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Bioquímica Clínica II Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas CCS - UFSM � Proteínas especializadas com atividade catalítica. São unidades funcionais e reguladoras do metabolismo celular ENZIMASENZIMASENZIMASENZIMAS � ativam reações químicas específicas � permanecem inalteradas durante toda a reação � não alteram o equilíbrio da reação interação enzima ���� substrato centro ativo especificidade e atividade catalítica das enzimas Cada enzima catalisa uma reação ⇒ integridade de sua estrutura � Atividade biológica da enzima ♦não são alteradas ou consumidas durante as reações ♦aceleram a velocidade de uma reação, sem no entanto participar dela como reagente ou produto ♦ atuam como reguladoras de reações ♦ não alteram a constante de equilíbrio da reação As enzimasAs enzimasAs enzimasAs enzimas ♦todas as reações que caracterizam o metabolismo celular são catalisadas por enzimas �Atuam em condições suaves de temperatura e pH �Possuem todas as características das proteínas �Estão dentro da célula compartimentalizadas �Atuam em concentrações muito baixas �Podem ter sua atividade regulada Lpl-coag. � Sítio Ativo: local onde ocorre a reação (onde o substrato se aloja) � Substrato: reagente da reação catalizada � Produto: substância produzida após a reação ser catalizada Termos Utilizados em Enzimologia E + S →→→→ ES →→→→ P + E ���� catalisadores proteicos de origem biológica aumenta a velocidade da reação química não é alterado de modo permanente COMPLEXO ENZIMA-SUBSTRATO As enzimas são muito específicas para os seus substratos; Esta especificidade pode ser relativa a apenas um substrato ou a vários substratos ao mesmo tempo esp. de grupo •Esta especificidade se deve à existência, na superfície da enzima de um local denominado SÍTIO DE LIGAÇÃO DO SUBSTRATO é um arranjo tridimensional especial dos aa de uma determinada região da molécula (ideal espacial e eletricamente para a ligação do mesmo). � Atividade catalítica das enzimas - sistema chave-fechadura Alguns modelosAlguns modelosAlguns modelosAlguns modelos procuram explicar a procuram explicar a procuram explicar a procuram explicar a especificidade substrato/enzima:especificidade substrato/enzima:especificidade substrato/enzima:especificidade substrato/enzima: SSSSíííítio Ativotio Ativotio Ativotio Ativo SÍTIO CATALÍTICO ou SÍTIO ATIVO ocorre a reação enzimática IsoenzimasIsoenzimasIsoenzimasIsoenzimas Enzimas com funfunfunfunçççções idênticasões idênticasões idênticasões idênticas – com pequenas diferenças estruturais São formas moleculares múltiplas de uma enzima que: •Realizam a mesma ação catalítica •Ocorrem na mesma espécie animal •Podem ser separadas eletroforeticamente Nomenclatura das enzimasNomenclatura das enzimasNomenclatura das enzimasNomenclatura das enzimas:::: União Internacional de BioquUnião Internacional de BioquUnião Internacional de BioquUnião Internacional de Bioquíííímica (UIB)mica (UIB)mica (UIB)mica (UIB) padronização Nome sistemático Descreve a reação catalisada e tem associado um número de designação Nome alternativo (trivial) -nome de uso rotineiro -pode ser idêntico ao sistemático 1.Nome sistemático: descreve a natureza da reação catalítica, associado um código numérico Ex.: D-glicose-6-fosfato fosfohidrolase 2. Nome Trivial Glicose 6-fosfatase Número de classificação: EC 3.1.3.9 Classe (3,hidrolase),sub-classe (1,atua sobre ligações éster),sub-subclasse (3,fosforil monoéster hidrolase), número da enzima na sub-subclasse(9) EC = EC = EC = EC = EnzymeEnzymeEnzymeEnzyme ComissionComissionComissionComission (UIB) Nomenclatura das enzimas: CLASSIFICAÇÃO DE ACORDO COM O TIPO DE REAÇÃO QUE CATALISAM: OXI-REDUTASES: Transferem H do doador para um receptor; catalisam reações de oxido-redução. lactato + NAD+ → piruvato + NADH + H+ LDHLDHLDHLDH TRANSFERASES: Catalisam a transferência de um grupo amino carboxilo, glicosil, metil ou fosfato de uma molécula para outra Ex.: AST(TGO), ALT (TGP), GGT,CK FATORES QUE GOVERNAM AS REAÇÕES CATALISADAS POR ENZIMAS �Concentração da enzima �Concentração do substrato Velocidade global da reação � proporcional à [ ] do complexo ES Velocidade da reação proporcional à [ ] do substrato em valores baixos do substrato As velocidades das reações enzimáticas são afetadas pelas alterações nas [ ] de ativadores (↑) ou inibidores (↓) Ativadores promovem a formação do estado mais ativo da enzima → � a velocidade da reação Inibidores: diminuem a velocidade da reação ou a impedem Velocidade da reação depende �pH �Tipo de tampão �Temperatura �Natureza do substrato �Concentração de ativadores A determinação das enzimas em amostras de soro condições definidas e controladas ⇒ método sensível e específico Os ensaios enzimáticos devem ser executados no pH da atividade ótima Efeito do pH na velocidade da reação Efeito da temperatura sobre a velocidade da reação A temperatura ótima aparente depende do tempo necessário para determinar a atividade � 30 ou 370 C Velocidade da reação enzimática em função do tempo C u r v a d e a t iv id a d e e n z im á t ica b a 0 1 2 3 4 5 T e m p o ( m in u to s ) A tiv id a de En zi m át ic a (p ro du to fo rm a do ) Desnaturação: enzimas podem enzimas podem enzimas podem enzimas podem perder a conformação e consequentemente sua atividade em certas ocasiões como: • extremos de pH, •altas temperaturas, •presença de metais pesados, • agitação excessiva Método Colorimétrico: substâncias coloridas formadas durante o ensaio enzimático (400 a 700nm) Método Cinético: substâncias incolores que absorvem energia na região do ultravioleta (UV= 180 a 399nm) Dosadas por sua ATIVIDADE e não por sua [ ] Finalidade diagnóstica Qto. > n0 de células lesadas nos tecidos > atividade enzimática no soro Alta atividade enzimática nas células → pequena qtidade. no plasma gradiente de concentração (intra e extracelular) Aumento na liberação de enzimas para o plasma Lesão celular extensa •Isquemia •Toxinas celulares Proliferação celular e aumento na renovação celular Crescimento, restauração óssea após fraturas↑ FAL Aumento na síntese enzimática ↑ γ glutamil-transferase após ingestão álcool Obstrução de ductos Amilase e lipase – corrente circulatória (ducto pancreático-biliar bloqueado) ALTERAÇÕES DA PERMEABILIDADE CELULAR: Enzimas saem da célula → nível sérico Indicadores sensíveis de lesão ou proliferação celular CONCENTRAÇÃO ENZIMÁTICA NO SORO ATIVIDADE SÉRICA MEDIDA Enzimas – localização Podem ser encontradas em baixas concentrações em líquidos corporais, como: Plasma, LCR, urina, exsudatos Nos líquidos corporais as enzimas são provenientes principalmente de processo normal de destruição e reposição celular DISTRIBUIÇÃO NO ORGANISMO ENZIMA PLASMA - ESPECÍFICAS: �ativas no plasma � executam suas funções no sg. Ex.: utilizadas no mecanismo de coagulação sanguínea ⇒ protrombina fator XII, fator X e outros ENZIMA DAS GLÂNDULAS EXCRETORAS �secretadas por glândulas na forma inativa e após ativação atuam em locais extracelulares. Não tem função no plasma. Ex.: alfa amilase das glândulas parótides (saliva) e exócrinas do pâncreas (suco pancreático). Se estas enzimas estiverem presentes no soro será um DESVIO da secreção destas enzimas. ENZIMAS INTRACELULARES �Não tem função no plasma ⇒só tem função dentro da célula são liberadas a partir de tecidos lesados por alguma doença no plasma → patologia – desvio ex.: TGO e TGP → plasmamembrana celular está alterada UNILOCULAR: presentes em um só local da célula Ex.: ALT (=GPT) - citoplasma de todas as céls. BILOCULAR: presentes em dois locais da célula. Ex.: AST(=GOT) mitocôndria e citoplasma Quanto maior a extensão do tecido lesado, maior o aumento do nível plasmático As enzimas não específicas/oriundas do plasma são depuradas em velocidades distintas, dependentes de sua estabilidade Através do extravasamento do conteúdo celular para a corrente sanguínea = alterações de atividade enzimática no sangue = DIAGNÓSTICO APLICAÇÃO DIAGNÓSTICA Ajudam � localizar lesão tecidual �monitorar o tratamento e � o progresso da doença Enzimologia clínica Aplicação da ciência das enzimas ao diagnóstico e tratamento das doenças PRINCIPAIS ENZIMAS DE INTERESSE DIAGNÓSTICO CLÍNICO αααα - 1, 4 – glucan – 4 – glucanohidrolase – EC 3.2.1.1 AMIDOAMIDOAMIDOAMIDO -----------------------------> maltosemaltosemaltosemaltose AMS AMILASE Secretada pelas glândulas salivares e pâncreas Hidrolases → desdobram moléculas de polissacarídios Amilases catalisam a hidrólise da amilopectina, da amilose e do glicogênio Em sangue e urina de indivíduos normais são principalmente de origem: Pancreática:isoenzima P-amilase Salivar:isoenzima S-amilase São metaloenzimas: requerem cálcio para sua atividade catalítica Tempo meia-vida biológica: 4 – 5 h # RN → ams sérica nula começa ser detectada nos primeiros 2 meses de vida e alcança os níveis de adulto a partir de 1 ano. glandular excretora ⇒ no plasma é DESVIODESVIODESVIODESVIO Importância clínica investigação da função pancrepancrepancrepancreááááticaticaticatica •Diagnóstico de doenças pancreáticas •Pancreatite aguda •20% dos casos de pancreatite aguda podem cursar com níveis normais de amilase •Pancreatite crônica – pouco elevada a AMS PANCREATITE AGUDA: atividade enzimática 3 a 6 h após início sintomas máximo 20 a 30 h Pico de concentração: 12 a 30 h Retorno aos níveis basais: 2 – 4 dias Pancreatite aguda → 3 x valor N Pancreatite severa → até 40 x valor N Urina: eleva 6 a 12 h depois que no soro, permanece alterado por períodos mais longos que os níveis séricos A magnitude da elevação dos níveis séricos não se relaciona com a gravidade da lesão pancreática #álcool 20% dos casos de pancreatite aguda podem cursar com níveis normais de amilase Pancreatite crônica – pouco elevada a AMS •lesão das glândulas salivares, parotidite, perfurações úlcera duodenal no pâncreas; •obstrução intestinal por cálculo biliar, •colelitíase, peritonite, traumatismo abdominal •medicamentos HIPERAMILASEMIAHIPERAMILASEMIAHIPERAMILASEMIAHIPERAMILASEMIA LIPASES Secretada pelo pâncreas para o duodeno para hidrolisar os Tg em ácidos graxos Triacilglicerol acil-hidrolase – EC 3.1.1.3 São enzimas que hidrolisam preferencialmente ésteres de glicerol de AG de cadeia longa �Lipases pancreáticas são enzimas diferentes das lipases de lipoproteínas Importância clínica: Diagnóstico de doenças do pâncreas soro: Início da elevação: 2- 8 h Pico de concentração:12-20 h Retorno aos níveis basais: até 10 dias •É mais específica que a amilase para o diagnóstico de pancreatite •Sensibilidade e especificidade de 80 a 90% •Filtrada e absorvida pelo rim (ausente na urina de pacientes normais) •Não aparece atividade na urina durante a doença pancreática FOSFATASE ALCALINA (FAL) ���� Hidrolisa os ésteres de ácido fosfórico com liberação de P inorgânico em pH 10 Presente em todos os tecidos – membranas celulares �alta concentração nos ossos, fígado mucosa intestinal e células tubulares renais FOSFATASES associada ao processo de calcificação do osso FAL presentes no soros constitui-se de: � adultos N ⇒ origem no fígado pouco – óssea dependentes da idade crianças FAL ���� (intensa atividade osteoblástica) RN = adulto ( ↑ segunda semana) # pH de trabalho é alcalino (por si só é inativa no sg) # A avaliação clínica do resultado da FAL total depende da interpretação de qual isoenzima está elevada pode ser necessário associar com eletroforese Principais isoenzimas de interesse clínico: FAL -1 – fígado FAL- 3- intestino FAL – 2 – óssea placentária - gestantes �HEPATOPATIAS colestases extra e intra-hepática, hepatite viral, dano hepático tóxico �OSTEOPATIAS doenças ósseas → ↑ atividade osteoblástica, doença de Paget , neoplasias ósseas. ↑↑↑↑ FALFALFALFAL Durante o terceiro trimestre de gravidez Até 25% de elevação em indivíduos com elevado Índice de massa corporal
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