IFRJ Realengo - Genetica e Embriologia - Replicacao do DNA

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Replicação do DNA
Replicação do DNA
Dogma Central da Biologia Molecular
As duas fitas do DNA parental são copiadas, originando 
moléculas-filhas com somente uma fita nova sintetizada.
Replicação Semiconservativa da dupla hélice de 
DNA
Experimento clássico de Meselson e Stahl – 1958
Cultivo em meio
15NH4Cl
Confirmaram a hipótese de replicação semiconservativa do DNA.
Cultivaram células de E. coli em um meio contendo o isótopo pesado de 
nitrogênio (15N) ao invés da forma leve normal (14N).
Purificação do DNA 
seguida de 
centrifugação em 
gradiente de CsCl
Cultivo em meio
14NH4Cl
DNA polimerases
•Um problema a ser resolvido era compreender como as bases são 
trazidas para a dupla hélice-molde.
Arthur Kornberg (1959) isolou a enzima DNA polimerase de E. coli e 
demonstrou sua atividade enzimática in vitro.
DNA polimerases
A enzima que Kornberg isolou é conhecida hoje como DNA 
polimerase I. Tem 3 atividades:
1. Atividade polimerase, que catalisa o crescimento no sentido 5’ para 
3’.
2. Atividade de exonuclease de 3’ para 5’, que remove os 
pareamentos errados de bases.pareamentos errados de bases.
3. Atividade de exonuclease de 5’ para 3’, que degrada uma sequência 
primer de RNA.
DNA polimerases
Na época alguns cientistas suspeitavam que a DNA polimerase I não era 
responsável por toda a síntese de DNA.
• Lenta (~20 nucleotídeos/s).
• Muito abundante(~400 moléculas /célula).
• Dissocia-se do DNA após a incorporação de apenas 20 a 50 
nucleotídeos).
DNA polimerases
Em 1969, John Carns e Paula DeLucia demonstraram que outra DNA 
polimerase (pol III) catalisa a síntese de DNA na forquilha de replicação.
Direção de replicação: a adição dos nucleotídeos para o
alongamento da cadeia é sempre no sentido 5’ 3’, pois a
DNA polimerase só funciona neste sentido.
ADNA polimerase pode ampliar uma cadeia, mas não pode
começá-la.
É necessário a presença de um de um primer, que são pequenas
sequências de RNA sintetizados por uma primase, um tipo de RNA-
polimerase.
DNA polimerases
polimerase.
DNA polimerases
Semi-descontinuidade da replicação: a replicação ocorre de
forma contínua em uma das fitas do DNA e descontínua na
outra fita.
DNA polimerases
A replicação do DNA é um processo preciso. Em geral, é
inserido menos de um erro por 1010 nucleotídeos.
•Atividade de exonuclease 3’ para 5’ da DNA pol I.
DNA polimerase I
� Atividade polimerase, que catalisa o crescimento no sentido 5’ para � Atividade polimerase, que catalisa o crescimento no sentido 5’ para 
3’.
� Atividade de exonuclease de 3’ para 5’, que remove os pareamentos 
errados de bases.
� Atividade de exonuclease de 5’ para 3’, que degrada uma seqüência 
primer de RNA.
� Lenta (~20 nucleotídeos/s).
� Muito abundante(~400 moléculas /célula).
� Dissocia-se do DNA após a incorporação de apenas 20 a 50 
nucleotídeos).
DNA ligase
Fragmentos 
de Okasaki 
ocorrem na fita 
descontínua
A DNA 
polimerase III 
é responsável 
pela síntese da 
maior parte do 
DNADNA
A DNA 
polimerase I 
remove o 
primer de RNA 
e preenche as 
lacunas
A DNA ligase 
sela as quebras
O Replissomo
A replicação do DNA é um
processo veloz. E. coli replica seu
DNA em 40 min e seu genoma
tem cerca de 5 milhões de pares
de bases. Velocidade de 2000
nucleotídeos/s. A velocidade não é
sacrificada pela precisão.sacrificada pela precisão.
Como isso é possível?
A DNA polimerase faz parte de
um complexo nucleoproteico
chamado replissomo.
Replissomo
2 cernes catalíticos:
Um para a síntese do filamento
contínuo, outro para a síntese do
filamento descontínuo.
Proteína acessória grampo β –
circunda o DNA como uma rosca,
mantendo a DNA pol III ligada à
molécula de DNA.
Helicase – Rompe as pontes de
hidrogênio.
Proteínas de ligação unifilamentar
– Ligam-se ao DNA unifilamentar
e impedem a reestruturação da
dupla hélice.dupla hélice.
DNA girase (topoisomerase) – Relaxam
a super-helicoidização do DNA:
•Quebra dos filamentos de DNA.
•Permite o giro dos mesmo.
•Reúne os filamentos da molécula
relaxada.
A replicação é bidirecional
Estima-se que existam milhares de forquilhas de replicação nos
cromossomos humanos.
EXERCÍCIOS
1- Se o conteúdo de AT em uma molécula de DNA é de 36%, quais são 
os conteúdos de todas as bases? 
2- Explique porque no experimento de Avery e colegas, o tratamento que 
destruiu o DNA não produziu colônias patogênicas.
3- Qual a contribuição do experimento realizado por Hershey e Chase 
para a Genética? Como o objetivo foi alcançado? para a Genética? Como o objetivo foi alcançado? 
4- Porque surgem os fragmentos de Okasaki? 
5- O isótopo radioativo do nitrogênio N15 pode ser usado para marcar 
radioativamente compostos que possuam nitrogênio na sua composição, 
como é o caso dos ácidos nucleicos. Uma cultura de Escherichia coli
cresceu em um meio contendo exclusivamente N15 até que todo o DNA
estivesse marcado. Então transferiu-se a colônia para um meio contendo 
nitrogênio comum N14 e deixou-se que crescesse por, exatamente, duas 
gerações. Fazendo-se então uma avaliação do DNA, quanto deveria ser 
encontrado contendo:
a) Somente N15? b) Híbrido (uma fita N14 e outra N15)? c) Somente 
N14?N14?
6- Se os 4 desoxinucleotídeos mostrassem pareamento inespecífico de 
bases, a informação única contida em um gene seria mantida após a 
replicação? Explique.
7- A composição do DNA de um vírus é 25% A, 33% T, 24% G e 18% C. 
Essa composição faz sentido pelas regras de Chargaff? Como você 
interpretaria esse resultado?