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* CITOMETRIA DE FLUXO * PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CITOMETRIA DE FLUXO CITO METRIA FLUXO Célula Medida Movimento Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) * Citometria de fluxo é uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo conhecida também por citometria de fluxo multiparamétrica. Através de um aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de características físicas e/ou químicas de uma simples célula. Citometria de fluxo * CITÔMETRO DE FLUXO SISTEMA FLUIDO SISTEMA ÓPTICO SISTEMA ELETRÔNICO * SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ. SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR. * CÂMARA DE FLUXO SISTEMA FLUIDO CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA * Low Sample Pressure 12µl/min Sample Laminar Flow LOW DIFFERENTIAL PRESSURE Sheath Sheath Sample FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH” HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE High Sample Pressure 60µl/min * SISTEMA ÓPTICO SISTEMA É COMPOSTO POR UM LASER E LENTES PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER. A COLEÇÃO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A DISPERSÃO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA PELAS PARTÍCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE DO LASER. UM SISTEMA DE ESPELHOS ÓPTICOS E FILTROS DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA LUZ PARA OS DETECTORES ÓPTICOS ESPECÍFICOS. * FACSCalibur FL1 Red Diode Laser ~635 nm SSC FL3 FL4 670LP 661/16 585/42 488/10 90/10 Beam Splitter DM 560SP Fluorescence Collection Lens DM 640LP Half Mirror 488/10 . 488 nm Blue Laser FSC Diode Focusing Lens FL2 530/30 Beam Combiner SISTEMA ÓPTICO * ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC) ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC) LASER * SISTEMA ELETRÔNICO CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS, DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM ANALISADOS NO COMPUTADOR. * A medida proveniente de cada detector é denominada Parâmetro Parâmetro 1 FSC Parâmetro 2 SSC Parâmetro 3 FL1 Parâmetro 4 FL2 Parâmetro 5 FL3 SISTEMA ELETRÔNICO * FLUORESCÊNCIA O que é a fluorescência ? Comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da luz do laser Luz Fluorescente emitida de menor energia e maior comprimento de onda Fluoresceína = 530 nm Luz Incidente de maior energía Fluorocromo = 480 nm * FLUORESCÊNCIAS O detector de FL-1 (Fluorescência 1) capta luz de comprimento de onda 530 nm, que corresponde à luz verde. O detector de FL-2 (Fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda 570 nm, o que corresponde à luz laranja. O detector de FL-3 (Fluorescência 3) capta luz de comprimento de onda 650 nm, o que corresponde à luz vermelha. * SISTEMA ELETRÔNICO * DISPERSÃO * DISPERSÃO: * Visão dos dados coletados * APLICAÇÕES CLÍNICAS - Análise da subpopulação linfocítica - Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas - Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo - Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas - Monitoramento quimioterapêutico / doença residual mínima - Análise de reticulócitos - Diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna - Detecção de anticorpos antiplaquetários - Análise do conteúdo de DNA - Quantificação de células progenitoras (Stem cells) - Avaliação imunológica de paciente transplantado, de infusão linfocitária * ALGUNS MARCADORES CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos timócitos. CD4- 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticas CD8- 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica. CD19- presente em mais de 95% das células B. CD20- assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do tecido linfóide e sangue periférico. CD45- expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO. CD56- marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou granulócitos. * CD10 CD2 CD20 CD3 CD7 CD19 CD22 CD23 CD26 CD5 Leucemias Linfociticas ou Enfermidade residual mínima CD3 CD7 HLA DR CD 42a CD 61 CD19 CD33 CD13 CD14 CD34 Leucemias mielóides CD3 CD7 CD2 CD19 CD5 CD56 Linfomas e Mielomas LEUCEMIAS * A hematologia foi uma das primeiras disciplinas médicas a se beneficiar das aplicações clínicas da citometria de fluxo. Algumas destas aplicações são atualmente utilizadas regularmente para o diagnóstico ou a seguinte terapêutica das diferentes afecções. Estas aplicações concernem bem também ao estudo funcional das células sadias que coloca em evidência a natureza patológica das células analisadas. Em cancerologia, a detecção da célula patológica é a aplicação mais desenvolvida. Esta detecção reposa essencialmente sobre a medição de um conteúdo anormal de DNA no núcleo da célula tumoral. A imunologia utiliza a citometria de fluxo para a detecção ou identificação de subtipos de células implicadas na imunidade. O ciclo celular representa a integralidade do período de divisão, pode-se dizer, o conjunto de acontecimentos bioquímicos e morfológicos que são responsáveis pela proliferação celular. A citometria oferece uma metodologia rápida e simples de se colocar em obra para analisar o ciclo celular. Ela permite de acompanhar a distribuição das células nas diferentes fases do ciclo em função de diversos estímulos ou da adição de algumas drogas. Ela permite também ver a presença de células com os conteúdos anormais de DNA. Numerosos estudos em farmacologia referentes a citometria de fluxo dão enfoque em estudos de drogas antimitóticas, imunoterapia. Em oceanografia, a citometria de fluxo tornou-se um método de rotina para contar as diferentes populações de Picoplancton fotossintética sob a base da fluorescência de pigmentos semelhante a clorofila. As outras pesquisas são referentes a análise de cromossomos, fisiologia vegetal (para a seleção de plantas mais resistentes), etc. * ANTICORPOS MONOCLONAIS * Um feixe de luz (normalmente laser) de um único comprimento de onda (cor) é direccionado a um meio líquido em fluxo. Um número de dectores são apontados ao local onde o fluxo passa através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) além de um ou mais detectores fluorescentes. Cada partícula suspensa passando através do feixe dispersa a luz de uma forma, e os corantes químicos fluorescentes encontrados na partícula ou juntos a partícula podem ser excitados emitindo luz de menor frequência do que o da fonte de luz. Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é melhorada pelos detectores, e analisando as flutuações de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente) é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e química de cada partícula individual. FSC correlaciona-se com o volume celular e SSC depende da complexidade interna da partícula (por exemplo: forma do núcleo, quantidade e tipo dos grânulos citoplasmáticos e rugosidade da membrana). Alguns citômetros de fluxo do mercado tem eliminado a necessidade da fluorescência e usado somente dispersão de luz para sua medição. Outros citômetros de fluxo formam imagens de cada fluorescência da célula, dispersão de luz e transmissão de luz. * QUANDO A CÉLULA CRUZA O LASER OCORRE DISPERSÃO DA LUZ PARA TODOS OS LADOS, MAS SÓ EM DUAS DIREÇÕES ELA É ANALISADA: A REFRAÇÃO DA LUZ NO ÂNGULO DE 950 É DENOMINADA ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL E REVELA A COMPLEXIDADE DO CONTEÚDO CITOPLASMATICO. A REFLEXÃO DA LUZ NA FAIXA DE 1 A 50 FORMA O ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL E REVELA O VOLUME DA CÉLULA. * * *
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