AULA CALIBRAÇÃO 19 08

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CALIBRAÇÃO 
 
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1º - Padrões externos 
 É a forma mais utilizada de calibração. São utilizadas soluções 
contendo concentrações conhecidas do analito. 
 
 
 
 
Formas de calibração 
Os padrões são considerados 
“externos” pois são preparados e 
analisados separadamente das 
amostras. 
 
Normalmente são utilizados 
soluções com concentrações 
crescentes do padrão do analito e 
correlacionando-se a resposta 
instrumental com a concentração, 
se obtêm uma curva de 
calibração. 
 
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Formas de calibração 
• A curva de calibração pode ser linear (correlação entre resposta instrumental 
e concentração apresenta função linear) ou polinomial (correlação entre 
resposta instrumental e concentração apresenta função polinomial). 
 
Curva de calibração Curva de calibração 
 linear não linear 
 
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Formas de calibração 
• A curva linear é mais adequada pois apresenta a mesma sensibilidade para toda 
a faixa de calibração. Nas curvas não lineares, a sensibilidade é função da 
concentração. 
• Um método espectrofotometrico para a determinação quantitativa de 
Pb2+ em sangue forneceu uma curva de calibração linear com a seguinte 
equação: 
 
Y = 0.296 X + 0.003 
 
Sabendo que a curva foi construída na faixa de ug/L, qual a concentração de 
Pb em uma amostra que apresentou uma absorbância de 0.397? 
Exemplo 
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Formas de calibração 
Limitação da curva de calibração normal 
 
• A relação entre a resposta instrumental (Spadrão e Cpadrão) é 
determinada quando o analito está presente na matriz da solução 
padrão que pode ser diferente da matriz da amostra. 
 
• Quando se utiliza a curva de calibração normal, assumimos que 
qualquer diferença entre a matriz dos padrões e a matriz da amostra 
não afeta a inclinação da curva (sensibilidade). 
 
• Um erro proporcional determinado é introduzido quando as 
diferenças entre as duas matrizes afetam a sensibilidade, como 
ilustrado na figura. 
 
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Formas de calibração 
Para se avaliar se as diferenças entre as inclinações das curvas são 
significativas, pode se aplicar os testes estatísticos F e t. 
Formas de calibração 
 
• Quando o efeito de matriz é esperado e a matriz da 
amostra é conhecida, pode-se realizar uma curva por ajuste 
de matriz (matrix matching). 
 
• Neste método de calibração, a matriz da amostra é 
adicionada nos padrões de calibração de modo a se 
compatibilizar a matriz e minimizar os erros. 
 
Obs: nem sempre se consegue realizar o ajuste de matriz, 
pois muitas vezes é difícil obter a matriz sem o analito. 
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Formas de calibração 
2º - Adição de padrão 
 
• É uma forma de calibração muito utilizada quando se tem efeito de 
matriz e não é possível realizar o ajuste de matriz. 
 
• Neste método de calibração, quantidades conhecidas do analito são 
adicionadas a balões contendo volumes fixos da amostra. 
Posteriormente, o volume do balão é completado com um diluente 
adequado (água, ácidos diluídos, solventes orgânicos, etc.) 
 
• As respostas instrumentais são obtidas para cada uma das soluções e 
se obtém a relação linear entre a quantidade de analito adicionada e a 
resposta instrumental. 
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Formas de calibração 
2º - Adição de padrão 
Exemplo do preparo 
de uma curva de 
calibração por adições 
de padrão 
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Formas de calibração 
2º - Adição de padrão 
 
• Cuidados 
 
• Deve-se ter uma idéia da concentração do analito na 
amostra para se definir a alíquota da amostra a ser tomada 
e as adições do padrão que serão realizadas. 
 
• A faixa linear da técnica de medida deve ser respeitada, 
ou seja, a soma da concentração do analito na amostra e da 
adição do padrão no último ponto deve ser menor que 
limite da faixa linear. 
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Formas de calibração 
2º - Adição de padrão 
 
• Cálculo 
Extrapolação no gráfico 
ou 
Utilizar a equação linear 
e calcular x quando y = 0 
 
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Formas de calibração 
2º - Adição de padrão 
 
• Como a curva de calibração por adição de padrão é construída na 
amostra, ela não pode ser estendida para a análise de outras amostras. 
Desta forma, para cada amostra deve-se construir uma curva de 
calibração. Este fato dificulta a aplicação deste método de calibração 
para análises de rotina, onde um grande número de amostras precisa 
ser analisado. 
 
• O método de adições de padrão pode ser utilizado para checar a 
validade da curva de calibração por padrões externos (avaliação do 
efeito de matriz). 
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Formas de calibração 
3º - Padrão Interno 
 O sucesso da utilização dos métodos de calibração com padrões internos e de 
adições de padrão depende da habilidade do analista manusear amostras e 
padrões reprodutivelmente e da estabilidade do equipamento. 
 
• Quando o procedimento não pode ser controlado de forma que todas as 
amostras e padrões são tratados igualmente, a exatidão e precisão do método 
podem ser comprometidos. 
 
• Nos casos onde o processo analítico não é reprodutível, a padronização é 
possível se o sinal do analito for referenciado ao sinal gerado por outra 
espécie que foi adicionada em concentração fixa e conhecida em todos os 
padrões e amostras. 
 
• A espécie adicionada é chamada de padrão interno e deve ser 
essencialmente diferente do analito. 
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Formas de calibração 
3º - Padrão Interno 
• Desde que o analito e o padrão interno em qualquer amostra ou padrão 
recebem o mesmo tratamento e estão sujeitos as mesmas variações, a razão 
dos sinais não será afetada. 
 
• Se uma solução contem um analito de concentração CA e um padrão interno 
de concentração CPI, então o sinal devido ao analito, SA, e ao padrão interno, 
SPI, são: SA = kACA e SPI = kPICPI 
 
Sendo kA e kPI, as sensibilidades do analito e do padrão interno 
Para se facilitar a aplicação do padrão interno, plota-se a curva de calibração 
relacionando-se a razão sinal do analito (SA)/sinal do padrão interno (SPI) X a 
concentração do analito (CA) 
 
Para se obter a concentração do analito na amostra, basta utilizar a razão sinal 
do analito na amostra/sinal do padrão interno e jogar na equação da curva de 
calibração. 
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Formas de calibração 
3º - Padrão Interno 
 Características desejáveis: 
• Ter comportamento semelhante ao do analito de interesse, de 
forma a estar sujeito as mesmas interferências e flutuações que 
o analito. 
 
• Ser detectado simultaneamente ao analito (técnicas 
multielementares) e ter sinal distinto do sinal do analito. 
 
• Idealmente não estar presente na amostra (adiciona-se uma 
quantidade conhecida e constante) em todas as soluções 
(brancos, padrões, amostras). 
 
 
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Exemplo 
 Na determinação de anfetaminas em urina por HPLC, a efedrina foi utilizada 
como padrão interno. Os dois compostos apresentam tempos de retenção 
distintos. Os resultados obtidos para a curva de calibração, branco e amostra 
são apresentados abaixo: 
 
Amostra Conc. Analito 
(mg/L) 
Área Conc. PI (mg/L) Área 
Branco 0 216 1,0 50289 
Padrão 1 0,05 4529 1,0 48370 
Padrão 2 0,10 11312 1,0 52360 
Padrão 3 0,25 18659 1,0 42390 
Padrão 4 0,50 43269 1,0 46350 
Padrão 5 1,0 98562 1,0 53240 
Branco amostra - 515 1,0 47235 
Amostra - 63917 1,0 56759 
 
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Métodos espectrométricos e cromatográficos 
Formas de calibração 
1º - Padrões externos 
Concentração (crescente) x Resposta Instrumental 
 
2º - Padrões internos 
 
C 
R
I 
Curva de calibração 
Curva de calibração com 
adição de matriz 
Curva com ajuste de matriz 
Inclinações das curvas avaliadas pelos 
testes estatísticosF e t. 
Tcalc < Ttab as médias 
não diferem 
Tcalc > Ttab as média 
diferem 
Adição de Padrão 
Quando não existir matriz 
sem o analito 
Estratégia para melhorar a 
exatidão e precisão 
PI adicionado em todas as soluções 
(brancos, padrões, amostras) 
Resumo 
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Parâmetros para calibração 
Coeficiente de correlação – utilizado para estimar 
o ajuste dos pontos experimentais à linha que é 
utilizada para estabelecer a relação linear. 
 




i i
ii
i
i
i
yyxx
yyxx
r
2/122 ])(][)({[
)])([(
-1 ≤ r  +1 
19 
Exemplos 
R = 1
0
2
4
6
8
10
12
14
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Concentração
Re
sp
os
ta 
in
str
um
en
tal
R = -1
0
2
4
6
8
10
12
14
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
concentração
Re
sp
os
ta 
in
str
um
en
tal
R = 0.3865
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 2 3 4 5 6
Concentração 
Re
sp
os
ta 
in
str
um
en
tal
Em química analítica normalmente se trabalha com valores de r > que 0,99 (em 
módulo) 
21 
Pelo Excel.... 
y = 1,9304x + 1,5179
R2 = 0,9978
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8 10 12 14
Série1
Linear (Série1)