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metodos de estudo de bacterias bucais resumao

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MÉTODOS DE ESTUDOS DE BACTÉRIAS BUCAIS
Para que isolar os microrganismos? 
Para conhecer os diferentes tipos microbianos
Para se obter informação microbiológica completa e rápida
Para identificar os organismos
Para saber sua suscetibilidade a antimicrobianos
Para descobrir melhor opção terapêutica e de tratamento 
Dificuldades nos estudos de bactérias bucais
Há mais de 700 espécies que podem ser cultivadas
Há, aproximadamente, 30 espécies em um único sítio 
As espécies são difíceis para serem cultivadas e identificadas
As características físicas de sítios de coleta podem dificultar 
Há sítios com progressão ativa diferente nos tempos da coleta
Infecções bucais em geral são infecções mistas e com presença de microrganismos oportunistas.
Para você fazer uma analise de uma bactéria uma analise morfologica não dá identificação de bacterias, são necessarios metodos mais especificos. Pode-se fazer uma cultura (metodos dependentes de cultura) e as vezes eles não são necessarios (metodos independentes de cultura).
Em todos os casos, deve-se coletar uma amostra com assepsia (coletar o material de um sitio sem o resto da microbiota residente), ele deve ser transferido para o laboratorio em condições que se consiga manter a integridade da amostra.
Coleta de material
De Bolsa periodontal: ou um cone de papel esteril que você insere dentro da bolsa periodontal, ou com uma cureta inserida dentro da bolsa. Em ambos os casos o material deve ser colocado em condições que se consiga manter a integridade da amostra.
Na coleta do material (placa subgengival nesse caso) deve-se remover a placa supra gengival e então retirar a amostra. Faz-se um isolamento relativo, seca a area, para então coletar o material.
Na endodontia se você tem uma lesão periapical: coleta diretamente, abrir uma janela e coletar o material. Se faz a antissepsia da mucosa, abre um retalho e colhe o material.
Se for colher do canal radicular, a primeira coisa a fazer é fazer o isolamento absoluto, depois se faz a desinfecção para remover a placa da coroa do dente (com uma solução de H2O2 e depois iodo). Deve-se inativar o antisseptico com tissulfato de sódio a 5% que se liga com o iodo (não pode colher a amostra logo em seguida para não colher junto os materiais usados para a desinfecção, toxicos para a bactéria). Testar a esterilidade da câmara pulpar. Após a abertura do canal radicular com uma lima, se necessário (caso o canal esteja seco), adicionar PBS (solução salina), e introduzir cones de papel sucessivamente.
Meio de transporte
>Para métodos dependentes de cultura:
-condições pré reduzidas
-Não permite o crescimento de microorganismos, mas mantém sua viabilidade
Vai precisar de bacterias viáveis. A maior parte das bactérias orais são anaerobias facultativas ou estritas, então é necessario que o meio de cultura permita essa condição atmosferica, ele vai possuir um indicador de oxido-redução chamado azul de metileno.
>Para métodos independentes de cultura:
-para metodos dependentes de DNA: adicionar substancias que inativam DNAses
-para metodos dependentes de RNA: inativação de RNAses e manutenção da integridade do RNA
Não precisa de bacterias vivas. Faz-se em RNA também pois na endodontia quando você faz uma terapia muitas vezes você lisa a célula e libera o DNA, pois ele se degrada muito mais rapido, logo dará para ter certeza que a bactéria da amostra estava viável.
Processamento de amostra
Diluições seriadas para então inocular no meio de cultura
Semear em meios diferentes
-meios enriquecidos não seletivos (pretende-se que cresça a maior parte da microbiota, não cresce tudo - ex: placa subgengival). Ex: Agar Sangue.
-meios seletivos/diferenciais: seletivos com substancias antimicrobianas que permite a seleção de um grupo de microorganismos. Os meios diferenciais permitem uma diferenciação morfologica nas colonias de microorganismos diferentes permitindo um diagnostico presuntivo. Ex: Agar Mitis Salivarius
Incubação
Pode ter condição de aerobiose, microaerofilia (elimina-se uma parte do O2), anaerobiose
S. Mutans - anaerobios facultativos que exigem uma baixa tensão de O2 e certa condição de CO2
Geralmente as condições de incubação são a 37 graus, em anaerobiose é a mais comum para os microorganismos orais (temperatura do corpo) e em anaerobiose. Ela pode ser feita por meio de dois sistemas de jarrra de anaerobiose, que realiza uma reação quimica na qual o O2 é eliminado, mas essa reação demora a acontecer e nem todas as bacterias anaerobias suportam isso. Ou por camaras de anaerobiose, que possui uma anticamara onde se gera vacuo e injeta um gas livre e oxigenio.
Identificação
>Morfologia e caracteristicas coloniais:
Diametro
Forma
Cor
Hemólise
Fluorescencia
>Padrão microscopico:
Reação ao Gram
Morfotipo
Arranjo celular
Flagelos
Móvel ou imóvel
Após a obtenção de cultura pura identificação por:
>Provas bioquimicas - Determina a especie por meio de caracteristicas do fenotipo do organismo isolado, como capacidade de utilização de substratos, produtos finais, atividades metabolicas. Se tem reação enzimatica (peptoma), se degrada, capacidade proteolitica e de oxidação.
>Imunologicas - Determina a especie por meio de caracteristicas fenotipicas do organismo isolado, como detecção de antigenos de superficie (proteina), proteínas especificas reconhecidas por anticorpos
O anticorpo reconhece uma sequencia de mais ou menos 8 aa. Entra no organismo um microorganismo que possui varias proteinas. essas proteinas são degradadas pelo hospedeiro, e ele vai produzir anticorpos contra sequencias de 8 a 10 aa. não contra todos, contra algumas que são especificas daquele microorganismo e que levam a uma resposta forte.
As bacterias possuem caracteristicas especificas que permitem sua identificação
Ex: Aggregatibacter Actinomycetemcomitans - quando seu material clinico é isolado, é possivel observar uma estrutura interna isolada (pequenos bastonetes gram -)
Porphyromonas e Prevotellas: produtoras de pigmento negro ( pequenos bastonetes gram -)
>Moleculares - determina a especie por analise do DNA do microorganismo isolado. como detecção de genes ou regioes especificas ( identifica fragmentos especificos de DNA).
Provas bioquimicas - só podem ser realizadas com o organismo isolado, em cultura pura.
Provas imunologicas - podem ser realizadas tanto com o isolado em cultura pura, como do material direto.
Provas moleculares - podem ser realizadas tanto com o isolado em cultura pura, como do material direto.
DEPEDENDENTE DE CULTIVO:
- é necessário meio de cultura para que as bactérias possam crescer
- material clinico fresco
- meio de cultivo
- bactérias vivas
- conta células viáveis
- detecção da suscetibilidade à drogas antimicrobianas
INDEPENDENTE DE CULTIVO
- material clinico fresco ou congelado
- não precisa de meio de cultivo
- não são necessárias bactérias vivas
- não é possível detectar a suscetibilidade à drogas antimicrobianas
- não conta células bacterianas
- DNA diretamente do material clinico 
- métodos moleculares
Uma das vantagens do método independente de cultivo sobre o dependente, é que aquele é muito mais rápido para ser identificado o microrganismo, pois disponibiliza dos métodos moleculares, os quais garantem o resultado da análise em um período de 4 horas. O método dependente de cultivo pode demorar até um mês para que seja desenvolvido. 
Apesar disso, os testes dependentes de cultivo é o único teste que se presta para a verificação da sensibilidade a drogas antimicrobianas (antibiograma). 
Se utilizarmos um indivíduo que apresenta processo infeccioso, coletaremos uma amostra do material e encaminharemos ao laboratório onde será analisado quais bactérias estão presentes e qual é o antibiótico que será utilizado. 
O laboratório optará pela utilização dos métodos dependentes ou independentes de cultivo.
O material será semeado da mesma forma que fazemos de cultura é esperado o crescimento das colônias. Após o crescimento, é feito seu estudo, suaidentificação bacteriana. A identificação pode ser: bioquímica (avalia fermentação de carboidratos), imunológicos e moleculares.
Após realizada a identificação é possível determinar a suscetibilidade à drogas antimicrobianas: descobrir se a bactéria é sensível ou resistente ao medicamento.
Coletar sempre em assepsia. Segundo passo é transferir para o meio de transporte. 
- Para métodos dependentes de cultura: 
cultivar em condições pré-reduzidas (não permite crescimento de microrganismos, mas mantém a sua viabilidade)
- Para métodos independentes de cultura: 
métodos dependentes de DNA deve-se adicionar substancias que inativam dnases
métodos dependentes de RNA deve-se inativar de RNAses e manutenção da integridade do RNA.
Amostra pode necessitar de um processamento: diluições seriadas, jarras de anaerobiose.
MÉTODOS DEPENDENTES DE CULTIVO
A identificação pode ocorrer por provas bioquímicas, imunológicas ou moleculares.
Provas bioquímicas – determina a espécie por meio de características fenotípicas do organismo isolado, como capacidade de utilização de substratos, produtos finais etc.
Provas imunológicas – determina a espécie por meio de características fenotípicas do organismo isolado, como detecção de antígenos de superfície.
As bactérias possuem características especificas que permitem sua identificação
Ex: Aggregatibacter Actinomycetemcomitans – quando seu material clinico é isolado, é possível observar uma estrutura interna isolada (pequenos bastonetes gram-)
Porphyromonas e Prevotellas: produtoras de pigmento negro (pequenos bastonetes gram-)
Provas moleculares – determina a espécie por analise do DNA do microrganismo isolado, como detecção de genes ou regiões especificas.
PROVAS IMUNOLOGICAS
- Imunofluorescencia: utiliza anticorpos específicos acoplados a fluorosforos.
direta: anticorpo conjugado com o fluorosforo se liga diretamente ao antígeno bacteriano.
indireta: anticorpo sem corante se liga diretamente ao antígeno bacteriano, depois se adiciona um anticorpo fluorescente com especificidade pelo primeiro anticorpo utilizado para reagir com o antígeno. 
- Elisa: identificação de anticorpos e ou antígenos, por anticorpos marcados com uma enzima, de maneira que esta enzima age sobre um substrato e a reação faz com que o cromógeno mude de cor.
direto: placa dotada de anticorpos, em seguida é colocada a amostra do paciente -> caso estejam presentes os antígenos necessários haverá formação da ligação antígeno-anticorpo que é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulina.
passo-a-passo: adicionar os anticorpos a superfície da placa; adicionar a amostra do paciente; lavar; adicionar anticorpos anti IgG humano ligado a enzima; lavar; adicionar o substrato para a enzima.
indireto: placa de elisa possui um antígeno aderido, em seguida é colocada a amostra do paciente -> caso estejam presentes anticorpos específicos para o antígeno em questão, haverá formação da ligação antígeno-anticorpo que é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulina.
passo-a-passo: cobrir a placa com a preparação do antígeno; adicionar a amostra do paciente; lavar; adicionar anticorpos anti IgG humano ligado a enzima; lavar; adicionar o substrato para a enzima.
- Imunoaglutinação: baseia-se na capacidade do anticorpo se ligar ao antígeno -> se coloca em um tubo de ensaio a bactéria e o anticorpo, essas sucessivas ligações levam a estas partículas se agruparem de modo visível, que leva a alteração do estado físico do antígeno.
o anticorpo vem ligado a particular inertes (bolinhas de latex) , ai você poe a bacteria, se o anticorpo se ligar a ela as bolinhas vão todas se aglutinar indicando a presença dela. Ocorre a aglutinação das particulas devido a interação antigeno anticorpo.
MÉTODOS INDEPENDENTES DE CULTIVO
Não será utilizado meio de cultura – métodos moleculares
Alta especificidade e sensibilidade
Bactérias não precisam estar viáveis
Permite detecção e quantificação inclusive de organismos não cultiváveis
Métodos amplos permitem analise da diversidade microbiana como um todo, não apenas de certos organigmos.
Não permitem o isolamento do agente para realização do antibiograma
>Métodos alvo dirigidos: detecção de microorganismos conhecidos onde sequencias de DNA complementares são usadas como alvo.
PCR: processo de amplificação de acidos nucléicos, sendo um recurso para obter muitas celulas bacterianas semelhantes a partir da multiplicação de uma celula.
A base para entendermos os métodos moleculares são as etapas: desnaturação do DNA, hibridização e detecção.
Desnaturação: separação da cadeia dupla de DNA em dois filamentos. Os dois filamentos ou cadeias de DNA são mantidos juntos por ligações de hidrogênio que quebram-se a altas temperaturas por ex, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligações covalentes, permanecem intactas.
Hibridização: são usados primers espécie-especificos , pedaçoes de fita de acido nucleico complementar ao da bacteria, que são iguais a todos os microorganismos da espécie. Primer é colocado junto com uma fita de DNA/RNA da bactéria isolada que será identificada -> se houver uma sequencia complementar, as duas se combinam (por isso hibridização) -> diminui a temperatura para 60ºC
DNA poimerase usa a fita deo DNA como molde e agrega as bases nucleotidicas livres que formam o novo DNA a partir da sequencia do primer hibridizado, assim o DNA é copiado e se tem o dobro de DNA.
Então o produto de amplificação por PCR é colocado em eletroforese, contém um gel que visa a mobilidade de fragmentos de acordo coma corrente elétrica. DNA possui carga negativa e migra para o positivo, correndo o gel, assim se estuda os numeros de pares de bases de cada bacteria comparando com um padrão. Fragmentos menores e mais lentes correm na frente e são associados a bacterias virulentas (como Aggregatibacter).
PCR em tempo real: além de identificar, permite a quantificação do numero de copias de DNA homologo aos primers (quantidade de organismos na amostra). Há um monitoramento na amplificação usando a fluorescencia, que se intercala no DNA formado na amplificação.
Hibridização do DNA-DNA: metodo onde uma sonda de DNA complementar ao DNA da especie alvo é marcada e submetida a hibridização com a amostra.
Sonda genética é um fragmento simples de DNA/RNA complementara uma sequencia alvo, ela comtem bases nitrogenadas da espécie analisada. As sondas dtectam rapidamente e com alta especificidade a presença de microorganismos pois se hibridizam com sequencias homologas de nucleotideos existentes no material em estudo.
As sondas são marcadas com enzimas, moleculas quimioluminescentes, para que possa ser vista no fim da reação.
Dot Blot: DNA-DNA, varias canaletas simultaneas que realizam varias analises com pouco reagente voce coloca as sondas de um lado e amostras do outro cruzando as informaçoes.
>Metagenômica: análise de toda a microbiota, independente do conhecimento prévio, uso de um primer universal para todos os DNAs -> sequenciamento de alta performance.
Detecta membros predominantes da comunidade microbiana, podendo não detectar membros raros com sequencias diferentes.
Vantagens e desvantagensdos metodos moleculares:
-Alta especificidade e sensibilidade, bactérias não precisam estar viaveis, permite detecção e quantificaçãoinclusive de organismos não cultivaveis - métodos amplos permitem analise de diversidade microbiana como um todo e nao apenas de certos microorganismos.
-Não permitem o isolamento do agente para realização do antibiograma.
Resistencia à antibioticos - antibiograma
É analisado com o isalamento de microorganismos em agar ou meio liquido. É feita a medição do halo de inibição do antibiotico aplicado. É possivel determinar a concentração inibitoria minima (CIM) pelo metodo de diluição em placas com diferentes concentrações inoculadas com diferentes microorganismos.
Métodos de tipagem bacteriana - fingerprinting
Permitemidentificar a identidade do organismo isolado, usado para rastreamento epidemiologico (origem da amostra, semelhança, filogenia, vias de transmissão).
Existem diferentes clones na mesma espécie.
MÉTODOS FENOTIPICOS: não discrimina
-Biotipagem: baseado no comportamento bioquimico
-sorotipagem: baseado no reconhecimento de antigenos de superficie microbiana na parede celular por anticorpos (A.A. tem varios sorotipos, sendo B e Cmais virulentos).
-Perfil de proteínas: análise padrão de proteínas secretadas por cepas de bacterias (como S. Mutans)
METODOS GENOTIPICOS
-PCR por primers arbitrários: constrói um primer que são complementares à varias localizações do cromossomo, em região repetidas da bactéria. Corre o gel e se vê as regiões repetidas nas bacterias. Consegue ver se duas crianças diferentes possuem a mesma bactéria (transmitindo uma pra outra).