Cromatografia

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Prof. Valmir F. Juliano
QUI624
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
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Classificação dos métodos analíticos
CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS
Baseados em propriedades físicas (químicas em alguns casos )
*Separação: interações físico-químicas.
 Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou elétricas.
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Histórico
Cromatografia
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados.
1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)
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Definição - Princípio Básico
Cromatografia é um método físico-químico de separação de misturas, identificação e quantificação de seus componentes. 
A separação depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel e com a fase estacionária. 
A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade.
A identificação se dá mediante a comparação da interação de padrões com as fases estacionárias.
A quantificação é feita também pela comparação com padrões de concentrações conhecidas, através de curvas analíticas.
Cromatografia
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Classificação das técnicas cromatográficas
 De acordo com o sistema cromatográfico
Em Coluna
Cromatografia Líquida
Cromatografia Gasosa
Cromatografia Supercrítica
Planar
Centrífuga (Chromatotron®)
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Cromatografia em Papel (CP)
Cromatografia
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Classificação das técnicas cromatográficas
 De acordo com a fase móvel
Utilização de Gás
Cromatografia Gasosa (CG)
Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)
Utilização de Líquido
Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Utilização de Gás Pressurizado
Cromatografia Supercrítica (CSC)
Cromatografia
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Classificação das técnicas cromatográficas
 De acordo com a Fase Estacionária
Líquida
Sólida
Quimicamente Ligadas
 De acordo com o modo de separação
Por Adsorção
Por Partição
Por Troca Iônica
Por Afinidade
Cromatografia
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Classificação das técnicas cromatográficas
Cromatografia
Técnica
Planar
Coluna
FM
FE
CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE
Tipo de cromato-grafia
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Analogia
O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região.
Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as moscas e abelhas.
Cromatografia
Fase estacionária
Analitos
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Analogia
Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionária pode ser suficiente para alterar completamente a ordem de eluição de componentes da mistura.
Cromatografia
Fase estacionária
Analitos
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Cromatografia
Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
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Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Fase estacionária líquida suportada na celulose.
Fase móvel
Separação
Cromatografia
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.
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Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Cromatografia
Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.
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Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica.
Cromatografia
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Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Termos e parâmetros técnicos
Cromatografia
s
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Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
FASES ESTACIONÁRIAS
Sílica (SiO2)
Alumina (Al2O3)
Celulose
Poliamida
Ativação de 30 a 60 min
de 105 a 110 oC
Ativação de 10 min
a 105 oC
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Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
ANÁLISE QUALITATIVA
 Comparação com valores de Rf tabelados
 Comparação com padrão eluído em conjunto
 Extração e aplicação de métodos instrumentais
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Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Amostra não contém a espécie B
Amostra pode conter a espécie A
Para se certificar da presença, 
eluir em outros solventes
Conclusões:
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Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Solvente 1
Solvente 2
Cromatografia Bi-dimensional
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Cromatografia planar
Cromatografia
Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada centrifugamente. Pode substituir pequenas colunas e HPLC.
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PROCESSOS DE SEPARAÇÃO
Exclusão
Adsorção
Partição
Troca Iônica
Afinidade
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
ADSORÇÃO
- Fase Móvel Líq. ou Gás
- Fase Estacionária Sólida
Processos de 
Adsorção/Dessorção
Ligações de hidrogênio; 
Forças de Van der Waals
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Diferença entre Absorção e Adsorção
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
ADSORÇÃO
Fase Estacionária Sólida:
Polar
Aumento da Atividade
-CO2H > -OH > -NH2 >
-SH > -CHO > -C=O >
-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < 
Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno < 
Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico <
Acetato de Etila < Acetona < Etanol < 
Metanol < Ácido Acético
SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente
A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo:
 Função solvente
 Solubilizar os componentes 
 Ter baixo ponto de ebulição
 Função eluente
 Conduzir os componentes da mistura pela coluna
 Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Usos:
 Laboratórios de química orgânica  separar e purificar reagentes e materiais obtidos em síntese.
 Laboratórios de produtos naturais  escala preparativa e analítica.
 Laboratórios de análises clínicas  separação de esteróides de urina ou de sangue, etc.
ADSORÇÃO
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIÇÃO
Fase Móvel Gasosa
Fase Estacionária Líquida
Processos de Solubilidade
O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua volatilidade.
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIÇÃO
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária Líquida
Processos de Solubilidade
O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua solubilidade.
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
TROCA IÔNICA
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária Sólida
Processos de Troca Iônica
Adsorção reversível e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo trocador da matriz
Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de extraordinário valor em processos analíticos.
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Maior Interação
 Íons de alta carga
 Íons de menor tamanho
TROCA IÔNICA
Resinas Catiônicas 
e Aniônicas
FE altamente carregada
Fluxo da FM
A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser controlada por pH e força iônica
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária em Gel
Enquanto as partículas menores penetram nas cavidades, as maiores vão sendo eluídas contornando as estruturas moleculares da FE. 
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis.
- Separação de tamanhos específicos
- Separação de polímeros e proteínas
- Determinação de Massa Molar
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
Características desejáveis para os Géis
Inércia Química:
Não pode haver uma interação química entre a matriz e o soluto.
Estabilidade:
O gel deve suportar uso contínuo quanto mantido em condições brandas de temperatura e pH.
Baixo teor de íons:
Grupos carregados interferem no processo de separação.
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
Tipos de Géis
Dextrano (Sephadex)
Poliacrilamida
Ágar e Agarose
Fluxo da FM
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Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária Sólida
Propriedades 
Biológicas e
Funcionais
AFINIDADE
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Cromatografia
Teoria Básica
SOLUTO
FASE ESTACIONÁRIA
FASE MÓVEL
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Teoria Básica
Cromatografia
Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase móvel:
KC = Constante de Distribuição
[A]FE = concentração do analito na FE
[A]FM = concentração do analito na FM
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Quantificação da eficiência
Cromatografia
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM:
O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por:
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Quantificação da eficiência
Cromatografia
ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H) 
“Tamanho” de cada estágio de equilíbrio
Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes
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Cromatografia em fase gasosa
Fase estacionária
Fase móvel
Separação
Cromatografia
Detecção
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Cromatografia em fase gasosa
Cromatografia
Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à temperaturas controladas
Fase móvel: gás inerte
Detector: submetido à temperatura controlada
Injetor: submetido à temperatura controlada
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Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejam
VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás.
DE FORMA GERAL:
	CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis.
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Requisitos - Gás de arraste (FM)
INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em gases e seus efeitos:
Cromatografia Gasosa
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Requisitos - Gás de arraste (FM)
CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.
COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento.
Cromatografia Gasosa
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Injetor
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica
Injeção instantânea:
Injeção lenta:
Cromatografia Gasosa
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Injetor “on column”
1 - Septo (silicone)
2 - Alimentação de gás de arraste)
3 - Bloco metálico aquecido
4 - Ponta da coluna cromatográfica
Cromatografia Gasosa
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Injetor “on column”
Cromatografia Gasosa
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Parâmetros de injeção
Cromatografia Gasosa
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição.
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil.
VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra.
Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução
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Cromatografia Gasosa
LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
Microsseringas para injeção
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Cromatografia Gasosa
Colunas
EMPACOTADA
 = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio)
CAPILAR
 = 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de m) de FE líquida ou sólida
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Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO)
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Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG
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Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
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Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:
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Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
Isotérmico a 45 ºC;
isotérmico a 145 °C; 
programado de 30 ºC a 180 ºC
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Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
Possíveis problemas associados à PLT:
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Cromatografia Gasosa
Fase Estacionária
REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)
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Cromatografia Gasosa
Fase estacionária sólida
 O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO
 Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros)
 Solutos polares
 Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)
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Cromatografia Gasosa
Fase estacionária líquida
 O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO
 Filmes espessos de FE líquida
 Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste
 Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade)
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Cromatografia Gasosa
Fase estacionária quirais
 As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO SIMILARES  FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros óticos.
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Cromatografia Gasosa
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste.
Características ideais:
Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
Boa estabilidade e reprodutibilidade.
Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza.
Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400 ºC.
Tempo de resposta curto e independente da vazão.
Alta confiabilidade e facilidade de uso.
Similaridade de resposta para todos os solutos.
Não destrutivo.
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Cromatografia Gasosa
Detectores
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA
Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.
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Cromatografia Gasosa
Detectores
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Cromatografia Gasosa
Detectores - Funcionamento
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Cromatografia Gasosa
Detectores – Limites de detecção
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Cromatografia Gasosa
Detectores – Espectrometria de massas
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Cromatografia Gasosa
Cromatograma de íons totais: TIM ou TIC
Em cada posição do cromatograma tem-se um espectro de massa.
Detectores – Espectrometria de massas
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Cromatografia
Gasosa
Cromatograma de íons selecionados: SIM
Em cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada.
Oferece a vantagem de registrar somente o sinal do constituinte de interesse, sendo “cego” para os demais.
Detectores – Espectrometria de massas
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Cromatografia Gasosa
Separador Molecular
O gás de arraste leve (He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vácuo.
Câmara
de Ionização
Coluna
Capilar
Interface Capilar Direta
Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser drenada pelo sistema de vácuo.
Detectores – Espectrometria de massas
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Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico)
tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)
tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)
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Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm
Detector FID: 250 ºC
Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC 
Volume injetado: 1 mL
Como se explica esta ordem de eluição?
Mistura de benzeno, n-propanona, n-propanol, n-butanol, isobutanol e n-pentanol.
 A n-propanona elui primeiro devido à sua maior volatilidade.
 O benzeno em segundo devido sua natureza apolar (menor e).
 Para os demais compostos, cujas diferenças de polaridade não são elevadas, a volatilidade se torna o principal parâmetro que define a ordem de eluição.
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Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é:
 Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois a banda necessita ser perfeitamente simétrica.
 Área da banda cromatográfica.
Altura
Área
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Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
amostra
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Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação da reta na região linear:
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Cromatografia Gasosa
amostra
concentração
na amostra
Análise quantitativa
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Cromatografia em fase líquida
Cromatografia Líquida
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Cromatografia Líquida - CLAE
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CLAE ?
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000.
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido.
DE FORMA GERAL:
	CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica.
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Cromatografia Líquida
Tipos e Aplicações da Cromatografia Líquida
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Componentes típicos - CLAE
Cromatografia Líquida
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Cromatografia Líquida
Esquema de um equipamento para CLAE
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Cromatografia Líquida
Requisitos dos sistemas de bombeamento
1 – Geração de pressões até 6.000 psi
2 – Saída com ausência de pulsos
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min
4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor
5 – Componentes resistentes à corrosão
Bomba recíproca (também são chamadas de bombas de pistão ou de diafragma)
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Cromatografia Líquida
Suportam pressões de até 7.000 psi
Volumes típicos: 5 a 500 mL
Microamostragem: 0,5 a 5 mL
Sistemas de injeção de amostras
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 Eluição isocrática:
Quando a separação é feita utilizando um único solvente de composição constante. 
 Eluição com gradiente:
São utilizados dois ou três sistemas de solventes que diferem bastante entre si em polaridade.
Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é variada de modo programado, de forma contínua ou em passos.
Cromatografia Líquida
A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura na CG.
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação.
Fase móvel para CLAE
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Cromatografia Líquida
Eluição com gradiente
Coluna C18, 5 mm, fase reversa
Detector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm
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Cromatografia Líquida
Colunas para CLAE
As colunas geralmente são construídas de aço inox, embora tubos de vidro com paredes resistentes sejam encontrados ocasionalmente. No entanto, estes últimos são restritos a pressões mais baixas do que 600 psi.
Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
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Cromatografia Líquida
Colunas para CLAE
Pré-coluna 
Remoção de material particulado
Contaminantes do solvente
Contaminantes da amostra
Saturar a FM com a FE
Aumenta a vida útil da coluna
COLUNAS TÍPICAS
Material: aço inox
Comprimento: 10 a 30 cm
Diâmetro: 4 a 10 mm
FE: Partículas de 5 a 10 mm
Eficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro
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Cromatografia Líquida
Separação isocrática de alta velocidade
1– p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato
100.000 pratos/metro
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 Pelicular:
 Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 mm, recoberto com uma camada fina e porosa de:
 Sílica
 Alumina
 Resina de poliestireno-divinil-benzeno
 Resina trocadora de íons
 Partícula porosa:
 Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 mm. As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular.
Cromatografia Líquida
Basicamente são dois tipos de FE:
Fase estacionária para CLAE
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Cromatografia Líquida
Detectores
	As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG.
	Existem dois tipos de detectores: 
 Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante dielétrica).
 Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).
Características ideais:
Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
Boa estabilidade e reprodutibilidade.
Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza.
Tempo de resposta curto e independente da vazão.
Alta confiabilidade e facilidade de uso.
Similaridade de resposta para todos os solutos.
Não destrutivo.
Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.
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Cromatografia Líquida
Detectores
 Absorbância
 UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105
 IV
 Fluorescência – S: 10-9 a 10-12 g/mL – FL: 103
 Índice de refração (universal) –
S: 10-7 g/mL – FL: 104
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Cromatografia Líquida
Detectores
 Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
 Amperométricos
 Coulométricos
 Condutométricos – S: 10-8 g/mL – FL: 104
 Polarográficos – S: 10-12 g/mL – FL: 106
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Cromatografia Líquida
Detectores
 Espectrometria de massa - universal
 Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação
 Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.
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Cromatografia Líquida
Detectores
 Espectrometria de massa
TIC
SIM
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Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o processo de separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os componentes da amostra.
Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG.
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Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
 PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do suporte
do empacotamento  Adsorção e ligação química. Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversa.
Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água)
		 FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico)
	O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel na fase móvel.
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos)
		 FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila)
	O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.
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Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
 É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)
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Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
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Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
 ADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou alumina. É a forma clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de HPLC.
 TROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com capacidade de troca iônica. 
 EXCLUSÃO: líquido-gel. FE gel. Um material polimérico, hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas, são capazes de promover a separação de acordo com os tamanhos das moléculas  EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS.
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Para refletir e responder:
Duas substâncias diferentes com a mesma concentração apresentarão a mesma área sob suas bandas cromatográficas?
Cromatografia
Para um mesmo analito, a área ou altura aumentam com o aumento da concentração. A área sob a banda cromatográfica de duas substâncias diferentes dependerá da resposta do detector para aquele tipo de substância, independentemente do tipo de detector utilizado.
*
Para refletir e responder:
A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de analito?
A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os casos em que isto ocorre?
Cromatografia
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F I M