Protocolo de extração de DNA para células e tecidos moles utilizando Fenol-Clorofórmio

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Protocolo de extração de DNA para células e tecidos moles utilizando Fenol/Clorofórmio
Transferir as células ou tecido para um microtubo de 2 mL (se estiver sobrenadante em algum líquido, centrifugar por 5 minutos à 3.000 RPM). Se o tecido for duro (osso, cartilagem ou célula vegetal, por exemplo), pode-se macerar o tecido com auxilio de um gral e pistilo limpo ou um processador automático;
Adicionar à amostra 500 µL de tampão STE (100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, e 1mM EDTA - pH 8,0), 30 µL de Sódio Dodecil Sulfato (SDS) à 10% (p/V) e 10 µL de Proteinase K (20 mg/mL);
Incubar em termoagitador à 65ºC por 1 hora a 800 RPM (Se o tecido utilizado for muito grande, incubar por até 3 horas e, para células, 15 minutos já são mais que o suficiente);
Resfriar à 37ºC;
Adicionar 5 µL de RNase (solução pronta disponível comercialmente) e incubar por à 37ºC por 15 minutos a 800 RPM;
Antes de dar prosseguimento, para cada amostra, separe e nomeie mais dois microtubos de 1,5 mL.
Adicionar 500 µL de uma solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (proporção: 25:24:1) e agitar vigorosamente;
Centrifugar por 10 minutos à 13.400 RPM;
Transferir o sobrenadante (aproximadamente 450 µL. OBS: cuidado ao transferir para não aspirar a fase intermediária esbranquiçada que fica entre as fases aquosa e orgânica) para outro tubo de 1,5 mL, acrescentar mais 400 µL de clorofórmio e agitar vigorosamente;
Centrifugar por 10 minutos à 13.400 RPM;
Transferir o sobrenadante para outro microtubo de 1,5 mL, adicionar 30 µL de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e completar para 1 mL com isopropanol.
Agitar vigorosamente e estocar à -20 ºC por no mínimo 3 horas (quanto mais tempo estocado, mais o DNA se precipita e mais DNA é obtido).
Centrifugar à 14.000 RPM por 30 minutos;
Descartar o isopropanol e adicionar 1 mL de etanol 70% (V/V) gelado (OBS: o DNA é uma mancha esbranquiçada muito suave vai ficar concentrado no fundo no tubo. Cuidado para não aspirá-lo e descartá-lo)
Centrifugar a 14.000 RPM por mais 3 minutos;
Descartar o etanol por inversão;
Dar um "spin" na amostra (spin significa atingir a velocidade máxima na centrífuga e parar);
Remover o etanol residual (OBS: Remova o máximo que puder, pois o mesmo pode interferir em reações futuras);
Resuspender o DNA em 30 µL ou 50 µL com água ou tampão TE (10 mM Tris HCl e 1 mM EDTA, pH 8,0) e estocar em freezer -20 ºC até o momento do seu uso.