Aula 01 Métodos e Técnicas em Parasitologia Clínica(1) (1)

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05/08/2012
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Métodos e Técnicas em 
Parasitologia Clínica
Populações que não 
dispõem de água 
potável correm alto 
risco de infecções 
(Foto OMS).
Habitação rústica infestada de 
insetos triatomíneos e habitada por 
pacientes com a Doença de Chagas.
Áreas endêmicas de malária
no Brasil
Causas desconhecidas e outras
6.250 (12%)
Doenças do 
sistema respiratório
2.890 (6%)
Doenças Infecciosas
e parasitárias 
17.310 (33%)
Doenças do sistema 
circulatório
15.300 (29%)
Cânceres
6.235 (12%)
Causas maternas
585 (1%)
Causas peri e neonatais
3.630 (7%)
A OMS mostrou que 
as principais causas de 
morte no mundo (1997) 
eram as doenças 
infecciosas e 
parasitárias, 
responsáveis por 33% de 
todos os óbitos.
Vinham, em 2º lugar, 
as doenças do sistema 
circulatório (29%) e, em 
3º, os cânceres (12%).
Importância do diagnóstico
Prevalência significativa no mundo (OMS) – NTD
Doenças Tropicais Negligenciadas
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Expectativas do diagnóstico
Médico – diagnóstico acurado.
Paciente – conforto na coleta, poucas coletas.
Laboratório – custo x benefício (baixo custo, fácil
interpretação, rapidez, simplicidade).
Métodos laboratoriais 
• Recurso indispensável para o diagnóstico
das infecções
• Estudo dos parasitos
• Epidemiologia
• Relação parasito-hospedeiro
• Critérios de cura
Exame parasitológico do sangue 
Hemoscopia
• Doenças parasitárias com estágios no
sangue.
• Malária, filariose, doença de Chagas.
• Parasito vivo ou fixado e corado.
• Mais indicado o uso de material fresco –
método executado imediatamente após colheita de
sangue.
Exame parasitológico do sangue 
Coleta do sangue
Punção da polpa digital ou lóbulo da orelha.
Punção venosa.
Exame parasitológico do sangue 
Exame direto
• Gota no centro da lâmina coberta com lamínula.
• Adicionar salina ou citrato.
• Avaliação imediata.
• Visualização de parasitos vivos – movimentação dos
flagelos agitam hemácias. Tripanossomos
• Escassez de parasitos ou pouca mobilidade –
preparação de lâminas fixadas e coradas.
Exame parasitológico do sangue 
Preparação de lâminas
Gota espessa
Parasitos escassos.
3 ou 4 gotas de sangue próximas espalhadas de forma
circular.
Gota estendida
Distensão de uma gota sobre a lâmina.
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Exame parasitológico do sangue 
Preparação de lâminas
Corantes
Giemsa – necessário fixação prévia com álcool metílico.
Leishman – não é necessário fixação com álcool
(presente na fórmula).
Xenodiagnóstico
• Diagnóstico de Doença de Chagas.
• Método introduzido por Brumpt em 1914 é largamente
empregado ainda nos dias atuais no diagnóstico da
doença de Chagas.
Xenodiagnóstico
• Multiplicação do T. cruzi no trato digestivo do
triatomíneo permite sua detecção nas fezes ou na
urina dos insetos alimentados com sangue do paciente
ou de animais suspeitos.
• Utilização de ninfas de 3o a 5o estágio de
desenvolvimento, as quais são criadas em condições
controladas em laboratório, sendo portanto livres do
parasita.
Xenodiagnóstico
1. Ninfas de 3o a 5o estágio
2. Ninfas em jejum alimentar de 20 a 30 dias.
3. Pequenas caixas cobertas com tela, aplicadas diretamente sobre
o hospedeiro por 30 a 60 minutos (humamos, a caixa é aplicada
no antebraço).
4. Exame dos insetos para pesquisa do T. cruzi é realizada aos 30 e
60 dias após o repasto sangüíneo.
Exame parasitológico de fezes
1. Exame macroscópico – verificar a consistência das
fezes, presença de muco, sangue ou vermes adultos.
2. Exame microscópico
- ovos ou larvas de helmintos
- Cistos ou trofozoítos
Exame parasitológico de fezes
1. Métodos quantitativos – avaliar intensidade da
parasitemia.
Kato-Katz
Coprotest®
2. Métodos qualitativos – presença de parasitas.
Método direto
Métodos de enriquecimento – número pequeno de formas
parasitárias eliminadas.
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Exame parasitológico de fezes
Escolha do método:
Não existe método único – capaz de identificar todos os
parasitos.
Métodos gerais:
1. Sedimentação espontânea (Hoffman, Pons e Janner –
HPJ).
2. Centrifugação (MIFC e Coprotest).
Exame parasitológico de fezes
Maioria dos pedidos não é relatada a suspeita clínica:
> Realização de um dos métodos gerais
Relato de suspeita clínica:
> Método geral e método específico devem ser realizados
Exame parasitológico de fezes
Melhor exame:
1. Fácil execução
2. Menor tempo
3. Identificação de maior número de parasitos
Qualidade dos exames:
1. Técnica correta
2. Um exame isolado negativo não deve ser conclusivo
3. Produção de cistos, ovos ou larvas não é constante e uniforme
CADASTRO DO PACIENTE:
- Número de registro de identificação do paciente gerado pelo LAB
- Nome completo do paciente;
- Tipo de convênio;
- Idade, sexo;
- Telefone e/ ou endereço do paciente;
- Nome e contato do responsável em caso de menor de idade ou incapacitado;
- Nome do solicitante;
- Data e hora do atendimento;
- Horário da coleta, quando aplicável;
- Exames solicitados e tipo de amostra;
- Informações adicionais: medicamento em uso
(laxantes, antiácidos, ingestão de meios de contrastes)
- Data prevista para entrega do laudo; 
DADOS CLÍNICOS
- Origem geográfica do paciente;
- Deslocamento em áreas endêmicas (com datas);
- Antecedentes parasitários;
- Tratamento já recebidos;
- Resultados anteriores ( fezes – hemograma );
- Suspeita clínica.
Exame parasitológico de fezes
Coleta e conservação
1. Evacuação deve ser feita em recipiente limpo e seco e as fezes
transferidas para recipiente próprio.
2. Fezes sem conservador devem ser enviadas ao laboratório
imediatamente.
3. Coleta de amostras múltiplas – dias alternados e utilização de
conservador.
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Exame parasitológico de fezes
Conservadores:
Formol 10%
MIF (mercurocromo, iodo e formol)
SAF- fixador usado para conservar cistos e trofozoitos.
Coloração – Lugol
Iodo, iodeto de potássio e água destilada.
Utilizada para corar ovos, cistos e larvas.
LAUDO
O laudo deve conter no mínimo:
a) identificação do laboratório;
b) endereço e telefone do laboratório;
C) identificação do RT;
D) número de registro do RT no respectivo conselho;
E) identificação do profissional que liberou o exame;
F) número de registro do laboratório no respectivo conselho;
G) nome e registro de identificação do cliente no laboratório;
H) data da coleta da amostra;
i) data de emissão do laudo;
J) nome do exame, tipo de amostra e método analítico;
K) resultado do exame;
L) limitações técnicas da metodologia e dados para interpretação; 
M) observações pertinentes. 
Resultado - Negativo
No material examinado, não foram encontrados ovos ou larvas de 
helmintos, nem cistos ou trofozoitos de protozóarios.
Resultado - Positivo
Presença de Ovos de Ascaris lumbricoides
Cistos de Giardia duodenalis
Método Empregado: Direto, Lutz ou HPJ, Kato-Katz.
Observações: coleta amostra única
três amostras em dias alternados.
LAUDO CONTROLE DE QUALIDADE
• Controle Interno da Qualidade:
duplo cego;
amostra aleatória.
• Controle Externo da Qualidade;
Devem ser documentados !!!
Exame parasitológico de fezes
Exame direto a fresco:
1. 2 a 3 gotas de salina em lâmina.
2. Tocar comum palito vários pontos das fezes,
transferindo para a lâmina.
3. Espalhar as fezes na lâmina.
4. Para identificação de cistos de protozoários e larvas de
helmintos corar com lugol.
5. Examinar a lâmina com objetiva de 10X e/ou 40X.
Técnica com baixa sensibilidade
Exame parasitológico de fezes
Sedimentação espontânea (Hoffman, Pons e Janer ou Lutz):1. 2g de fezes em um frasco Borrel e 5 mL de água, triturar bem.
2. Acrescentar mais 20 mL de água.
3. Filtrar a suspensão em cálice utilizando gaze dobrada em quatro e
lavar os detritos com mais 20 mL de água.
4. Completar o volume do cálice (200 mL) com água.
5. Deixar a suspensão em repouso de 2 a 24h.
6. Sobrenadante límpido, colher uma amostra do sedimento
utilizando pipeta.
7. Corar a lâmina com lugol e examinar em objetivas de 10X e/ou
40X.
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Exame parasitológico de fezes
Sedimentação por centrifugação (MIFC)
1. Colher as fezes em MIF.
2. Homogeneizar bem,
3. Filtrar a suspensão em gaze dobrada em quatro.
4. Transferir 1 a 2 mL do filtrado em tubo cônico de centrifugação.
5. Adicionar 4 a 5 mL de éter sulfúrico e agitar vigorosamente
(desengordurar o material).
6. Centrifugar a 1500 rpm por 1 minuto.
7. Descartar o sobrenadante.
8. Adicionar uma gota de lugol ao sedimento e recolher uma parte
para análise em lâmina e cobrir com lamínula.
Exame parasitológico de fezes
Coprotest – sedimentação por centrifugação
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Exame parasitológico de fezes
Faust – Centrífugo-Flutuação
1. 10 g de fezes em 20 mL de água (homogeneizar bem).
2. Filtrar em gaze e transferir para um tubo de hemólise.
3. Centrifugar a 2.500 rpm por 1 minuto.
4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em água.
(Repetir esta operação até o sobrenadante fique claro)
5. Ressuspender o sedimento em solução de sulfato de zinco a
33%. (densidade = 1,18 g/mL)
6. Centrifugar novamente.
Exame parasitológico de fezes
Faust – Centrífugo-Flutuação
Os cistos e alguns oocistos de protozoários e ovos leves de helmintos
ficarão na película superfícial.
Retirar com alça de platina, adicionar uma gota de lugol e analisar em
lâmina.
Exame parasitológico de fezes
Baermann-Moraes
1. Colocar 8 a 10 g de fezes em uma gaze dobrada.
2. Colocar sobre um funil fechado com um tubo de borracha.
Adicionar água (45°C) ao funil em quantidade suficiente para
entrar em contato com as fezes.
3. Deixar uma hora em repouso.
4. Recolher 5 a 7 mL de água em tubo e centrifugara 1.000 rpm por
1 minuto.
5. Colher o sedimento sem desprezar o sobrenadante, adicionar o
lugol e examinar ao microscópio. (avaliar a presença de larvas)
Exame parasitológico de fezes
Rugai
1. Retirar a tampa do recipiente que acondiciona as fezes e envolvê-
lo em gaze (fazendo uma pequena trouxa).
2. Colocar o material com a abertura para baixo num cálice de
sedimentação com água aquecida (45°C).
3. Deixar uma hora em repouso.
4. Colher o sedimento no fundo do cálice, corar com lugol e observar
ao microscópio.
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Exame parasitológico de fezes
Kato – Katz
1. Preparar uma solução de verde malaquita (conservar as fezes e
clarificar as formas parasitárias).
2. Cortar papel celofane semipermeável em pedaços de 24X30mm e
deixá-los mergulhados na solução de verde malaquita por pelo
menos 24 horas.
3. Comprimir as fezes com um pedaço de tela meiálica. Nesta malha
passam ovos de helmintos e detritos menores do que eles.
4. Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e
transferi-las, com o auxílio de um palito, para o orificio (6mm de
diâmetro) de um cartão retangular de plástico, colocado sobre uma
lâmina de microscopia.
Exame parasitológico de fezes
Kato – Katz
5. Após encher completamente o orificio, retirar o cartão,
cuidadosamente, deixando as fezes (aproximadamente 42mg) sobre a
lâmina de vidro.
6. Cobrir as fezes com a lamínula de papel celofane embebida na
solução de verde malaquita, inverter a lâmina, sobre uma folha de papel
absorvente e comprimi-la.
7. Aguardar uma a duas horas e examinar ao microscópio.
Exame quantitativo – número de ovos encontrados X 23 = opg
Exame parasitológico de fezes
Método de Graham (fita gomada)
1. 5 a 6 cm de fita adesiva transparente com tiras de papel nas
extremidades para identificação.
2. Colocar a fita sobre o fundo de um tubo de ensaio com o lado
adesivo voltado para fora.
3. A porção aderente deve ser encostada várias vezes à mucosa da
região perianal, e em seguida colar na lâmina.
4. Examinar a lâmina em microscópio.
Material deve ser colhido de manhã, antes que o paciente se levante ou
realize qualquer tipo de higiene.
Indicado: Adulto e ovos de E. vermiculares e proglotes de T. saginata.
Diagnóstico imunológico
Resistência natural
• Mecanismos protetores passivos
 Revestimento cutâneo
 Mucosas
 Conjuntiva ocular e secreção lacrimal
 Temperatura do corpo
 Tensão do O2, pH e potencial de oxi-redução
 Substratos para crescimento e desenvolvimento indisponíveis
 Ausência de mecanismos que estimulam desencistamento, eclosão do ovo
ou desenvolvimento larvário
 Ausência de receptores (aderência e endocitose)
Imunidade
• Anticorpos protetores ou funcionais 
reação com Ag parasitário levando à morte ou bloqueio do 
desenvolvimento
• Anticorpos não-funcionais 
indicam presença, mas sem capacidade de eliminação ou 
controle 
→ utilidade diagnóstica !!!
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Evasão dos parasitos ao sistema
imunológico
• Schistosoma
Mimetismo imunológico
Superfície externa que reveste todo o corpo do verme adulto –
presença de antígenos semelhantes aos do hospedeiro 
(sistema ABO)
Mecanismo de escape
Descamação e renovação da membrana externa - eliminação do 
complexo Ag-Ac.
• Toxoplasma gondii
Após fagocitose, impede a fusão dos lisossomos com o vacúolo 
de fagocitose.
• Trypanosoma cruzi
Experiência em ratos – macrófagos com inumeros flagelados em 
multiplicação for a dos fagossomos.
Taquizoítas
Diagnóstico imunológico
A demonstração da presença do parasito ou de seus
produtos no organismo do hospedeiro nem sempre é
possível
→Solução em alguns casos - métodos imunológicos
Diagnóstico imunológico
Detectar antígenos, anticorpos ou imunocomplexos
relacionados com a existência da infecção parasitária.
Diagnóstico imunológico
•Simplicidade e rapidez de execução
•Possibilidade de automação 
•Baixo custo operacional
•Diagnóstico diferencial
•Inquéritos epidemiológicos
Diagnóstico imunológico
Padronização dos testes imunológicos - amostras 
de referência, positivas e negativas. 
Adequada escolha dessas amostras é importante 
para a definição da referência (padrão ouro)
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Diagnóstico imunológico
Dificuldade de padronização:
•Memória imunológica 
Pacientes com a doença
Pacientes curados
Pacientes que tiveram contato com o parasito
mas não foram infectados
Pacientes vacinados
•Frequente semelhança entre os antígenos 
constituintes dos parasitos
ELISA – enzimaimunoensaio
Visualizar a formação do complexo imune através da atividade 
enzimática (peroxidade, fosfatase)
Análise visual ou sistemas de detecção fotométrica
Dot-Elisa – Realizado em tira de nitrocelulose
Western Blot
Aplicado a proteínas - estas são separadas usando eletroforese em 
gel de poliacrilamida, na presença do detergente SDS.
Imunofluorescência 
Formação de imunocomplexos visíveis através da ligação com 
anticorpos ligados com substâncias fluorescentes (isotiocianato de 
fluoresceína e rodamina B) 
Imunofluorescência direta – pesquisa de antígenos
Imunofluorescência indireta – pesquisa de antígenos e anticorpos, amplifica 
sinal.
Leitura: microscópio de fluorescência