Aula ELISA

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Universidade Federal de Minas Gerais
ELISAELISAELISAELISA
Lílian Santos
Doutora em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical 
Faculdade de Medicina - UFMG
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
• Enzyme Immunoassay
1960, início do desenvolvimento - Imunohistoquímica
• ELISA - Eva Engvall & Peter Perlmann, 1971
• Uso inicial em microbiologia e parasitologia
Hepatite B, rubéola, toxoplasmose
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
•
• Estudos endocrinológicos (hormônios), oncológicos (antígenos
tumorais)
• Estudos hematológicos, proteínas plasmáticas
Inquéritos sorológicos (fungos, bactérias, vírus)
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Princípio da técnica
Detecção de uma molécula alvo a partir da sensibilização de um
suporte sólido com uma anti-molécula específica e revelação com
uma anti-anti-molécula associada a uma enzima que produz
coloração e permite a leitura da densidade óptica por
espectrofotômetro
Permite análises quantitativas diretas da interação entre duas 
moléculas por medida da atividade enzimática sobre um 
substrato
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Reagentes e equipamentos necessários
• Moléculas purificadas
• Amostras controle (+ e -) e amostras teste
� límpidas, não lipêmicas
� não hemolisadas
� até 7 dias em 2 a 8ºC ou congeladas a -20ºC
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Reagentes e equipamentos necessários
• Padrões (ELISA quantitativo)
• Diluentes
- reduz adsorção inespecífica de componentes da amostra
- PBS 0,15M, Tween 20, caseína...
• Suporte ou fase sólida
- placas de poliestireno, tubos, tiras
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Reagentes e equipamentos necessários
• Solução de bloqueio
- bloquear sítios reativos remanescentes
- leite desnatado, caseína, SFB, gelatina, albumina ...
• Solução de lavagem
- pH 6,8 - 7,5
- PBS 0,15M + 0,05% de Tween 20
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Reagentes e equipamentos necessários
• Conjugado
- moléculas ligadas covalentemente à uma enzima
‘Preservar as funções originais de cada molécula’
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Reagentes e equipamentos necessários
• Principais enzimas utilizadas
- Peroxidase
- Fosfatase alcalina
- Urease...
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Características das enzimas:
� fácil obtenção e conjugação com a molécula alvo, custo acessível
� pureza e estabilidade
� alta atividade específica
� produto da reação com o substrato estável e de fácil quantificação
Reagentes e equipamentos necessários
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Reagentes e equipamentos necessários
Substratos:
• Substrato cromógeno
- TMB, OPD, PNPP...
� estáveis, atóxicos 
� baixo custo
� formação de substância solúvel de cor mensurável
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Reagentes e equipamentos necessários
• Substrato fluorigênico (4-metilumbelilferil-fosfato)
• Substrato quimioluminescente
- amplificação de sinal
- adamantildioexietano-fosfato
• Solução de parada
• Espectrofotômetro
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Reagentes e equipamentos necessários
• Ponteiras, pipetas
• Barcas
• Papel toalha
• Papel alumínio
• Estufa
Etapas da técnica
1 - Sensibilização da placa
Incubação ‘overnight’
Lavagem da placa
2 - Bloqueio da placa
Incubação
Lavagem da placa
3 - Adição das amostras e controles
Incubação
Lavagem da placa
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
4 - Adição do conjugado
Incubação
Lavagem da placa
5 - Adição do substrato 
6 - Parada da reação
Solução ácida ou alcalina
7 - Leitura da placa
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Variações da técnica de ELISA
Pesquisa de antígenos
� ELISA direto ou sanduíche
� ELISA competitivo com antígeno marcado
� ELISA competitivo com anticorpo marcado
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
ELISA direto ou sanduíche
Detecção de antígeno
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
ELISA competitivo com antígeno marcado
Detecção de antígeno
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
ELISA competitivo com anticorpo marcado
Detecção de antígeno
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Variações da técnica de ELISA
Pesquisa de anticorpos
� ELISA indireto
� ELISA de captura com antígeno marcado
� ELISA de captura com anticorpo marcado
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
ELISA indireto
Detecção de anticorpos
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
ELISA de captura com antígeno marcado
Detecção de anticorpos
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
ELISA de captura com anticorpo marcado
Detecção de anticorpos
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Expressão de resultados
ELISA qualitativo - Diagnóstico de doenças
PCM NC
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
p<0,0001
Cut-off
D
O
 
(
4
5
0
n
m
)
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Expressão de resultados
ELISA quantitativo
curva padrão y=ax +b
r2 = 0,9981
y=0,0009x + 0,05
x= y - b
a
0 250 500 750 1000 1250
0.0
0.5
1.0
1.5
diluição do padrão
D
O
 
(
4
5
0
n
m
)
Diluição DO
1000 1,200
500 0,685
250 0,406
125 0,250
62,5 0,1735
31,25 0,0940
15,62 0,0550
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Expressão de resultados
ELISA quantitativo - Dosagem de citocinas
Uni Mult NC
0
10000
20000
30000
40000
50000
 
(
p
g
/
m
L
)
TGF-β
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Vantagens da técnica
• Altas sensibilidade e especificidade
• Custo relativamente baixo
• Reprodutibilidade
• Versatilidade
• Detecção de baixas concentrações de molécula alvo
• Pouco volume de amostra
• Várias amostras ao mesmo tempo
• Rapidez
• Qualitativo ou quantitativo
ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Desvantagens da técnica
• Variações: pipetagem, tempo de incubação, temperatura, pH
• Equipamentos
• Treinamento e concentração na realização
Referências
- Imunoensaios. Fundamentos e aplicações. Adelaido Vaz, Kioko Takei, Ednéia
Casagranda Bueno, Guanabara Koogan, 2007.
- Imunologia. Richard Coico, Geoffrey Sunshine, 6ª ed. Guanabara Koogan, 2010
- Lequin, RM. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 
(ELISA). Clnical Chemistry, 51:12, p. 2415-2418. 2005.