Cromatografia TERMOS TÉCNICOS E TEORIA

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Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos 
TERMOS TÉCNICOS E TEORIA 
DA CROMATOGRAFIA
Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos 
� Diluição do analito
• quase sempre acompanha a separação cromatográfica
• consiste no alargamento da zona original (banda de aplicação 
da amostra) à medida que os componentes da mistura são 
separadosseparados
• implica no uso de detectores mais sensíveis
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� Na separação cromatográfica, a velocidade de eluição das espécies
químicas presentes na amostra é diferente
� Essa velocidade depende da constante de equilíbrio durante o
processo de distribuição dos solutos entre a fase móvel e a fase
estacionária.
Amóvel Aestacionária
1. Constante de distribuição (Kc)
mm
ss
M
s
c
V/n
V/n
]A[
]A[
==
K [A]s = conc. molar de A na fase estacionária
[A]M = conc. molar de A na fase móvel
• Os valores de Kc afetam a separação dos componentes de uma amostra
• Kc é alterada com o tipo (e volume) das fases móvel e/ou estacionária 
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M
s
c ]A[
]A[K =
KA<KB<KC
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� A eluição dos componentes de uma mistura em um sistema
cromatográfico pode ser acompanhada em função do tempo ou do
volume de fase móvel.
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2. Tempo de retenção (tR) 
- é tempo decorrido entre a injeção da amostra e o ápice do pico
cromatográfico do analito
Tempo de retenção de composto não-retido (tM, tempo morto):
- tempo para eluição de um composto que não interage com a fase
estacionária;
- fornece a velocidade média de migração da fase móvel
Tempo de retenção ajustado (tR’ ou tE):Tempo de retenção ajustado (tR’ ou tE):
- tempo que o analito permanece na FE
tR = tE + tM
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Velocidades de soluto e fase móvel:
Velocidade linear média de migração do soluto pela coluna (cm.s-1):
Velocidade linear da fase móvel (cm.s-1):
Rt
L
=ν
L
=u
( )F.F.F.F. LLLL
=
L = comprimento da coluna
• A velocidade de migração de um soluto pode ser relacionada com sua 
constante de distribuição (Kc) :
Mt
L
=u
MEc /
x VVK
+
=ν
1
1
u 
ou
( )
MMMM
VVVV
F.F.F.F. LLLL
=u F = vazão da FM (cm
3
.min-1)
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3. Fator de retenção (k)
• parâmetro utilizado para comparar as velocidades de migração de
solutos em uma determinada coluna e fase móvel.
• corresponde ao intervalo de tempo que um soluto permanece na
fase estacionária em relação à fase móvel
• quando k << 1: pequena retenção (eluição próxima a tM)
• quando k >> 1: tempos de retenção muito longos
• o ideal é 1 < k < 10 para os analitos em uma mistura
M
E
M
MR
t
t
t
tt
=
−
=
kkkk
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4. Fator de separação ou seletividade (α)
• parâmetro de migração relativa entre dois analitos;
• pode ser determinado através das constantes de distribuição (K): 
• sendo B o soluto mais retido que A
• sempre α ≥ 1 (quando α = 1, A e B co-eluem)
A
B
K
K
=α
• pode ser determinado através dos fatores de retenção (k): 
... Ou pode ser determinado através de valores experimentais:
A
Bkkkk
kkkk
=α
( )
( )AR
BR
't
't
=α
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4. Fator de separação ou seletividade (α)
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Exemplo
1) Calcule o fator de retenção (k) dos compostos 1 e 2 na figura.
Dados: t0 = 2,5 min; tR1 = 13,1 min; tR2 = 27,0 min.
2) Calcule a seletividade (α)
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Alargamento da banda cromatográfica
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� analitos com retenções 
próximas: separação deficiente
� Picos mais largos e menos intensos = 
menor detectabilidade.
Alargamento da banda cromatográfica
pode comprometer a eficiência da separação cromatográfica
EFICIÊNCIA: Capacidade de eluição com o mínimo de 
dispersão do analito.
... MAS POR QUE ACONTECE??
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Alargamento da banda cromatográfica
As moléculas de cada componente migram com
velocidades desiguais devido a fenômenos de difusão e
transferência de massa
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TEORIA CINÉTICA DA CROMATOGRAFIA
- explica a migração dos analitos através da coluna, por mecanismo de
caminhos aleatórios;
- considere uma única molécula de analito:
- sofre milhares de transferências de fase (FM ↔ FE) durante a
eluição, com tempos de permanência irregulares;
- o movimento da molécula através da coluna ocorre apenas
quando ela está na FM;
- comportamento médio das moléculas de um analito: formação da
banda semelhante a uma curva Gaussiana
- largura da banda: diretamente relacionada com o tempo de
permanência na coluna e inversamente com a vazão da FM.
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Distorções (assimetria) de picos cromatográficos
Origem:
- Variação da constante de 
distribuição com a concentração
- Excesso de amostra (assimetria 
frontal)frontal)
- coluna com “buracos” na FE
• são indesejáveis, pois
prejudicam a qualidade da
separação e as tornam
menos reprodutíveis.
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• Martin e Synge: Prêmio Nobel 1952
Eficiência da coluna cromatográfica:
Archer John Porter MartinRichard Laurence Millington Synge
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Eficiência da coluna cromatográfica:
� 1941: Martin e Synge – comparação entre a coluna
cromatográfica e uma coluna de fracionamento por destilação
- considera que a coluna é constituída em camadas
estreitas e contínuas (“pratos”), onde ocorre o equilíbrio do
soluto entre FE e FM;
- o movimento do soluto através da coluna = transferência- o movimento do soluto através da coluna = transferência
da FM em equilíbrio entre pratos subsequentes;
- eficiência da coluna: aumenta com o número de
pratos e redução de sua altura
Altura de prato (H) e número de pratos (N): 
termos relacionados pela equação:
H
N
L
= L = comprimento da coluna (cm)
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- A teoria de pratos é conveniente para explicar a eficiência da coluna,
quando determina a altura de prato (H) para uma banda com formato
Gaussiano:
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Determinação experimental de H e N
2
R
W
t16 





=N
W = 4 σ
W = largura da base do triângulo formado pelas tangentes dos pontos 
de inflexão do pico cromatográfico (Gaussiano), em unidade de tempo
� conhecendo o comprimento da coluna (L), calcula-se H:
H
NL=
L = comprimento (cm) da coluna 
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�outro método para calcular N utiliza a largura a meia-altura.
2
545 





=
h
R
W
t
,N
Determinação experimental de H e N
•Aplicação dos valores de N e H: parâmetro de comparação do poder de 
separação e eficiência entre colunas.
Wh = 2,355 σ
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A tabela fornece alguns números de pratos usuais para as
colunas cromatográficas comuns.
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Assimetria de picos cromatográficos
•Determinação da assimetria de picos cromatográficos
com base em razões A/B.
• se o pico for uma curva de Gauss, A = B e A/B = 1
• Fator de assimetria: calculado a 10% da altura do pico
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Variáveis cinéticas que afetam a eficiência da coluna
�Alargamento de banda implica em menor eficiência da coluna
� quanto mais lento forem os processos de transferência de massa
durante a migração do soluto através da coluna, maior será o
alargamento.
Fatores que afetam :
� velocidade linear da fase móvel, coeficiente de difusão, fator de
retenção, diâmetro das partículas do recheio, espessura do filme líquido
que recobre o suporte.
1. Efeito da vazão da fase móvel: 
seu efeito é observado relacionando-se H com a velocidade linear 
da fase móvel (µ, em cm.s-1)
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Efeito da vazão da fase móvel na eficiência da coluna: 
Curva de van Deemter
�H mínimo ocorre em velocidade linear bem menor em CL do que em CG;
� H em CL é uma ordem de grandeza menor que em CG: colunas para CG 
apresentam comprimentos de 50m ou mais (em CL até ~25 cm); 
� separações em CG são mais rápidas e eficientes que em CL.
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Teoria do alargamento dos picos – Equação de van Deemter
Determina a eficiência da coluna cromatográfica pela expressão:
Cu
u
BAH ++=
difusão transferência 
H = altura de prato (cm)
u = velocidade linear da FM (cm.s-1)
A = coeficiente do efeito dos caminhos múltiplos (difusão turbilhonar)
B = coeficiente de difusão longitudinal
C = coeficiente de transferência de massa
difusão 
turbilhonar difusão 
longitudinal
transferência 
de massa
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1. Efeito dos caminhos múltiplos (difusão turbilhonar) (A)
• As moléculas do analito alcançam a extremidade
final da coluna em tempos diferentes, uma vez
que podem percorrer caminhos diversos
Teoria do alargamento dos picos – Equação de van Deemter Cuu
BAH ++=
Na figura: 1 chegará antes que 2
� não é afetado pela velocidade da FM.
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Teoria do alargamento dos picos – Equação de van Deemter
1. Efeito dos caminhos múltiplos (difusão turbilhonar)
• para minimizar esse efeito: utilizar colunas com diâmetros internos 
pequenos, recheadas homogeneamente com partículas de pequeno 
diâmetro e tamanho uniforme;
Cu
u
BAH ++=
A = 2 λ dp
A = caminhos múltiplos
λ = cte.,depende da qualidade da FE
dp = diâmetro da partícula da FE (cm)
• para coluna tubulares capilares abertas, A = zero 
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Teoria do alargamento dos picos – Equação de van Deemter
2. Difusão longitudinal, (B/u)
• resultado da migração de um analito do centro da banda (maior conc.) 
para as regiões mais diluídas, em ambos os lados;
• depende do coeficiente de difusão, que varia para cada substância;
• é inversamente proporcional à velocidade linear da FM (u): quanto 
Cu
u
BAH ++=
• é inversamente proporcional à velocidade linear da FM (u): quanto 
menor o fluxo, mais tempo o analito passa na FM e maior a difusão;
• ocorre em maior extensão em CG que em CL.
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Teoria do alargamento dos picos – Equação de van Deemter
3. Transferências de massa (C u)
Divide-se em: transferência de massa na fase estacionária (Cs u)
transferência de massa na fase móvel (CM u)
� Transferência de massa na fase estacionária (Csu)
• FE = superfície sólida � Cs depende do tempo de adsorção e dessorção
Cu
u
BAH ++=
s
• FE líquida � Cs depende da espessura do filme e do coeficiente de difusão 
do soluto, neste caso:
Csu = f(k) df2 u
Ds
k = fator de retenção
df = espessura do filme líquido que 
recobre o suporte cromatográfico
Ds = coeficiente de difusão na FE
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• uma pequena parte da FM encontra-se 
estagnada nos poros da FE;
• torna mais lento o processo de troca do 
3. Transferências de massa (C u)
Teoria do alargamento dos picos – Equação de van Deemter Cuu
BAH ++=
• torna mais lento o processo de troca do 
analito entre FE e FM
• quanto maior o volume da partícula da FE, 
maior o volume estagnado 
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Teoria do alargamento dos picos – Equação de van Deemter
3. Transferências de massa (C u)
� Transferência de massa na fase móvel (CM u)
• processos complexos, dependem da velocidade da FM
• inversamente proporcional ao coeficiente de difusão do analito na FM
Cu
u
BAH ++=
Transferências de massa (C u):
diretamente proporcional à velocidade linear da fase móvel (u), pois esta
influencia o tempo necessário para o analito estabelecer o equilíbrio entre
as fases móvel e estacionária.
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Contribuição dos termos da Equação de van Deemter para a altura do prato
A = efeito dos caminhos múltiplos; B/u = difusão longitudinal; Cu = transferência de massa
Velocidade 
ótima da 
FM
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Redução do alargamento de bandas cromatográficas
� colunas recheadas: redução do diâmetro das partículas da FE
� colunas capilares abertas: redução do diâmetro do tubo
Efeito do tamanho da partícula na altura de prato para colunas recheadas.
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Redução do alargamento de bandas cromatográficas
• em CG: velocidade da difusão longitudinal com diminuição da temperatura 
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Otimização da Separação Cromatográfica
Objetivo: componentes da amostra bem separados, em um tempo mínimo
O que precisa ser feito:
� reduzir o alargamento do pico (modificação de H)
� modificar as velocidades de migração relativas dos componentes 
(retenção e fatores de separação)
Resolução de uma coluna (Rs)
• fornece a capacidade de separação da coluna em relação a dois analitos
específicos, considerando a distância relativa entre bandas cromatográfica 
vizinhas e suas respectivas larguras*
• para melhorar a resolução, pode-se aumentar o comprimento da coluna 
(e, consequentemente, N), mas aumenta também o tempo de análise...
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Resolução (Rs)
)B(b)A(b
ARBR ])t()t[( WWR
+
−
=
2ssss
Rs= 1,5 (“resolução 
de linha de base”)
Métodoscromatográficos Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos 
Resolução e razão entre picos adjacentes
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Resolução cromatográfica (Rs) e os fatores que afetam a 
separação de picos






+






α
−α
=
B
B kkkk
kkkk
ssss
1
1
4
NR
Rs = resolução cromatográfica
N = número de pratos teóricos
α = seletividade (fator de separação)
kB = fator de retenção do analito mais retido
eficiência seletividade retenção
� para obter boa separação cromatográfica, k, N e α podem ser 
ajustados separadamente.
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Otimização da separação cromatográfica
Modifica-se N: 
- alterando a vazão da fase móvel (próximo de Hótimo)*
- redução do diâmetro da partícula do enchimento
- alteração da viscosidade da fase móvel (coeficiente de difusão)- alteração da viscosidade da fase móvel (coeficiente de difusão)
- modificando a espessura do filme líquido da FE
� aumentar N através do tamanho da coluna aumenta o tempo de 
análise: melhor aumentar N através de redução de H.
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Otimização da separação cromatográfica
Exemplo:
Rs = 2,9
Tempo análise: 21 min
Pressão: 990 psi
Rs = 2,3Rs = 2,3
Tempo análise: 12 min
Pressão: 1980 psi
Rs = 2,0
Tempo análise: 10min
Pressão: 830 psi






+






α
−α
=
B
B kkkk
kkkk
ssss
1
1
4
NR
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Otimização da separação cromatográfica
� A equação da resolução pode ser rearranjada, de modo que se
possa calcular o número de pratos necessários para obter Rs
satisfatório:
22
2 1
1
16 




 +






−α
α
=
BN k
kRs
 + α B
kkkk
14 1  −α B
k
... ou rearranjada para determinar o tempo de análise necessário:
u
H
.
)(
.tR 2
32
2 1
1
16 B
Bs k
kR +






−α
α
=
Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos 
Otimização da separação cromatográfica
α e k: são modificados com alterações de temperatura e composição 
da fase móvel (mudar a FE é menos conveniente)
� Fator de retenção (k):
• aumento em k normalmente resulta 
R
• valor ótimo para k: entre 1 e 5
• Modificações em k:
- CG: modifica-se temperatura
- CL: composição da FM*
em aumento de Rs, porém também do 
tempo de análise*






α
−α
=
1
4
NQ
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Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos 
ótimo para 1 e 2
ótimo para 5 e 6
Problema geral de eluição...
ótimo para 3 e 4
Como fazer?? Modificar a composição da FM (ou temperatura) durante a análise: 
eluição em gradiente ou programada (CL) ou programação de temperatura (CG) 
Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos Métodos cromatográficos 
Otimização da separação cromatográfica
� seletividade (α)
• mudança na composição da FM
• alterar temperatura da coluna (modifica k e também α)
• trocar a fase estacionária (natureza química e tipo de interações, • trocar a fase estacionária (natureza química e tipo de interações, 
fabricante)
• uso de efeitos químicos especiais
Efeito da Seletividade – exemplo: Modificações na fase móvel
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Exercícios...
Mt
L
=u
( )
MMMM
VVVV
F.F.F.F. LLLL
=u
Velocidade linear da FM:
Volume da FM: 
VM = tM F
Resolução: 
)B(b)A(b
ARBR ])t()t[( WWR
+
−
=
2ssss






+






α
−α
=
B
B kkkk
kkkk
ssss
1
1
4
NR
M M
Fator de retenção:
M
E
M
MR
t
t
t
tt
=
−
=
kkkk
A
Bkkkk
kkkk
=α
( )
( )AR
BR
't
't
=α
Fator de separação:

Número de pratos: 
H
N
L
=
2
R
W
t16 





=N
Constante de distribuição (K):
S
M
V
V.
kkkk
=
KKKK2






= hhhh
RRRRWWWW
tttt5,54
5,54
5,54
5,54
N
EXERCÍCIOS - exemplos
Uma substância, com tempo de retenção de 407 s, tem um pico
com largura de 13 s na base em uma coluna de 12,2m de
extensão. Determine o número de pratos teóricos e a altura do
prato
EXERCÍCIOS - exemplos
Resp. N = 1,57 x 104;
H = 0,78 mm