Provas Bioquimicas de Identificacao de Enterobacterias

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

Provas Bioquímicas para Identificação de Enterobactérias
 Fabíola Castro
Introdução
As bactérias podem ser identificadas por características do seu metabolismo, como a capacidade de degradar determinados substratos e produzir gases.
As provas bioquímicas utilizam meios de cultura e reagentes específicos para detectar metabólitos resultantes da atividade bacteriana, auxiliando na sua identificação.
As provas mais conhecidas são:
Utilização de fontes de carbono 
Utilização de fontes de nitrogênio
Produção de enzimas
Motilidade
Fermentação de carboidratos
Quebra de carboidratos para obtenção de energia com produção de ácido ou ácido e gás.
Ácido – mudança de cor de vermelho para o amarelo
Gás – Bolhas no tubo de Durhan 
( ver no tubo de glicose)
Fermentação da Lactose
Verificar a produção da enzima beta galactosidase, que quebra a ligação beta galactosídica, liberando a glicose para ser metabolizada
Fermentação da Sacarose
Verificar a produção da enzima invertase, que quebra a sacarose em frutose e glicose, que será posteriormente metabolizada.
Vermelho de Metila (VM)
Avalia se as bactérias produzem ácidos a partir da fermentação da glicose pela via ácida mista.
Podem ser produzidos: ácido fórmico, lático, acético, provocando redução do pH abaixo de 4,4 ( viragem do indicador). 
Todas as enterobactérias fermentam glicose.
Porém, algumas, durante a fase final de incubação, convertem esses ácidos a produtos não ácidos como o etanol e a acetoína, resultando num pH mais elevado (pH 6). 
O indicador de pH é o vermelho de metila 
pH abaixo de 4,4 é vermelho 
acima de 6 é amarelo
Voges Proskauer (VP)
Há bactérias que utilizam a fermentação butilenoglicólica.
Fermentam a glicose produzindo acetil-metil-carbinol (acetoína), butilenoglicol e pequenas quantidades de ácidos. 
Quando KOH é adicionado, e na presença de O2 atmosférico, a acetoína é oxidada a diacetil. 
A adição de alfa-naftol nesta reação catalisa a produção de um anel vermelho tijolo, após 10-15 minutos.
Lisina, Arginina e Ornitina
 A descarboxilação é a remoção de um grupo carboxila de uma molécula orgânica. As bactérias que crescem num meio líquido descarboxilam aminoácidos mais ativamente quando as condições são anaeróbias e ligeiramente ácidas. A descarboxilação de aminoácidos, como a lisina, resulta na produção de uma amina e de dióxido de carbono.
 		Cada enzima descarboxilase é específica para um aminoácido. Lisina, arginina e ornitina são os três aminoácidos habitualmente avaliados na identificação das enterobactérias e produzem as seguintes aminas específicas: 
 Lisina  cadaverina
 Arginina  citrulina
 Ornitina  putrescina
 
Quando certas bactérias fazem fermentação são produzidos produtos ácidos que tornam o meio ácido e portanto hostil. Assim, muitas descarboxilases são ativadas por um pH baixo, pois ao remover os grupos ácidos dos aminoácidos produzem aminas que aumentam o pH do meio que fica mais adequado. 
Os ácidos produzidos pelas bactérias a partir da fermentação da glicose vão inicialmente baixar o pH do meio e causar a mudança de cor do indicador de pH de púrpura para amarelo. O pH ácido ativa então a enzima que causa descarboxilação da lisina a aminas e a subsequente neutralização do meio que muda de amarelo para púrpura outra vez.
 		Na conversão de arginina em citrulina, intervém uma deidrolase, ao invés de uma descarboxilase, visto que na primeira etapa o NH2 é retirado da arginina.
 		Logo após, a citrulina é transformada em ornitina que, em seguida, sofre descarboxilação para formar a putrescina.
Tubo 1 – tubo controle (coloração roxa com aspecto límpido)
Tubo 2 – teste negativo (coloração amarela do indicador de pH)
Tubo 3 – teste positivo (coloração roxa do indicador de pH)
Produção de Indol
O indol é resultante da degradação do aminoácido triptofano pela enzima triptofanase. A prova é realizada inoculando-se o meio contendo excesso de triptofano. Após a incubação colocar 0,5 ml do reagente de Kovacs através da parede interna do tubo.
 A prova é positiva quando na porção superior desenvolve-se um anel de cor rósea dentro de no máximo 5 minutos. Este resultado é devido à complexação do indol com o aldeído, em meio ácido, formando o composto colorido . A prova é negativa com qualquer outra tonalidade de cor (original do meio ou marrom).
Produção de H2S
Algumas bactérias são capazes de degradar aminoácidos contendo enxofre através da tiossulfato redutase.
Ocorre a produção de H2S, um gás que é incolor. 
O H2S reage com o ferro (indicador) contido no meio formando um precipitado preto (sulfeto ferroso). 
Para que esta reação ocorra, é necessário que o meio esteja ácido.
Fenilalanina
Há bactérias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina presente no meio
Origina o ácido fenilpirúvico.
O ácido fenilpirúvico reage com o cloreto férrico (10%) adicionado ao meio, formando uma cor verde. 
.
Citrato de Simmons
Determina se a bactéria é capaz de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono para crescer.
Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, contendo citrato de sódio, fosfato de amônia e azul de bromotimol.
Com a facilidade do transporte de citrato pela citrato-permease há a sua utilização pela citrase, com produção de hidróxido de amônia que eleva o pH, fazendo com que a reação se torne azul. 
Nesse teste, utilizam-se tubos com meio inclinado para a cultura ter mais acesso ao oxigênio, que é necessário para utilização do citrato. 
O CO2 produzido reage com o sódio do citrato formando carbonatos de reação alcalina.
Motilidade
A motilidade é observada através do aspecto do meio.
Utiliza-se um meio semi-sólido o que permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo. 
Se a bactéria for móvel (motilidade positiva), o aspecto do meio será turvo
Se a bactéria for imóvel (motilidade negativa), o crescimento só será observado no local de inoculação. 
Produção de Urease
Há bactérias que possuem a enzima urease - capacidade de degradar a uréia presente no meio liberando amônia, CO2 e H2O. 
A amônia reage formando carbonato de amônia que alcaliniza o meio. 
O indicador de pH é o vermelho de fenol, que em meio alcalino toma a coloração pink. 
Uma coloração meio rosa é suficiente para considerar a reação positiva.