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Perhaps the more remarkable features of [myoglobin] are its complexity and its lack of symmetry. The arrangement seems to be almost totally lacking in the kind of regularities which one instinctively anticipates, and it is more complicated than has been predicted by any theory of protein structure. —John Kendrew, article in Nature, 1958 Estrutura tridimensional de proteínas Proteínas e Estrutura Tridimensional Proteínas, do grego proteios (primários), são polímeros com uma ou mais cadeias de polipeptídeos, podendo estar associadas a outras moléculas ou íons metálicos, e que desempenham papéis essenciais à sobrevivência dos sistemas vivos. Para a compreensão do modo de funcionamento de uma proteína é necessário, além de conhecer sua estrutura primária, evocar três outros níveis de complexidade das cadeias peptídicas envolvidas: estrutura secundária, terciária e quaternária. Supersecondary structures Domínios protéicos A essência está em construir um modelo de como a proteína se parece, seu mecanismo da ação que se traduz na função biológica, para usá-lo na otimização das interações com moléculas pequenas que se ligam a ela, com propriedades drug-like apropriadas. Mapa de densidade eletrônica Detalhes da proteína e interações Expressão da proteína e purificação Metodologia em biologia estrutural para definição e validação do alvo (proteína) Métodos térmicos (Itc, DSF RMN Experimentos (proteína e proteína- ligante) A sequência de aminoácidos da cadeia polipeptídica descreve a estrutura primária de uma proteína, sendo esta quem, de fato, determina a forma e a função da proteína. Estrutura primária de uma proteína A sequência dos aminoácidos na proteína é definida geneticamente, a partir da sequência dos nucleotídeos no DNA celular. Quando uma proteína em particular é necessária, o código do DNA para esta proteína é transcrito em uma sequência complementar de nucleotídeos, chamada de RNA mensageiro. A sequência de aminoácidos de uma proteína é ditada pelo RNA mensageiro (tradução). O RNA transportador carreia o aminoácido específico para realizar a elongação da proteína. . Transcrição Replicação Tradução Proteína Ribossomo Aminoácidos ligados Crescimento da cadeia peptídica Uma sequência de 3 nucleotídeos no RNA mensageiro especifica o aminoácido. Desta maneira, o organismo é capaz de sintetizar as várias proteínas com as funções mais diversas de que precisa. Estrutura secundária de uma proteína A estrutura secundária de uma proteína é determinada pela conformação local de seu esqueleto polipeptídeo, que resulta das seguintes contribuições: sequência de aminoácidos que compõe a estrutura primária; características da ligação peptídica e natureza dos grupos R ligados C que podem assumir diferentes conformações. Os ângulos de torção de um esqueleto polipeptídico apresentam uma contenção espacial resultante das características da ligação peptídica. A conformação do esqueleto pode ser descrita pelos ângulos diedros (ângulos de torção) em torno da ligação C-N (Φ) e C- C (Ψ) de cada um dos resíduos. Na conformação completamente distendida Φ e Ψ são definidos como 180° As ligações amida ou peptídica planas são conectadas por ligações tetraédricas por meio do C. Os parâmetros de rotação entre as ligações C-N e C-C são Φ e Ψ. Os valores positivos de Φ e Ψ correspondem a rotação no sentido horário a partir do C. A conformação ao lado representa Φ 180°e Ψ 180°, conformação completamente distendida. A rotação entre as ligações C-N e C-C podem causam a colisão do oxigênio carbonílico ou do hidrogênio do grupo amino de resíduos de aminoácidos adjacentes. Partindo de 0°, a rotação de 180° na direção horária é equivalente a (+180°) e a rotação no sentido antihorário é equivale a rotação (-180°). Determinadas conformações podem também causar colisões entre resíduos de aminoácidos que estão muito distantes da no peptídeo. Muitas das possíveis combinações de ângulos Φ e Ψ entre dois peptídeos planos representam uma conformação proibida em torno do C devido ao impedimento estéreo. C-N (Φ) = 0 C-C (Ψ) = 0 As várias forças não-covalentes (ligação hidrogênio, interações hidrofóbicas, interações eletrostáticas e forças de van der Waals) e ligação dissulfeto exercem extrema influência nas conformações das proteínas. De forma geral, a estabilização gerada por cada uma dessas interações pode ser altamente dependente da ambiente localizado da proteína. Interações que estabilizam as estruturas secundárias e terciárias Em 1951, Pauling e Corey com base nos estudos com aminoácidos e a ligação peptídica previram a existência das estruturas secundárias - hélice e β-folha, vários anos antes da primeira estrutura completa de uma proteína ter sido elucidada. -hélice -folha Estudos de raios X e de RMN revelam que a cadeia polipeptídica pode interagir consigo mesma de dois modos principais: pela formação de -hélice e de -folha (ou configuração ). Outros padrões de dobramento de peptídeos são as voltas (turns) e alças. Estrutura secundária -hélice Estrutura na qual o esqueleto polipeptídico está estreitamente enrolado ao longo do maior eixo da molécula e os grupos R dos resíduos de aminoácido projetam-se para fora da espiral. A estabilização se dá por meio de interações tipo ligações de hidrogênio entre os grupamentos NH e CO da cadeia principal. Colisões estéreas entre vários resíduos de aminoácidos com grandes cadeias laterais ramificadas podem desestabilizar -hélices. A estrutura secundária -hélice das proteínas possui um comprimento médio de ~12 resíduos de aminoácidos com 3,6 resíduos por volta (~5,4 Å), ou seja, cada grupo amida faz uma ligação hidrogênio com outro grupo amida à distância de três resíduos de aminoácido, e os grupos R estão todos dirigidos para longe do eixo da hélice. -Hélice (right-handed) (colágeno) -Hélice (left-handed) O dipolo elétrico da ligação peptídica é transmitido ao longo do segmento da - hélice por meio das ligações hidrogênio, resultando em hélice dipolar. Hélices anfifílicas atuam como disruptores do equilíbrio osmótico Representação do tipo Helix-wheel (considere como uma alfa-hélice vista de cima) do peptídeo LL-37, secretado por células imunes humanas. Percebe-se a separação de uma face hidrofóbica e outra hidrofílica. Alfa-hélices anfifílicas interagem primeiro perpendicularmente com a superfície das membranas até uma concentração crítica, quando passam a criar defeitos que permitem a passagem de solvente e soluto, ocasionando em morte celular. Estrutura secundária folha ß Caracteriza-se por um padrão estrutural em que as cadeias peptídicas de regiões vizinhas associam-se também por meio de ligações hidrogênio, resultando em uma estrutura achatada e rígida. Uma pequena rotação das ligações pode transformar uma estrutura laminar na estrutura denominada folha-pregueada ou configuração , a qual apresenta quantidades ótimas de ligações hidrogênio. Nas proteínas, as folhas contêm entre 2 e 12 cadeias polipetídicas, com uma média de 6 fitas. Cada fita pode conter até 15 resíduos, sendo a média de 6 resíduos. Cadeias laterais sucessivas de um polipeptídeo em folha estendem-se para lados opostos dessa folha, com repetições a cada dois resíduos de aminoácidos, em uma distância de 7Å. A conformação folha -pregueada fornece espaço suficiente aos grupos R expandirem-se para fora da folha, evitandoassim as repulsões de van der Waals. Arranjos entre as duas cadeias polipeptídicas adjacentes (cross linked): (a) paralelo no qual as ligações hidrogênio ocorrem entre cadeias que se estendem na mesma direção. (b) antiparalelo, onde as cadeias adjacentes que interagem seguem orientação inversa. Arranjos das folhas Arranjo paraleloArranjo antiparalelo Ligação hidrogênio em folhas β-pregueadas (a) arranjo paralelo e (b) arranjo antiparalelo Fibrilas formadas por folhas beta Doença de Alzheimer causada pela formação de placas devido o acúmulo de fibrilas insolúveis de peptídeos -amiloides (A 1-40). Moléculas interdigitadoras como potencial tratamento. Depósitos de fibrilas insolúveis dificultam a transmissão do impulso nervoso e levam à degeneração neuronal. Variações na estrutura secundária padrão Segmentos de com estrutura regular como α-hélice ou folhas β são unidas por segmentos peptídicos que mudam abruptamente de direção. Ocorrem na superfície das proteínas e, em geral, estão envolvidos nos processos de reconhecimento biológico. Voltas reversas (curvaturas β) - Conectam fitas sucessivas de folhas β antiparalelas e são estabilizadas por ligações hidrogênio. A maioria envolve 4 resíduos consecutivos de aminoácidos, mais ou menos organizados em modos do Tipo I e Tipo II. Tipo IITipo I Modelo de alça Ω, presente nos resíduos 40 a 54 do citocromo c. Alças Ω - Quase todas as proteínas com mais de 60 resíduos contêm uma ou mais alças de 6 a 16 resíduos, denominadas alças Ω, por apresentarem a forma de ferradura da letra grega. São entidades globulares compactas, pois as cadeias laterais tendem a preencher suas cavidades internas. Mais de 90% da Pro encontra- se na configuração trans, como nos demais resíduos. No entanto, ~6% da Pro está na configuração cis; em geral onde ocorrem as voltas. Volta reversa do Tipo II contendo Pro Ângulos não permitidos Plot de Ramachandran demonstrando as estruturas secundárias e os ângulos e associados. Resíduos de glicina podem ter os ângulos dihedrais em qualquer quadrante devido a ausência de repulsão estérica. Ramachandran versus estrutura secundária Probabilidade de ocorrência de determinados aminoácidos em estruturas secundárias. Pode-se utilizar essa informação para a predição de estrutura secundária somente a partir da primária mediante alguns algoritmos computacionais. Desestabilizadores de α-hélices Ligações iônicas entre resíduos estabilizam a hélice Resíduos hidrofóbicos e volumosos em barris beta. Maior flexibilidade da cadeia polipeptídica Composição de aminoácidos característica de estruturas secundárias p.A298P Doença chamada argininemia devido enzima arginase afuncional pela mutação no resíduo 298 com a substituição de uma Alanina por um resíduo de Prolina. Como a Prolina não permite ponte de hidrogênio pelo N ser terciário, quebra-se a periodicidade. Resíduos de prolina introduzem quebras em -hélices Estruturas secundárias absorvem diferentemente a luz circularmente polarizada Usa-se a absorbância diferencial da luz circularmente polarizada para a detecção de periodicidades na estrutura secundária de proteínas. É possível assim observar a reação de proteínas a temperatura, ligação com substratos e variação no pH, por exemplo. Direção constante, magnitude do vetor elétrico variável. Magnitude constante, direção variável Luz circularmente polarizada é emitida na rotação horária (RCP) e na anti-horária (LCP) ao mesmo tempo. Estruturas secundárias absorvem diferentemente a luz circularmente polarizada A absorção diferencial do componente RCP e LCP fará com que a luz circularmente polarizada se transforme em uma elipse. Usa-se a lei de Lambert-beer e calcula-se então a elipcidade molar de uma amostra. Uma varredura na região do UV (ligação peptídica) permite a diferenciação de padrões associados a determinadas estruturas secundárias. Estruturas secundárias de proteínas são opticamente ativas. Combinações simples de alguns elementos de estrutura secundária com arranjos geométricos específicos são chamados estruturas supersecundárias ou motivos. Característico de interação com DNA Característico de interação com Cálcio Parvalbumina Troponina-C Calmodulina Motivo helix-turn-helix (hélice-volta-hélice) Estruturas supersecundárias/motivos protéicos A figura do meio demonstra como o átomo de Cálcio está ligado a um dos motivos da proteína muscular Troponina-C por meio de seis átomos de oxigênio. Um O de cada cadeia lateria de Asp (D) 9, Asn (N) 11, Asp (D) 13, um do esqueleto carbônico do resíduo de aminoácido 15 e 2 da cadeia lateral de ácido Glutâmico. Adicionalmente, uma molécula de água está ligada ao átomo de Ca2+ Estruturas supersecundárias/motivos protéicos Motivo helix-turn-helix (hélice-volta-hélice) β Hairpin (Grampo β) – folhas β anti-paralelas de 2 a 5 resíduos conectadas por um loop. Não existe uma função específica associada a esta estrutura BPTI tem excepcional resistência à temperatura mantendo estrutura/função mesmo a 95°C. Estruturas supersecundárias/motivos protéicos Greek key (chave grega) – quatro folhas antiparalelas adjacentes conectadas por uma pequena alça. Não está associado a uma função específica, mas é comum em proteínas. Staphylococcus nuclease Enzima que degrada DNA. Perceba a chave grega Estruturas supersecundárias/motivos protéicos A chave grega Sequência de enovelamento predito para a chave grega. Primeiro forma-se um longo segmento de folhas antiparalelas conectadas por um loop. Depois disso o segmento 2 dobra-se em direção ao 1. - Beta-alpha-beta – duas folhas beta conectadas por uma alfa-hélice que une a porção C-terminal do segmento 1 ao N-terminal do segmento 2. As folhas beta são paralelas. A maioria das proteínas que contém folhas paralelas possuem este arranjo. Estruturas supersecundárias/motivos protéicos O eixo da hélice é paralelo as folhas Em proteínas , os aminoácidos da alça estão frequentemente envolvidos na ligação ao substrato. Estruturas supersecundárias/motivos protéicos Motivo da proteína Triosefosfato isomerase. Domínios protéicos Domínios são a unidade fundamental da estrutura terciária. Um domínio pode ser definido como uma cadeia polipeptídica ou parte de uma que pode enovelar independentemente em uma estrutura terciária estável. Os domínios são construídos de diferentes combinações de estruturas secundárias e motivos. Domínios são também unidades funcionais. Proteínas podem ser vistas como mosaicos de domínios. Domínios protéicos Estruturas com base em alfa-hélices Pacote de 4 hélices (4 Helix bundle) Citocromo b562, ferritina O pacote de -hélices está organizado de tal maneira que o interior das 4 hélices paralelas é hidrofóbico enquanto o exterior é hidrofílico. As hélices são sempre anti-paralelas. Domínios protéicos Estruturas alfa/beta Tipo mais frequente de domínio. Consiste em um barril central com alfas-hélices periféricas. Todas as enzimas da via glicolítica são do tipo /. Sítios ativos formados pelas alças. Porção hidrofóbica das - hélices em contato com a porção hidrofóbica de folhas Sítio ativo O interior dos barris é dominado por resíduos hidrofóbicos conservados e o sítio ativo das enzimas está em uma das extremidades. Domínios protéicos Estruturas beta Segundo maior grupo de proteínas. O cerne das proteínas é dado por 4 a 10 folhas antiparalelas. Retinol binding protein (182 resíduos) é uma estrutura beta up-and-down. Dois domínios idênticos do tipo chave grega Estrutura terciária de uma proteína É a forma tridimensional que resultado enovelamento da -hélice ou da folha β, sendo mantido pelas interações entre aminoácidos a longa distância, em geral ligações de hidrogênio e ponte dissulfeto. O enovelamento ocorre de modo a expor o máximo de grupos polares ao ambiente aquoso e acomodar o número máximo de grupos apolares em seu interior. Estrutura tridimensional de algumas proteínas pequenas heme Pontes dissulfeto aa sítio ativo Estrutura quaternária de uma proteína Certas proteínas, tal como a hemoglobina, são compostas por mais de uma unidade polipeptídica, guiadas e estabilizadas pelas mesmas interações da terciária, porém capazes de gerar uma estrutura tridimensional, importante na função. Estrutura quaternária da hemoglobina. (PDB ID 2HHB) analises de difração de raio X da hemoglobina, mostrando as quatro subunidades polipeptídicas enpacotadas e o grupo heme (vermelho). Estrutura primária, secundária, terciária e quaternária da insulina (21 aa) (30 aa) (51 resíduos aa) Ligação dissulfeto Espectrometria de massa em condições nativas Uso de tampões voláteis para a ionização de proteínas (NH4HCO3 ou NH4CH3CO2) permite a caracterização de complexos protéicos não-covalentes. Variação nas condições de ionização podem favorecer monômeros em detrimento de multímeros. Native-state mass spectrometry A estrutura terciária de uma proteína globular é mantida por um balanço delicado de atrações intramoleculares fracas e pontes dissulfeto. A desnaturação ocorre sob condições tão suaves que a estrutura primária do polipeptídeo permanece intacta, as ligações peptídicas não são afetadas, mas a estrutura terciária se desfaz. A desnaturação provoca mudanças de propriedades físicas e biológicas. A solubilidade diminui drasticamente (clara do ovo cozida). A desnaturação em geral é irreversível. Em alguns casos ocorre a renaturação (a proteína retorna a sua estrutura terciária estável), como no exemplo da ribonuclease bovina (ao lado). Desnaturação das proteínas Dobramento Ponte de sulfeto Região polar Região apolar Ligação hidrogênio Complexo metálico Classificação das proteínas pela forma tridimensional De acordo com a forma tridimensional, as proteínas podem ser classificadas como fibrosas e globulares. Proteínas globulares são enroladas e formam um conjunto compacto quase esférico. São solúveis em água e podem se deslocar dentro das células, exemplos: Exemplos e ocorrência Estrutura Funções Hemoglobina Quatro cadeias polipeptídicas (2 e 2β) Transporte de oxigênio Imunoglobinas Quatro cadeias polipeptídicas na forma de Y Resposta imunológica Ribonuclease bovina Cadeia polipeptídica interligada por pontes cruzadas de dissulfeto Enzima que controla a síntese de RNA A estrutura -helicoidal é encontrada em muitas proteínas fibrosas: miosina (proteína dos músculos), colágeno e -queratina (cabelos e unhas). Na fibroína da seda e teias de insetos a estrutura folha β é predominante. Exemplos e ocorrência Estrutura Características e funções -Queratina -Helicoidal (ligadas por pontes dissulfeto) Estruturas protetoras insolúveis e fortes, variando de flexível a rígida Fibroína da seda Folhas β Macia, filamentos flexíveis Colágeno Cadeias superenoveladas (tripla hélice ) Alta tensão com estiramento Proteínas fibrosas são formadas por cadeias de polipeptídeos arrumadas lado a lado em longos filamentos. Em geral são rígidas e insolúveis em água, exemplos: Proteínas com papel estrutural nas células são insolúveis em água, a exemplo das fibrosas (colágeno), onde a parte hidrofóbica de uma hélice associa-se com a porção hidrofóbica da outra. Proteínas que atuam em funções metabólicas em geral apresentam-se na forma globular compacta, como as globinas, onde as cadeias laterais dos aminoácidos hidrofílicos encontram-se externamente e as dos hidrofóbicos no interior, fazendo destas proteínas altamente solúveis em água. Mioglobina Proteína globular Cadeias laterais dos resíduos hidrofóbicos Leu, Ile, Val, e Phe Colágeno Proteína fibrosa Gly Proteínas de membrana se enovelam de tal maneira que as cadeias laterais dos aminoácidos hidrofóbicos são expostas nas regiões de associação com a membrana. As porções da proteína de membrana que se estendem do meio aquoso externo ou interno (citosol) têm características hidrofílicas, do tipo proteínas solúveis. Glicoforina – sialilglicoproteína da membrana do eritrócito Resíduos hidrofóbicos Estruturas das proteínas e suas funções biológicas Proteínas Miosina Movimento Catálise Estrutura Transporte Regulação e Sinalização Hemoglobina Imunoglobulina Quimoptripsina Colágeno Topoisomerase Histonas Insulina Canais iônicos
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