Replicação do DNA: Processo e Regulação

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Capitulo 5, Biologia Molecular da Célula 
 
Dra. Eldamária de Vargas Wolfgramm dos Santos 
> Proposto por Watson & Crick 
molde molde 
•REPLICAÇÃO 
•SEMI-CONSERVATIVA 
•Novos nucleotídeos são incluídos por 
complementaridade de bases 
•A polimerização é feita pela DNA-
polimerase – descoberta em 1957. 
Replicação do DNA 
Mas como isso acontece? 
Presença da forquilha de 
replicação 
Um complexo 
multienzimático que contém 
a DNA-pol sintetiza o DNA 
das duas fitas novas. 
A dupla fita tem orientação antiparalela 
E todas as DNA pol sintetizam no sentido 5’-3’ 
 
Como acontece o crescimento 3’-5’ da fita 
de DNA? 
•Presença de pequenos trechos = Fragmento de Okasaki 
•Fita filha sintetizada continuamente = fita líder ou contínua 
•Fita sintetizada de modo descontínuo = Fita retarda ou 
descontínua 
A replicação do DNA é um processo de alta 
fidelidade 
Erro: 1 erro a cada 109 nucleotídeos copiados 
Alta precisão: 
Pareamento complementar 
Mecanismos de correção 
 A DNA-pol realiza a primeira etapa de correção: após a união 
por ligações de hidrogênio do nucleotídeo, mas antes de ser 
ligado covalentemente à cadeia crescente, a enzima sofre uma 
alteração conformacional 
 A DNA-pol tem uma capacidade de correção exonucleotídica 
3’-5’: ocorre imediatamente após os raros casos de um 
nucleotídeo incorreto 
Fig. 5.8 
A DNA-pol depende de uma extremidade iniciadora 
Não iniciam a síntese de novo 
Síntese de iniciadores 
(primers) = 10 
nucleotídeos 
Sequência de RNA 
Realizada pela DNA-
primase 
Uma RNAse H 
remove o iniciador 
e DNA-pol preenche 
o espaço. 
Mas para que a replicação ocorra é necessário a 
abertura da dupla-hélice do DNA 
DNA-helicases e proteínas ligadoras de DNA fita 
simples (SSB) 
DNA-helicases 
São impulsionadas pela 
hidrólise de ATP 
Podem desenrolar a dupla-
hélice na direção 5’-3’ e 3’-5’ 
 SSB 
 Ligam-se fortemente de maneira cooperativa à fita simples 
exposta sem encobrir suas bases 
 Não abrem diretamente a dupla-hélice 
 Agem para impedir a formação de grampos na fita simples 
exposta 
 A DNA-pol associa-se a uma cinta deslizante para manter-se 
unida ao DNA 
 Tendência rápida de dissociação. 
 A cinta mantêm a polimerase firmemente associada ao DNA 
até que a mesma encontre um DNA dupla-fita → pol libera-se 
da cinta e dissocia-se do molde → associando-se a uma 
nova cinta montada sobre o iniciador de RNA. 
Assim...na forquilha de replicação as proteínas 
cooperam para formar uma maquinaria de 
replicação. 
Além do processo de verificação e correção de 
erros da maquinaria de replicação, a célula 
possui um sistema de reparo de pareamento 
incorreto 
 
Detecta distorção na hélice de DNA resultante da 
interação incorreta entre bases. 
A correção deve ser feita usando a fita molde 
original 
 
Procariotos: a distinção entre a fita molde antiga e 
a nova fita sintetizada é pela presença da 
metilação de A na sequência GATC → fitas 
recém-sintetizadas ainda não apresentam essa 
metilação 
 
Eucariotos: não metilam seu DNA. 
As fitas recém-sintetizadas sofrem clivagens 
transitórias. 
Sítios de clivagem fornecem o sinal que direciona a 
correção. 
 
No processo de replicação pode ocorrer o super-
enrolamento da dupla fita a frente da forquilha 
Para aliviar a tensão causada pelo enrolamento, a célula 
possui duas enzimas: 
 
Topoisomerase I: produz clivagem na fita simples; reversível 
Topoisomerase II: produz clivagem na dupla-fita; reversível; em 
sítios cromossômicos que as duplas-hélices se entrelaçam. 
Também ajudar evitar emaranhamentos na replicação 
 Mas como a maquinaria de replicação é 
formada? 
 
 E como as células regulam este 
processo? 
 A síntese de DNA inicia-se na ORIGEM DE 
REPLICAÇÃO 
 Região onde a hélice é inicialmente aberta 
 Rica em pares A-T: mais fáceis de serem 
separados 
 Particularidades entre procariotos e eucariotos 
A origem da replicação - Procariotos 
 Genoma = única molécula de 
DNA circular 
 
 Início = uma única origem de 
replicação e as duas 
forquilhas formadas seguem 
em direções opostas até se 
encontrarem. 
 
A origem da replicação - Procariotos 
A origem é reconhecida por 
proteínas iniciadoras que 
envolvem-se ao redor do DNA: 
complexo DNA - proteína 
Atrai a DNA-helicase ligada ao 
seu inibidor 
Fita simples exposta → DNA-
primase sintetiza iniciador → 
agrupamento das demais 
proteínas e formação da 
forquilha 
 Cromossomo humano de tamanho médio = 150 
milhões de pb 
 Replicação = 50 nucleotídeos por segundo (1/10 da 
velocidade de replicação em procariotos) 
 Replicação = 800 horas 
A origem da replicação - Eucariotos 
Solução: várias origens de replicação 
Forquilhas formadas em pares 
 Em eucariotos, a replicação do DNA ocorre apenas 
na fase S do ciclo celular 
 Em procariotos, o DNA é replicado continuamente: 
uma nova etapa de replicação pode surgir mesmo 
antes do término da replicação prévia 
 
Em eucariotos as origens de replicação tendem a ser 
ativadas em grupos de 20 a 80 origens: regiões 
diferentes no mesmo cromossomo replicam em 
tempos distintos na fase S 
 
Ativadas aleatoriamente ou obedecem uma ordem especifica 
 
 A ordem de ativação das origens de replicação 
parece ser dependente da estrutura da 
cromatina 
 Regiões menos condensadas = replicadas 
primeiramente 
 Análise do cromossomo X em mulheres 
 X inativo = heterocromatina → replicado no final 
da fase S 
 X ativo = eucromatina → replicado por toda fase S 
Assim... O grau de condensação do 
cromossomo parece influenciar o momento na 
qual as forquilhas são iniciadas e não sua 
velocidade após o início 
 
Como as origens de replicação são 
reconhecidas? 
 
 Cada origem de replicação contem: 
 um sítio para ligação a uma enorme proteína 
iniciadora = OCR – complexo de reconhecimento 
de origem 
 Um sequência rica em A, T 
 Sítio de ligação para proteínas que auxiliam na 
atração da OCR 
Como a replicação é 
limitada apenas à fase 
S? 
Pela disponibilidade 
de Cdc6 e Cdt1 que 
são sintetizadas em 
G1 para atuar em S, 
onde sofrem 
proteólise 
Em contraste as leveduras, as origens de 
replicação em mamíferos são difíceis de isolar e 
estudar porque são longas e complexas e não 
contém uma sequência conservada de DNA. 
A estrutura da cromatina e não as sequências 
de DNA parece ter um papel essencial na 
definição das origens de replicação. 
E como a replicação pode ocorrer com a 
presença dos nucleossomos? 
•Presença do complexo de remodelamento 
•E das chaperonas de histonas 
 A síntese de histonas aumenta durante a fase S – 
período de replicação do DNA 
 O aparato de replicação passa pelos nucleossomos 
sem retirá-los 
 O octâmero se dissocia em um tetrâmero H3-H4 e 
dois dímeros H2A-H2B 
 Formam-se novos octâmeros atrás da forquilha de 
replicação 
 Telômeros 
O término da replicação 
 Telômeros: presença de sequências repetitivas – 
humanos = GGGTTA 
 Estabilizam os cromossomos, evitando a perda de 
informação genética 
 Associam-se a proteínas – revestimento que 
esconde as pontas dos cromossomos da 
maquinaria de reparo de DNA da célula 
Quebra bifilamentar : 
→ fundir a outra quebra; 
→ parada da divisão celular (senescência) 
→ morte celular (apoptose). 
Telômeros 
 Células somáticas – produzempouca telomerase 
ou nenhuma 
Telômeros 
 Síndrome de Werner 
Telômeros x doenças humanas 
•Telômeros mais curtos → mutação no gene WRN → perturba o telômero normal 
→ envelhecimento prematuro. 
Sintomas clínicos: 
Rugas, cataratas, 
osteoporose, cabelos 
grisalhos, doença 
cardiovascular 
 Disceratose congênita 
 - Telômeros mais curtos: mutações nos genes da 
telomerase → envelhecimento prematuro. 
 
 Telômeros x Câncer 
 - Células cancerosas têm atividade de telomerase 
Telômeros x doenças humanas 
Drogas: inibir a atividade da telomerase 
 Manutenção da vida: capacidade das células 
em armazenar, obter e traduzir as instruções 
genéticas para manter o organismo vivo. 
 
Informação hereditária 
Replicação 
Correção de erros = Reparo do DNA 
 Erros por: 
 
 Acidentes metabólicos 
 Calor 
 radiações 
Apenas algumas 
alterações acumulam-
se 
 Mutações no sistema de reparo→ podem 
ocasionar doenças genéticas 
 
 Síndrome de Lynch ou HNPP (Síndrome do câncer 
coloretal hereditário não-polipoide) 
 
 Xeroderma pigmentoso 
•Pele seca 
descamativa 
(xeroderma) 
•Sardas extensas e 
pigmentação anormal 
•Tumores cutâneos 
 DNA é uma molécula estável mas suscetível a 
alterações espontâneas. 
CAUSAS DE UMA MUTAÇÃO 
MUTÁGENOS 
Radiação Ionizante (Raios X) 
Radiação não ionizante (Luz UV) 
Análogo de bases nitrogenadas 
•Íons eletricamente carregados 
•Alteram bases do DNA 
•Romper as lig. do duplo filamento 
 Radiação não ionizante 
CAUSAS DE UMA MUTAÇÃO 
•Não forma íons carregados 
•Ligações adjacentes entre 
bases pirimidínicas: dímeros 
•Pareamento incorreto 
 Análogos de base 
•Erros de pareamento em 
replicações futuras 
•Distorcer a dupla hélice 
•Substituição de bases 
CAUSAS DE UMA MUTAÇÃO 
Ex. Aflotoxina 
Mutações não fossem corrigidas = deleção, 
substituição na cadeia filha de DNA 
 
 
 
Consequências desastrosas para um organismo 
A estrutura da dupla hélice é adequada 
para o processo de reparo 
Se uma fita é alterada a outra fita é usada para 
restaurar a sequência nucleotídica 
A lesão no DNA pode ser removida por mais de uma 
via: 
 
Enzimas diferentes que atuam em lesões diferentes 
 
Duas vias principais: 
1.Reparo por excisão d e bases 
2.Reparo por excisão de nucleotídeos 
Reparo por excisão de bases 
 
 DNA-glicosilases 
 Reconhece a projeção 
gerada por nucleotídeo 
alterado para fora da hélice 
 Remove a base do açúcar. 
 
 AP endonuclease 
 Reconhece a ausência de 
base e cliva a ligação 
fosfodiéster – retirando o 
que restou do nucleotídeo 
 Lesão volumosa no DNA. 
Ex: dímeros de pirimidina 
 
 Complexo 
multienzimático procuram 
torções no DNA 
 Cliva nos dois lado da 
torção 
 DNA-helicase remove o 
oligonucleotídeo 
 DNA polimerase e DNA 
ligase sintetizam e ligam 
Reparo por excisão de 
nucleotídeos 
 
A nossa maquinaria celular possui um sistema de 
reparo acoplado à transcrição do DNA para 
assegurar que o DNA celular mais importante, 
aquele que esta sendo transcrito, seja reparo de 
modo eficiente. 
 No DNA muito danificado há a existência de DNA-
polimerases de apoio e as DNA-polimerases 
replicativas param. 
 
 Os mecanismos de reparo vistos anteriormente 
não são suficientes 
 
 Mais de 10 DNA-polimerases de apoio. 
 Não são tão precisas quanto as DNA-polimerases 
replicativas 
 
Quebra da dupla fita. 
 
Não há fita-molde intacta para o reparo. 
 
 
1) Ligação de extremidades não 
homólogas 
 Solução ´”rápida e suja”: pode 
causar uma alteração na 
sequência de DNA 
 Para evitar a degradação do 
cromossomo e perda de genes 
 2) Recombinação 
homóloga: 
 
 Lesão corrigida usando a 
cromátide-irmã 
Lesões no DNA retardam a progressão do Ciclo 
celular 
CDKs: quinases 
dependentes de ciclina 
•Fosforilam proteínas 
regulatórias 
•Interagem com as 
ciclinas 
Mal funcionamento 
→pode levar ao câncer 
 Danos no DNA: aumento da síntese de algumas 
enzimas de reparo. 
 Ataxia telangiectasia: mutações no gene que codifica 
a proteina ATM, uma cinase 
 Erros não corrigidos: indivíduos sofrem as 
consequências 
 Neurodegeneração, predisposição ao câncer e 
instabilidade genômica.