ELETROFORESE EM AGAROSE (1)

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Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos
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Eletroforese em gel 
	Técnica de separação de moléculas que envolve a 	migração de 	partículas em um determinado gel 	durante a aplicação	de uma diferença de potencial. 
As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, 	pois as de menor massa irão migrar mais 	rapidamente. 
Em alguns casos, o formato da moléculas também influi, pois 	algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel.
A eletroforese normalmente é utilizada para separar 	proteínas e moléculas de DNA e RNA.
Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos
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A análise de DNA por eletroforese é uma das técnicas 	fundamentais nos 	laboratórios de pesquisa e de 	diagnóstico.
O princípio é baseado no fato da molécula de DNA possuir 	carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e 	quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel 	submetida a um campo elétrico, migra em direção ao 	pólo positivo (anôdo). 
A velocidade da migração depende do tamanho da molécula. 	Por isso em um dado momento da eletroforese 	moléculas de tamanhos distintos se encontram em 	diferentes pontos da matriz.
Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos
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Matriz - agarose ou poliacrilamida – 
Depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se 	pretende separar e visualizar. 
Devido à diferença no tamanho dos poros dessas matrizes:
	Gel de agarose para a separação de fragmentos que 	variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases)
 	Gel de poliacrilamida para separação de fragmentos 	pequenos, de até 1kb.
Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos
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Agarose - mistura de um tampão e agarose, não tóxica. 
Polimerização é mais rápida e o gel pode ser reciclado após o 	uso, isto é, pode ser reutilizado na elaboração de 	outros géis. 
Usado como método analítico ou preparativo, isto é, quando o 	fragmento de DNA é recuperado e purificado a partir do 	gel.
Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos
CUIDADOS:
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Agarose - 
Desvantagem: Coloração com brometo de etídio (EtBr) -	substância mutagênica. 
É necessária a utilização de transiluminador de luz ultravioleta.
Eletroforese em Análise de Ácidos Nucleicos
CUIDADOS:
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Gel de Agarose
Poço
Gel agarose
Solução Tampão
Pente
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Gel de Agarose
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Gel de Agarose
Agarose
É um polissacarídeo extraído de algas marinhas, formado por resíduos de D e L galactose unidos por ligações glicosídicas α (1-3) e β (1-4), é um material gelatinoso e semelhante a gelatina incolor.
Forma uma rede que segura as moléculas durante a migração.
Separa moléculas com diâmetro igual ou superior a 10 nm.
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Gel de Agarose
Rede é formada pela solidificação de um polímero 	linear com filamentos finos entrelaçados
Agarose: Colóide natural
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Gel de Agarose
A agarose é dissolvida em água fervendo e forma um 	gel quando esfria.
Formação de duplas hélices que se juntam 	lateralmente.
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Gel de Agarose
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Gel de Agarose
Um fragmento de DNA possui uma mobilidade eletroforética 	que decresce em proporção ao logaritmo do seu tamanho 	em pares de bases.
Fragmentos maiores movem-se mais lentamente.
Essa proporcionalidade depende:
 -	concentração do gel de agarose 
 -	composição do tampão de corrida
 - condições eletroforéticas
 Diferentes concentrações de agarose permitem uma separação eficiente de diferentes tamanhos de DNA.
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Gel de Agarose
Tamanho dos poros do gel de agarose: 
	diretamente proporcional ao tamanho do 	fragmento que se deseja separar.
O tamanho do poro, ou a porosidade do gel é definido pela concentração do gel.
Quanto menor for a concentração do gel maior será a 	porosidade e, portanto, maior o fragmento de DNA que 	poderá ser separado
Quanto menor a concentração do gel, mais frágil ele se torna.
Geralmente se trabalha com géis de agarose de 1 a 1,5%, 	dependendo do fragmento de DNA esperado.
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Gel de Agarose
Concentração: dada como peso de agarose 	por volume de água.
				Géis a 1%: 
				poros em torno de 150 nm
				Géis a 0,16%: 
				poros em torno de 500 nm
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Fatores que afetam a migração
Tamanho da molécula
Concentração do gel
Define o tamanho dos poros 
Conformação do DNA
Força elétrica aplicada
Voltagem (Volts)
Corrente (Ampéres)
Força (Watts)
Presença de corantes intercalantes
Composição do tampão
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Gel de Agarose
SOLUÇÕES E REAGENTES 
Tipos de tampões: 
a) TAE (Tris-acetate-EDTA electrophoresis buffer – Tampão de eletroforese-Tris-acetato-EDTA) 
b) TPE (Tris-phosphate-EDTA electrophoresis buffer – Tampão de eletroforese-Tris-fosfato-EDTA) 
c) TBE (Tris-borate-EDTA electrophoresis buffer – Tampão de eletroforese-Tris-borato-EDTA) 
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Gel de Agarose
Tampão de carregamento (loading buffer): 
Misturado às amostras antes de aplicar no gel.
Finalidades: 
1) Aumentar a densidade da amostra
 
2) Adicionar cor às amostras
Coloração do gel: 
Brometo de etídeo (agarose e poliacrilamida) 
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Antes da aplicação, as amostras de DNA deverão ser
	misturadas a um tampão de amostra. 
Contém corantes e reagentes de alta densidade 
	(sacarose, glicerol ou ficol). 
Asseguram que a amostra de DNA entre no poço pela força 	da gravidade. 
Corantes azul de bromofenol e o xileno cianol, facilitam a 	aplicação da amostra no gel (acrescentam cor na 	amostra) e auxiliam no monitoramento da corrida, já 	que apresentam velocidade conhecida durante a 	migração na matriz em direção ao pólo positivo.
Aplicação das amostras:
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Estimativa visual do tamanho dos fragmentos de DNA é 	necessário aplicar em um dos poços o marcador de 	 	massa molecular (ladder).
	Ladder é uma mistura de diversos fragmentos 
		de DNA de tamanhos e concentrações 
		conhecidos, gerados a partir da digestão de 			plasmídeos (DNA circular -	bactérias) com 			enzimas de restrição. 
	Permite inferir, por comparação, o tamanho dos 			fragmentos presentes na amostra analisada.
	Ladder 1kb -13 fragmentos (0,3 a 10 kb)
	Ladder 100bp -14 fragmentos (0,1 a 5 kb)
	
Tamanho dos fragmentos 
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Gel de Agarose
Corantes:
EtBr - brometo de etídeo 
Intercala-se com a molécula de DNA a cada 2,5 bp do 	fragmento. Após sua inserção esse exerce uma 	ligação do tipo van der Waals. 
Radiação UV - capaz de estimular essa ligação entre 	o DNA e o corante tornando a banda visível no gel 	através de um dispositivo de transiluminação. 
Brometo de etídeo é mutagênico!!!
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Gel de Agarose
EtBr - brometo de etídeo
A intensidade de fluorescência emitida é proporcional à 	concentração de DNA presente na amostra.
 
	Pode ser utilizado de 3 diferentes formas:
	
			- aplicado diretamente no gel
			- no tampão da amostra
			- após a corrida quando o gel é 					submergido em solução de EtBr.
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VDS
Transiluminador
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Gel de Agarose
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Gel de Agarose
SYBR Green I
Corante intercalante que pode detectar até 20pg de DNA-dupla fita
Brometo: 1 a 10 ng de DNA, no mínimo, para dar sinal fluorescente
Sensibilidade 50 a 100 vezes maior 
	que o brometo
Menos mutagênico
Corantes:
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Gel de Agarose
SYBR Green I
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