DNA Biologia Celular

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Biologia celular e do desenvolvimento
Flávio Meirelles / Claudia LV Leal
Origem da Vida
Da Molécula ao dogma central
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O fluxo de informações posto pelo dogma central de Biologia:
DNA
RNA
PROTEÍNA
Os ácidos nucleicos só exercem sua função dentro desse fluxo de informações através da interação com proteínas
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A Biologia Contemporânea está dirigida para o entendimento da interação de moléculas dentro das células e das interações entre células que permitem a construção de um organismo multicelular.
No atual milênio duas grandes forças irão remodelar a Biologia Celular Molecular:
Genomas: o conhecimento da seqüência completa de DNA de muitos organismos
Proteomas: o conhecimento de todas as possíveis formas e funções das proteínas
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Biologia Molecular, sensu latu, se refere a qualquer exploração dos sistemas biológicos a nível molecular
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Sequenciamento de DNA
Hibridização “in sito”com probe fluorescente
FISH
Imunohistoquímica
Estrutura de proteínas e interações intra e intermoleculares
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As proteínas exercem as funções biológicas.
Ao explorarmos os sistemas biológicos estamos, de um modo geral, explorando a função de 
proteínas
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O termo Biologia Molecular até recentemente, no entanto, vinha sendo aplicado quase que exclusivamente à 
Química de Ácidos Nucleicos
Ácido Deoxirribonucleico - DNA
Ácido Ribonucleico - RNA
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As técnicas envolvendo a identificação de moléculas de ácidos nucleicos tornou-se a maneira mais fácil de se chegar a uma dada proteína
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Os ácidos nucleicos são moléculas muito mais simples que as proteínas
Os ácidos nucleicos são formados de apenas 
4 tipos de monômeros
(alfabeto de 4 letras)
Proteínas - alfabeto de 20 letras
Atualmente, a Química dos Ácidos Nucleicos é fácil e muito bem padronizada 
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Fatos Marcantes na Biologia do
final do século 19 que levaram à identificação da molécula da hereditariedade
F. Miescher, 1868- extraiu DNA do núcleo celular pela primeira vez (nuclein)
O.Hertwing, 1884 - demonstrou que a fertilização de ovos dependia da união de dois núcleos - um do óvulo e outro do esperma. 
Hertwing suspeitou que “nuclein” fosse o material da hereditariedade. Hipótese que caiu em esquecimento durante os próximos 60 anos.
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O DNA (OU EVENTUALMENTE O RNA) 
É O MATERIAL GENÉTICO
O. Avery, C. MacLeod e M. MacCarty, em 1944 - demonstraram em experimentos com Pneumococcus que o DNA é o material genético
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Nature - 25 de abril de 1953
“A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid” 
J. Watson and W. Crick
“We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest….”
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Outras descobertas importantes nos últimos 30 anos:
1961 - Marmur e Doty descobriram a RENATURAÇÃO do DNA
1962 - Arber forneceu as primeiras evidências para a existência de ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
1966 - Nirenberg, Ochoa e Khorana elucidaram o CÓDIGO GENÉTICO
1967 - Gellert descobriu a DNA LIGASE
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1972-1973 - Boyer, Cohen, Berg e outros da Universidade de Stanford desenvolveram TÉCNICAS DE CLONAGEM DE DNA
1975-1977 - Sanger, Barrel, Maxam e Gilbert 
desenvolveram métodos de SEQUENCIAMENTO 
rápido de DNA	
	
1987 - Mullins descreveu a técnica de PCR
POLIMERASE CHAIN REACTION
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Uma série de outras descobertas vêm sendo feitas e muitos aperfeiçoamentos técnicos vêm sendo desenvolvidos, de modo a tornar o uso das técnicas de biologia molecular cada vez mais eficaz e automatizado
Desenvolvimento da bioinformática tem sido absolutamente essencial para a Biologia Molecular 
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ESTRUTURA DO DNA
O DNA é uma molécula quase “unidimensional”
Largura: 20 Angstrons
Comprimento: 1,7 a 8,5 cm
Uma Estrutura linear que dá origem a outra estrutura linear (o RNA)
O RNA, por sua vez, dá origem a outra estrutura linear (sem ramificações): 
A Cadeia Polipeptídica
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AS UNIDADES DO POLÍMERO - DNA
Bases Purínicas (A ou G) ou Pirimidínicas (C ou T)
Um açúcar: deoxiribose
Fosfato
Nucleosídeo: purina ou pirimidina ligada ao açúcar
Nucleotídeo: éster de fosfato de um nucleosídeo
Exemplo: deoxiadenosina 5’ - trifosfato (dATP)
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-
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O DNA sempre tem duas fitas de ácidos nucleicos enroladas em hélice
As duas fitas de ácidos nucleicos se mantêm juntas por PONTES DE HIDROGÊNIO
Para que o pareamento ocorra, a DUAS FITAS têm que ser ANTIPARALELAS
O pareamento G-C tem 3 pontes de hidrogênio
O pareamento A-T tem 2 pontes de hidrogênio
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(a) 10 bases por volta completa 
(b) RNA/DNA ou RNA/RNA
11 bases/volta
(c) Zig-Zag 
purina/pirimidina alternadas (GC)
(d) C e T em uma fita; A e G na outra
“targeted by poly(C+T)”
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Os cromossomas são formados de duas longas moléculas de DNA que permanecem juntas devido a interações eletrostáticas de curta distância
Interações entre moléculas diferentes sempre ocorrem por ligações de fraca intensidade entre as moléculas que se aproximam
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3’
5’
5’
3’
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O DNA é uma molécula com polaridade: 
 uma extremidade 5’-OH e 
uma extremidade 3’-OH
A SEQÜÊNCIA DE BASES É SEMPRE LIDA NA DIREÇÃO 
5’ ---> 3’
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Quanto maior o número de pontes de H mais estável é a interação.
As fitas das moléculas de DNA no cromossoma não se separam na célula íntegra sem ajuda de enzimas especiais
Interação G - C: 3 pontes de H
Interação A - T: 2 pontes de H
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Tm e % de GC
Quanto maior a porcentagem de pares GC, mais difícil é a desnaturação
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As fitas da molécula de DNA (dupla hélice) podem ser separadas. Esse processo é denominado desnaturação.
A renaturação ocorre quando se volta às condições físico químicas iniciais.
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Desnaturação e Renaturação do DNA
(1961 - Marmur e Doty descobriram a RENATURAÇÃO do DNA)
As duas fitas da dupla hélice podem ser reversivelmente separadas quando as PONTES DE HIDROGÊNIO são rompidas:
Aumento de temperatura ou
Extremos de pH (usamos pH alcalino para separar as fitas)
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Separação das fitas é denominada “FUSÃO” da molécula de DNA - “MELTING”
MELTING POINT: 
	TEMPERATURA NA QUAL É 		DESFEITA METADE DA ESTRUTURA 	EM HÉLICE DO DNA
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Ácidos Nucleicos absorvem máximamente a 260 nm.
A quantificação de ácidos nucleicos em laboratório é, usualmente, feita por espectrofotometria - na faixa UV
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A absorbância a 260 nm aumenta quando as fitas se separam. Temperatura de desnaturação, ou “melting point” (Tm), é a temperatura na qual ocorre 50% de desnaturação.
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As proteínas que interagem com DNA, o fazem pelos mesmos tipos de interações:
- Ligações
 eletrostáticas
- Ligações de H
- Ligações tipo Van
 der Waals
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Diferentemente das proteínas, não existem ligações de H entre os resíduos sucessivos numa fita de DNA. Isso torna o DNA flexível, permitindo que se dobre quando complexado com uma proteína.
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Receptor para glicocorticóide, em forma dimérica, “reconhecendo” uma seqüência palindrômica na molécula de DNA
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O DNA no núcleo:
Um cromossoma : uma molécula de DNA
Genoma: o conjunto de cromossomas de uma dada espécie
Genoma Humano: 46 cromossomas
22 CROMOSSOMAS AUTOSSÔMICOS (X2)
2 CROMOSSOMAS SEXUAIS
Total: 6 x 109 pares de nucleotídeos
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O conteúdo de DNA em diferentes animais e plantas não se correlaciona com a filogenia
Organismo		conjunto de cromossomas (haploide)- pg
Levedura			 0,015 
Drosófila		 	 0,15 
Galinha			 1,3
Homem
3,2
Trigo				7,0
Feijão				14,6
Cebola				16,8
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DNA de eucariotas quando isolados em meio isotônico está associado com uma massa equivalente de proteínas num complexo altamente compactado que é a cromatina.
As proteínas mais abundantes associadas ao DNA
 são as histonas:
H1, H2A, H2B, H3 e H4
- São proteínas ricas em amino ácidos básicos (com cargas positivas), que interagem com as cargas negativas do DNA.
- Numa fração das histonas da maioria das células, alguns desses amino ácidos básicos são modificados pela adição de grupos acetil (-CH3COO-), fosfato, ou metil (-CH3), que neutralizam as cargas positivas ou as converte em cargas negativas.
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H1, H2A, H2B, H3 e H4 em interação com o DNA
20 a 40 resíduos amino terminais flexíveis, com muitas cargas positivas dadas pelo amino ácido lisina. Essas lisinas podem sofrer acetilação e desacetilação reversíveis pela ação de enzimas específicas.
Gene inativo da b-globina em células não eritróides estão associadas histonas relativamente desacetiladas.
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DNA isolado em meio com baixa concentração de sal: “beads on na string”
 nucleosoma - DNA “linker” - nucleosoma 
Regiões do DNA nuclear que estão sendo transcritas estão nesta forma.
DNA isolado em solução salina (0,15M)
forma mais condensada - “fiber like”.
Os nucleosomas estão empilhados - conetados pela H1 - numa espiral ou num arrajo solenoide.
A transição entre estas duas formas no núcleo parece ser muito dinâmica
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Nucléolo:
Fábrica de Ribossomas
Cromatina condensada
(ausência de Transcrição)
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Cromossomas como analisados no cariograma só são observados na fase de mitose. 
Estão duplicados, por isso aparecem como bastões duplos.
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Os cromossomas na metáfase apresentam um padrão de bandas típico para cada um deles quando corando com quinacrina ou com reagente de Giemsa. Esse padrão de bandas é utilizado para identificação de cromossamas com tamanho e forma similares.
O estudo do padrão de bandas vem sendo substituído pela coloração específica dos cromossoma (Chromosome Painting): são utilizadas sondas específicas para regiões espalhadas ao longo do cromossoma, estando estas sondas marcadas com um corante fluorescente.
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DNA de procariotas tem cerca de 1mm.
Têm que ser compactados para se acomodarem na célula. 
- A associação com polimaninas carregadas positivamente reduz a repulsão entre moléculas de DNA, facilitando a compactação:
- Proteínas interagem com o DNA, exercendo papel semelhante aos das histonas. A mais abundante destas proteínas é a H-NS.
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DNA de organelas (endossimbiontes):
	Mitocôndria (fosforilação oxidativa)
	Cloroplastos (fotossíntese)
São DNA circulares que codificam proteínas essenciais para a função da organela e também os RNAs ribossomais e de transferência necessários para síntese proteica. Existem várias cópias (> 30) em cada mitocôndria.
Todos os polipeptídeos sintetizados na mitocôndria, identificados atá agora, não são enzimas completas, mas sim subunidades de complexos multiméricos utilizados para transporte de elétrons ou síntese de ATP.
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16.569 pb
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Moléculas circulares de DNA:
- DNA genômico de todos os procariotas
- Alguns DNAs virais
- DNA de mitocôndrias e cloroplastos
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CROMOSSOMA:
Centrômero (1)
Telômeros (2)
Origem de replicação (várias num mesmo cromossoma)
Estes são os 3 elementos imprescindíveis para a duplicação e segregação igualitária das cromátides irmãs na mitose.
GENES: porções do DNA que são transcritas em RNA
SEQUÊNCIAS REPETIDAS (REITERADAS)
(cerca de 1/3 do genoma)
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Duplicação do DNA “in vivo”
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Quando há duplicação celular, para que as células
filhas preservem as características da célula que
lhes deu origem, é necessário que recebam da célula mãe o “plano de execução” - ou seja, um código genético exatamente igual ao da célula inicial.
Para uma célula se dividir, ela precisa, portanto, de duplicar completa e perfeitamente suas moléculas de de DNA.
Síntese de DNA ocorre apenas quando a célula vai se dividir, ou seja, quando a célula entra no ciclo celular.
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Duplicação de DNA
	DNA POLIMERASES
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DNA POLIMERASES
POLIMERIZAÇÃO: 5’---> 3’
Todas as DNA-POLIMERASES requerem para seu funcionamento:
Molécula de DNA - molde
“Primer” de oligonucleotídeo
Magnésio
dNTPs
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DUPLICAÇÃO DO DNA:
Os genes que regulam o ciclo celular ativam os elementos que irão iniciar a REPLICAÇÃO 
Cada “REPLICON” é ativado uma única vez
A célula só progride no processo de divisão quando o DNA está completamente duplicado.
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O local denominado “origem de replicação”, em bactérias, leveduras e alguns vírus, é uma seqüência especial de nucleotídeos com aproximadamente 300 pb.
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Se a DNA polimerase requer um “primer” para copiar uma fita molde (“template”) de DNA, como os fragmentos de Okazaki são iniciados?
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Papel das diferentes DNA polimerases no processo de duplicação
Como a duplicação do Simiam Virus 40 (SV40) em células eucariotas não requer DNA polimerase , o papel dessa DNA polimerase permanece desconhecido.
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Muitas outras proteínas agem na forquilha de replicação além das polimerases e da primase 
- Brace proteins: “replication factor C” (RFC) em 			eucariotas
	Reconhecem e se ligam especificamente ao DNA 		na junção 	entre o “primer” e a “template”
- Sliding-clamp proteins: “Proliferating Cell Nuclear 		Antigen” (PCNA) em eucariotas
	Essas proteínas formam um anel em torno do DNA,
	prendendo a DNA polimerase no mesmo.
	Isso permite a inserção ininterrupta de milhares de
	nucleotídeos na nova fita de DNA.
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Outras proteínas que agem na forquilha de replicação: 
- Helicase: propicia o desenrolar da dupla hélide de 	DNA
- Single-strand DNA-biding proteins: “Eucaryotic 		Replication Factor A” (RFA) 
 	Mantêm a fita estendida durante a duplicação.
- Topoisomerases: catalizam a quebra e a re-ligação 	de fitas de DNA
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Processo de duplicação do DNA
Sliding-clamp protein
PCNA
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Fidelidade da Replicação
Se a polimerase não pudesse corrigir erros haveria a inserção de 1 base errada a cada 104 bases incorporadas
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Atividade proof-reading da enzima 
(exonuclease 3’ ->5’):
reduz a taxa de erro para 1 base errada a cada 109
 Sistema de reparo reduz a taxa de erro para 1 base errada a cada 1010
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Telômeros e Telomerases:
	
Telomerase é uma transcriptase reversa: uma classe de DNA polimerases que sintetiza DNA a partir de uma “template” de RNA.
A telomerase carrega sua própria “template” de RNA, que é complementar à seqüência repetida nos telômeros, fazendo parte do complexo enzimático.
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Telomerases são essenciais para a preservação das extremidades dos cromossomas e, consequentemente, da integridade do genoma.
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Os segmentos mais importantes nos cromossomas são os segmentos que correspondem aos genes
Nos genes estão os planos de execução das diferentes proteínas
As proteínas exercem as funções celulares
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Definição de gene:
Seqüência de DNA cromossomal (genômica) contínua, ininterrupta, que constitui uma (ou mais) unidades transcricionais a partir do local de início de transcrição (extremidade 5’) até à seqüência correspondente ao sítio de poliadenilação (extremidade 3’) encontrada na mensagem transcrita (RNA). 
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Genes:
Os genes têm organização complexa, com EXONS E INTRONS
EXONS: Sequências de nucleotídeos que persistem no RNA maduro, podendo
ser ou não traduzidas em amino ácidos
INTRONS: Sequências que são transcritas e depois removidas durante o processamento do RNA 
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SEQUENCIAS REPETIDAS:
Dispostas uma em seguida da outra: “TANDEM SERIES OF REPEATS”
Sequências Satélites humanas:
Família alfa: (171 pb) centrômeros
TTAGGG: Telômeros (5.000 a 10.000 repetições)
LINES (Long Interspaced Elements): > 500 pb
Ex.: L1 (6.400 pb)
SINES (Short Interspaced Elements): < 500 pb
EX.: Família Alu (~ 300 pb)
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Elementos móveis do genoma:
Barbara McClintock (1940s):
Entidades genéticas que podiam se mover para dentro ou para fora dos genes, alterando as caracteísticas fenotípicas de espigas de milho.
Entidades genéticas similares foram posteriormente encontradas em bactérias e a base molecular do mecanismo de transposição foi elucidado. Logo se percebeu sua associação com os 
elementos de repetição.
Duas categorias de elementos móveis:
	- os que se transpõem diretamente como DNA - TRANSPOSONS
	- os que se transpõem utilizando uma molécula intermediária de RNA - isso envolve uma RNA polimerase e uma transcriptase reversa, para que volte novamente à forma de DNA-dupla fita - RETROTRANSPOSONS
Ex: LINE, SINE, Alu
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Transposons podem ser:
- não replicativos 
(simplesmente mudam de lugar)
- replicativos 
(primeiro é duplicado, depois uma cópia muda de lugar)