Aula 2 Bactérias

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Nutrição, cultivo e crescimento microbiano
Refletindo...
Quando falamos em crescimento microbiano, estamos nos referindo ao número ou ao tamanho das células?
CRESCIMENTO MICROBIANO:
Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e não ao aumento das dimensões celulares.
Crescimento Microbiano = associado aocrescimento de uma população decélulas (uma célula dará origem a duas aofim de um certo tempo, tempo degeração ou de duplicação.)
Crescimento Microbiano
 1. Fatores necessários para o crescimento
 - Fatores Físicos ( temperatura, pH, pressão osmótica)
 - Fatores Químicos (nutrientes, água, O2 etc.)
 2. Meio de Cultura
 - Meio Complexo
 - Meio Definido
 3. Crescimento da cultura bacteriana
 - Quantificação Direta (nº. de colônias viáveis ou não)
 - Quantificação Indireta (turbidez, peso seco etc.)
FATORES NECESSÁRIOS PARA O CRESCIMENTO
- FATORES FÍSICOS: temperaturapHpressão osmótica (concentração de sal)
- FATORES QUÍMICOS:águafontes de carbono e nitrogêniomineraisoxigêniofatores orgânicos
FATORES FÍSICOS
1. TEMPERATURA: 
A maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas ideais para os seres humanos.
- Temperatura de crescimento mínima: < temperatura onde a espécie é capaz de crescer
- Temperatura de crescimento ótima:onde a espécie apresenta melhor crescimento
- Temperatura de crescimento máxima:> temperatura, onde ainda é possível o crescimento
Figura 1. Taxa de crescimento vs. temperatura
FATORES FÍSICOS
1. TEMPERATURA: 
Microrganismos são classificados em 3 grupos:
- Psicrófilos: crescem em baixas temperaturas (-10 a 15 °C)
- Mesófilos: crescem em temperaturas moderadas (10 a 50 °C)
- Termófilos: crescem em altas temperaturas (40 a 70 °C)Termófilos extremos (68 a 110 °C)
Figura 2
Figura 2. Curva de crescimento característica de diferentes microrganimos
Termófilos extremos
Psicrófilos: temperatura ótima: 15 °Cencontrados em oceanos e regiões da Árticanão causam problemas na preservação de alimentos
Psicrotróficos: temperatura ótima: 20 a 30 °Ccrescem em temperatura de refrigeradores (4 °C)encontrados em alimentos estragados
Mesófilos: temperatura ótima: 25 a 40 °C (mais encontrados) corpo de animais (temperatura da pele)bactérias patogênicas: temp. ótima 37 °Cdegradam alimentos e são patogênicos
Termófilos: temperatura ótima: 50 a 60 °Cambiente de águas termais (***não crescem em temp. < 45 °C)material estocado (altas temp.)= compostagem
Área de Alimentos
FATORES FÍSICOS
2. pH: 
- refere-se a acidez ou a alcalinidade de uma solução;- maioria dos microrganismos cresce melhor perto da neutralidade (pH 6,5 – 7,5);- poucas bactérias são capazes de crescer em pH ácido (como pH 4,0)
Bactérias: faixa entre pH 7,0
Exceções: 
- Bactérias acidófilas: alto grau de tolerância à acidez (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5)- Bactérias alcalifílicas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 – 11).
Fungos - tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (pH <5).
Figura 3
Figura 3. Distribuição de alguns microrganismos de acordo com o pH
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
FATORES FÍSICOS
3. PRESSÃO OSMÓTICA: 
Os microrganismos retiram da água a maioria dos nutrientes solúveis (conteúdo celular 80 – 90 % de água)
Pressão osmótica: retira a H2O dentro da célula
Reação Hipertônica: perda de H2O do meio intracelular para o extracelular, através da membrana plasmática (meio com concentração de sais).
Plasmólise: diminuição da membrana plasmática da célula devido a perda de H2O por osmose.
Figura 4
Figura 4. Taxa de crescimento de alguns microrganimos vs. a concentração de sal.
Não Halófilos: não necessitam de sal e não toleram a presença no meio.
Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a presença no meio.
Halófilos: necessitam de sal em uma concentração moderada
Halófilos extremos: necessitam de sal em altas concentrações.
-adição de sais: plasmólisepreservação de alimentos (peixe salgado, mel e leite)Alta concentração de sal ou açúcar
Área de Alimentos
Halofílicos Extremos (ou obrigatórios): necessitam de altas concentrações
de sais para o crescimento
Halofílicos Facultativos: mais abundantes
não exigem altas concentrações de sais
-Adição de ágar:normalmente 1,5% para solidificar o meio> concentração = inibição de alguns microrganismo> concentração de sal = pressão osmótica
FATORES QUÍMICOS
1. ÁGUA: 
- Essencial para os microrganismos- Disponibilidade variável no ambiente
Ambiente com < concentração de água:
desenvolvem mecanismos para obter água através do aumento da concentração de solutos internos seja pelo bombeamento de íons para o interior celular ou pela síntese de solutos orgânicos (açúcares, álcoois ou aminoácidos).
FATORES QUÍMICOS
2. FONTES DE CARBONO, NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO: 
a) CARBONO:
essencial para a síntese de todos os compostos orgânicos necessários para a viabilidade celular (elemento estrutural básico para os seres vivos)
organismos quimio-heterotróficos: obtém C a partir de materiais orgânicos como proteínas, carboidratos e lipídeos.
organismos quimio-autotróficosorganismos fotoautotróficos C a partir de CO2
b) NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO:
- N, S: síntese de proteínas- N, P: síntese de DNA e RNA, ATP
Peso seco de uma célula bacteriana: 14 % N, 4 % S, P
NITROGÊNIO
- utilizado para sintetizar os grupos aminos presentes nos aminoácidos.
Obtenção de N:- Decomposição de materiais orgânicos (proteínas, aminoácidos)- Amônia (NH4 +) - Nitrato (NO3-)
Fixação de N: algumas bactérias são capazes de utilizar N gasoso diretamente da atmosfera.
Microrganismos do solo (ex. bactérias dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium) utilizam este processo para obtenção de N, tanto para elas como para as plantas que convivem simbioticamente (algumas leguminosas – soja, feijão).
Cultivo de leguminosas: > fertilidade do solo sem a necessidade de implementação de fertilizantes químicos
Bactérias Fixadoras de Nitrogênio
b) NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO:
ENXOFRE
- utilizado na síntese de aminoácidos contendo S (metionina e cisteína) e de vitaminas (tiamina e biotina).
FÓSFORO
- essencial para a síntese dos ácidos nucléicos e para os fosfolipídeos componentes da membrana celular.
Fontes naturais de S:
íon sulfato (SO4-2), sulfito de hidrogênio, aminoácidos
Fontes naturais de P:
íon fosfato (PO4-3), DNA, RNA, ATP
c) POTÁSSIO, MAGNÉSIO E CÁLCIO:
- também são elementos essenciais para os microrganismos
- frequentemente encontrados como co-fatores para as reações enzimáticas.
d) ELEMENTOS TRAÇOS:
- FERRO, COBRE, MOLIBDÊNIO, ZINCO
- utilizados como co-fatores essenciais para atividade de algumas enzimas 
utilizar água destilada para meio de cultura – contém todos os elementos traços
FATORES QUÍMICOS
3. OXIGÊNIO: 
- extremamente importante no desenvolvimento microbiano
- organismos classificados em:
Figura 5
1. AERÓBIOS- Estritos (obrigados): necessitam de O2- Facultativos: não necessitam de O2 mas crescem melhor com O2- Microaerófilo: necessitam de O2 mas em níveis menores
2. ANAERÓBIOS- Aerotolerantes: não necessitam de O2 mas crescem melhor sem O2- Estritos (obrigados): não toleram O2 (letal)
AERÓBIOESTRITOS
alta [O2]catalaseSOD
ANAERÓBIO ESTRITO
sem O2ausência: catalaseSOD
MICROAERÓFILO
baixa [O2]
AERÓBIO FACULTATIVO
alta e baixa [O2]catalaseSOD
alta e baixa [O2]SOD
ANAERÓBIO AEROTOLERANTES
Figura 5. Efeito do oxigênio sobre o crescimento de vários tipos de bactérias.
Catalase e asuperóxidodismutasereduzempara H2O oscompostostóxicos.
MEIO DE CULTURA
MEIO DE CULTURA: material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de microrganismos.
CULTURA: microrganismos que crescem e se multiplicam no meio de cultura.
MEIO DEFINIDO: TODA A COMPOSIÇÃO QUÍMICA É CONHECIDA
MEIO COMPLEXO: COMPOSIÇÃOQUÍMICA NÃO CONHECIDA (composto por nutrientes como extrato de levedura, de carne ou de plantas)
MEIO DE CULTURA
MEIO DE CULTIVO SELETIVO E DIFERENCIAL: 
- meio seletivo: favorece o crescimento de uma determinada bactéria de interesse, impedindo o crescimento de outras bactérias.Ex: ágar Sabouraud dextrose, pH 5,6, é utilizado no crescimento de fungos que são favorecidos, em relação as bactérias, pelo baixo pH.Ágar sulfeto de bismuto: isolamento da bactéria causadora do tifo Salmonella typhi (gram-negativa). Este meio inibe o crescimento das outras bactéria gram-negativas e das gram-positivas.
- meio diferencial: facilita a identificação de um determinado organismo.Ex: meio ágar-sangue, utilizado para a identificação de bactérias capazes de destruir células sangüíneas (anel claro em torno da colônia).Streptococcus pyogenes – infecções de garganta.
MEIO DE CULTURA
MEIO DE ENRIQUECIMENTO:
favorece o desenvolvimento de uma população bacteriana que esta em desvantagem entre outras populações.
MEIOS REDUTORES:
meios com reagentes, como o tioglicolato de sódio, que é capaz de se combinar com o oxigênio dissolvido eliminando este elemento do meio de cultura (específico para microrganismosanaeróbicos).
Propósito dos principais tipos de meios de cultura
Tipo Finalidade
Quimicamente 
definido
Crescimento de quimioautotróficos e autotróficos e 
análises microbiológicas.
Complexo Crescimento da maioria dos organismos quimio-heterotróficos.
Redutor Crescimento de anaeróbicos obrigatórios.
Seletivo
Impedir o crescimento de microrganismos não 
desejados; favorecer o crescimento do organismo 
de interesse.
Diferencial Diferenciar as colônias do organismo de interesse dos outros organismos.
Enriquecimento
Semelhante ao seletivo, mas com a característica 
importante de aumentar o número da bactéria de 
interesse tornando-a detectável.
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS
- DIVISÃO BACTERIANA:
- FISSÃO BINÁRIA- BROTAMENTO
- TEMPO DE GERAÇÃO:
- FASES DE CRESCIMENTO:
- FASE lag- FASE log- FASE ESTACIONÁRIA- FASE DE MORTE CELULAR
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS
DIVISÃO BACTERIANA: 
é considerado o aumento do número de indivíduos e não do tamanho celular.
1. BROTAMENTO: < nº de bactérias (forma um broto que quando atinge o tamanho da célula parental se separa)
2. FISSÃO BINÁRIA:
(1) alongamento da célula e a replicação do DNA cromossomal;(2) início da invaginação da parede celular e da membrana plasmática;(3) em um determinado momento, as duas seções da parede celular de encontram;(4) produção de duas células individuais idênticas à célula mãe. 
Figura 6
Fissão Binária
(Adaptado de Tortora, G.J., et al., Microbiology,2003)
Figura 6. Fissão binária bacteriana.
CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS
TEMPO DE GERAÇÃO: 
é o tempo necessário para uma célula se dividir (e sua população dobrar de tamanho). 
- tempo varia de acordo com o organismo;- depende das condições ambientais (nutricionais, temperatura etc);- maioria das bactérias: 1 – 3 h 
Divisão celular: o número de bactérias dobra a cada geração:
1 geração (21) = 2 células5 gerações (25) = 32 células10 gerações (210) = 1024 células...
FASES DE CRESCIMENTO 
CURVA DE CRESCIMENTO: 
demonstra o crescimento das células durante um período de tempo.
curva de crescimento obtida pela contagem da população em intervalos de tempo após um inóculo de um número pequeno de bactérias em meio de cultura. 
FASE lag: pouca ou ausência de divisão celular (fase de adaptação) - ≥ 1 hora(estado de latência, com intensa atividade metabólica)FASE log: início do processo de divisão (período de crescimento ou aumento logarítmo – FASE DE CRESCIMENTO EXONENCIAL)(reprodução celular extremamente ativa, sensíveis as mudanças ambientais - * EFEITO DE ANTIBIÓTICOS)FASE ESTACIONÁRIA: velocidade de crescimento diminuinº de células vivas = nº de células mortasFASE DE MORTE CELULAR: nº de células mortas excede o de células novas.
Figura 7
Figura 7. Curva de crescimento bacteriano mostrando as 4 fases típicas.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO
 Alguns métodos determinam o número de células, outros analisam a massa total da população (que é diretamente proporcional ao número de células).
QUANTIFICAÇÃO DIRETA: 
- CONTAGEM EM PLACAS- FILTRAÇÃO- MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL- CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:
- TURBIDIMETRIA- ATIVIDADE METABÓLICA- PESO SECO
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO DIRETA: 
(1) CONTAGEM EM PLACAS
- técnica mais utilizada na determinação do tamanho da população bacteriana;
VANTAGEM: quantificação de células viáveis
DESVANTAGEM: tempo (24 h para o aparecimento das colônias visíveis em placa)
- Este método considera que cada colônia é originada do crescimento e da multiplicação de uma bactéria;- As contagens em placas são chamadas de unidades formadoras de colônias (UFC). Figura 8
Cálculo:
nº de colônias naplaca x índice dediluição da amostra =nº de bactérias/mL
-DILUIÇÃO SERIADA
-MÉTODO DEESPALHAMENTO EMPLACA
Figura 8. Contagem em placas e diluição seriada
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO DIRETA: 
(2) FILTRAÇÃO
- nº de bactérias muito pequeno = pode ser utilizado o método de filtração para a sua contagem.
- concentração de bactérias sobre a superfície de uma membrana de filtro de poros muito pequenos após a passagem de um volume de 100 mL de água.
- filtro posteriormente transferido para uma placa de petri contendo meio sólido.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO DIRETA: 
(3) O MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
- utilizado para microrganismos que não crescem bem em meio sólido. Ex.: bactérias quimioautotróficas nitrificantes)
A) diluição a partir de um alto volume de inóculo (ex. 10 mL)B) diluição a partir de um médio volume de inóculo (ex. 1 mL)c) diluição a partir de um baixo volume de inóculo (ex. 0,1 mL)d) contagem do nº de tubos positivose) estimativa do nº de células/mL de bactérias Figura 9
10 mL de inóculo
1 mL de inóculo
0,1 mL de inóculo
6 tubos positivos (com crescimento bacteriano)
3 tubos positivos
1 tubos positivos
Figura 9. Método do número mais provável (NMP)
6
3
1
Figura 9. Método do número mais provável (NMP)
Tabela de combinações (NMP)
6-3-1 
Índice de NMP/100 mL = 110
Inferior = 40
Superior = 300
Confiabilidade de 95%
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO DIRETA: 
(4) CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO
- um volume conhecido de suspensão bacteriana é colocado em uma área definida da lâmina de microscópio.
- a amostra pode ser corada ou analisada a fresco.
- utilizam câmaras de contagem
DESVANTAGENS: - não separa células mortas e vivas- pode haver erros de contagem- difícil contagem para bactérias móveis Figura 10
Figura 10. Utilização da câmara de contagem Petroff-Hausser.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: 
(1) TURBIDIMETRIA
- monitoramento do crescimento bacteriano através da turbidez
- espectrofotômetro (660 nm): um feixe de luz é transmitido através da suspensão bacteriana para um detector fotossensível.
(2) ATIVIDADE METABÓLICA
- quantidade de um certo produto (como ácido ou CO2) é diretamente proporcional ao número de células bacterianas.
Figura 11
A quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao nº. de bactérias.
Quanto > o nº. de bactérias < a quantidade de luz que é transmitida 
Figura 11. Determinação do nº de bactérias por turbidimetria.
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO 
QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: 
(3) PESO SECO
- principalmente para fungos filamentosos
a) fungo é removido do meio por filtraçãob) seco em dessecadorc) posterior pesagem.