLUXO
CITO METRIA FLUXO 
 
 
 Célula Medida Movimento
Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
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 Citometria de fluxo é uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. 
 Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo conhecida também por citometria de fluxo multiparamétrica. 
 Através de um aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de características físicas e/ou químicas de uma simples célula.
Citometria de fluxo 
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CITÔMETRO DE FLUXO
SISTEMA FLUIDO
SISTEMA ÓPTICO
 SISTEMA ELETRÔNICO
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SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO
SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ.
SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR. 
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CÂMARA DE FLUXO
SISTEMA FLUIDO
CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA
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Low Sample Pressure 12µl/min
Sample
Laminar Flow
LOW DIFFERENTIAL PRESSURE
Sheath
Sheath
Sample
FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH” 
HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE
High Sample Pressure 60µl/min
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SISTEMA ÓPTICO
SISTEMA É COMPOSTO POR UM LASER E LENTES PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER.
A COLEÇÃO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A DISPERSÃO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA PELAS PARTÍCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE DO LASER.
UM SISTEMA DE ESPELHOS ÓPTICOS E FILTROS DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA LUZ PARA OS DETECTORES ÓPTICOS ESPECÍFICOS.
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FACSCalibur 
FL1
 
Red Diode Laser ~635 nm
SSC
FL3
FL4
670LP
661/16
585/42
488/10
90/10 Beam Splitter
DM 560SP
Fluorescence Collection Lens
DM 640LP
Half Mirror
488/10
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488 nm Blue Laser
FSC Diode
Focusing Lens
FL2
530/30
Beam Combiner
SISTEMA ÓPTICO
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ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
LASER
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SISTEMA ELETRÔNICO
CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS, DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM ANALISADOS NO COMPUTADOR.
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A medida proveniente de cada detector é denominada Parâmetro
 Parâmetro 1 	FSC
 Parâmetro 2	SSC
 Parâmetro 3	FL1
 Parâmetro 4	FL2 
 Parâmetro 5	FL3
SISTEMA ELETRÔNICO
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FLUORESCÊNCIA
O que é a fluorescência ?
Comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da luz do laser
Luz Fluorescente emitida
 de menor energia e maior comprimento de onda
Fluoresceína
 = 530 nm
Luz Incidente de maior energía
Fluorocromo
 = 480 nm
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FLUORESCÊNCIAS
O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta luz de comprimento de onda  530 nm, que corresponde à luz verde.
O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda  570 nm, o que corresponde à luz laranja.
O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta luz de comprimento de onda  650 nm, o que corresponde à luz vermelha.
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SISTEMA ELETRÔNICO
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DISPERSÃO
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DISPERSÃO:
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Visão dos dados coletados
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APLICAÇÕES CLÍNICAS
- Análise da subpopulação linfocítica
- Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas
- Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo
- Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas
- Monitoramento quimioterapêutico / doença residual mínima
- Análise de reticulócitos
- Diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna
- Detecção de anticorpos antiplaquetários
- Análise do conteúdo de DNA
- Quantificação de células progenitoras (Stem cells)
- Avaliação imunológica de paciente transplantado, de infusão
linfocitária
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ALGUNS MARCADORES
CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos timócitos.
CD4- 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticas
CD8- 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica.
CD19- presente em mais de 95% das células B.
CD20- assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do tecido linfóide e sangue periférico.
CD45- expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO.
CD56- marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou granulócitos.
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CD10
CD2
CD20
CD3
CD7
CD19
CD22
CD23
CD26
CD5 
Leucemias Linfociticas ou
Enfermidade residual mínima
CD3
CD7
HLA DR 
CD 42a 
CD 61
CD19 
CD33 
CD13 
CD14
 CD34 
Leucemias mielóides
CD3 
CD7 
CD2 
CD19 
CD5 
CD56
Linfomas e Mielomas 
LEUCEMIAS
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A hematologia foi uma das primeiras disciplinas médicas a se beneficiar das aplicações clínicas da citometria de fluxo. Algumas destas aplicações são atualmente utilizadas regularmente para o diagnóstico ou a seguinte terapêutica das diferentes afecções. Estas aplicações concernem bem também ao estudo funcional das células sadias que coloca em evidência a natureza patológica das células analisadas.
Em cancerologia, a detecção da célula patológica é a aplicação mais desenvolvida. Esta detecção reposa essencialmente sobre a medição de um conteúdo anormal de DNA no núcleo da célula tumoral.
A imunologia utiliza a citometria de fluxo para a detecção ou identificação de subtipos de células implicadas na imunidade.
O ciclo celular representa a integralidade do período de divisão, pode-se dizer, o conjunto de acontecimentos bioquímicos e morfológicos que são responsáveis pela proliferação celular. A citometria oferece uma metodologia rápida e simples de se colocar em obra para analisar o ciclo celular. Ela permite de acompanhar a distribuição das células nas diferentes fases do ciclo em função de diversos estímulos ou da adição de algumas drogas. Ela permite também ver a presença de células com os conteúdos anormais de DNA.
Numerosos estudos em farmacologia referentes a citometria de fluxo dão enfoque em estudos de drogas antimitóticas, imunoterapia.
Em oceanografia, a citometria de fluxo tornou-se um método de rotina para contar as diferentes populações de Picoplancton fotossintética sob a base da fluorescência de pigmentos semelhante a clorofila.
As outras pesquisas são referentes a análise de cromossomos, fisiologia vegetal (para a seleção de plantas mais resistentes), etc.
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ANTICORPOS MONOCLONAIS
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Um feixe de luz (normalmente laser) de um único comprimento de onda (cor) é direccionado a um meio líquido em fluxo. Um número de dectores são apontados ao local onde o fluxo passa através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) além de um ou mais detectores fluorescentes. Cada partícula suspensa passando através do feixe dispersa a luz de uma forma, e os corantes químicos fluorescentes encontrados na partícula ou juntos a partícula podem ser excitados emitindo luz de menor frequência do que o da fonte de luz. Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é melhorada pelos detectores, e analisando as flutuações de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente) é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e química de cada partícula individual. FSC correlaciona-se com o volume celular e SSC depende da complexidade interna da partícula (por exemplo: forma do núcleo, quantidade e tipo dos grânulos citoplasmáticos e rugosidade da membrana). Alguns citômetros de fluxo do mercado tem eliminado a necessidade da fluorescência e usado somente dispersão de luz para sua medição. Outros citômetros de fluxo formam imagens de cada fluorescência da célula, dispersão de luz e transmissão de luz.
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	QUANDO A CÉLULA CRUZA O LASER OCORRE DISPERSÃO DA LUZ PARA TODOS OS LADOS, MAS SÓ EM DUAS DIREÇÕES ELA É ANALISADA: 
	A REFRAÇÃO
DA LUZ NO ÂNGULO DE 950 É DENOMINADA ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL E REVELA A COMPLEXIDADE DO CONTEÚDO CITOPLASMATICO.
 	A REFLEXÃO DA LUZ NA FAIXA DE 1 A 50 FORMA O ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL E REVELA O VOLUME DA CÉLULA.
 
 
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