Virologia Veterinária_EDUARDO FLORES
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presença do antígeno no material 
é revelada pela ação da enzima no substrato. Uti-
lizam-se substratos cromogênicos (aminoetilcar-
bazol \u2013 AEC; diaminobenzidina \u2013 DAB; ou 4-clo-
ronaftol) que produzem uma coloração marrom 
ou marrom-carmim pela ação da enzima e for-
mam um precipitado na célula positiva (Figura 
3.4). A IPX indireta utiliza o anticorpo primário 
especí\ufb01 co para o antígeno, e o anticorpo secun-
dário é marcado com a enzima. Essa variação da 
Antígenos virais
Anticorpo
antivírus-FITC
Anticorpo
anti-IgG-FITC
Anticorpo antivírusCélula infectada
Imunofluorescência
direta
Imunofluorescência
indireta
A B
Figura 3.3. Ilustração demonstrativa da técnica de
imunofluorescência para a detecção de antígenos virais
em células. (A) Imunofluorescência direta (IFD); (B)
Imunofluorescência indireta (IFI).
2.3.2 Imunoperoxidase
A técnica de imunoperoxidase (IPX) baseia-
se no mesmo princípio da IFA, com a diferença 
que os anticorpos são marcados com uma enzi-
ma, que pode ser a horseradish peroxidase (HRPO 
Antígenos virais
Anticorpo
antivírus \u2013 HRPO
Anticorpo
anti-IgG-HRPO
Anticorpo antivírusCélula infectada
Imunoperoxidase
direta
Imunoperoxidase
indireta
A B
Figura 3.4. Ilustração demonstrativa da técnica de
imunoperoxidase (IPX) para a detecção de antígenos
virais em células. (A). Imunoperoxidase direta; (B)
Imunoperoxidase indireta.
Substrato
Detecção, identifi cação e quantifi cação de vírus 67
técnica apresenta maior sensibilidade devido à 
ampli\ufb01 cação do sinal. A técnica de IPX possui 
as mesmas aplicações da IFA, porém apresenta 
a vantagem de não necessitar do microscópio de 
luz UV, já que as reações podem ser visualizadas 
sob microscopia ótica comum.
2.3.3 Ensaio imunoenzimático 
O teste imunoenzimático (ELISA) pode ser 
utilizado para a detecção de antígenos virais e 
também de anticorpos. É uma técnica que apre-
senta vantagens, tais como: a boa sensibilidade, 
especi\ufb01 cidade, baixo custo, repetibilidade e ver-
satilidade. Em alguns casos, o uso da técnica per-
mite a detecção de até 1 ng (nanograma) de antí-
geno por grama de tecido coletado diretamente 
do animal. Os testes podem ser executados em 
amostras individuais, como recurso diagnóstico 
em clínicas ou consultórios; ou em grande esca-
la, como realizado em laboratórios totalmente 
automatizados. A técnica permite uma variação 
de formas e aplicações, dependendo do objetivo e 
da disponibilidade de reagentes. Basicamente, os 
testes de ELISA podem ser classi\ufb01 cados em dire-
tos, indiretos ou de competição. 
A técnica baseia-se na imobilização da re-
ação antígeno-anticorpo em um suporte sólido 
(placas de poliestireno), seguida de uma reação 
colorimétrica. Por se tratar de uma técnica que 
apresenta inúmeras variações, neste capítulo será 
apresentado apenas o fundamento geral da técni-
ca. Para um detalhamento maior, recomenda-se a 
literatura especí\ufb01 ca. 
Um exemplo simpli\ufb01 cado para facilitar o 
entendimento da técnica será brevemente descri-
to. No ELISA de captura direto (Figura 3.5) para 
detecção de antígenos virais, placas de 96 cavi-
dades são recobertas com anticorpos especí\ufb01 cos 
para um determinado agente. A amostra suspei-
ta da presença viral (sangue, secreções ou leite) é 
adicionada e incubada por um determinado tem-
po. Nesse período, ocorre a captura do antígeno 
(amostras positivas) pelo anticorpo \ufb01 xado na pla-
ca. Após essa etapa, são realizadas lavagens para 
a remoção de substâncias inespecí\ufb01 cas. A seguir 
adiciona-se um segundo anticorpo, especí\ufb01 co 
para o vírus, conjugado com a enzima (HRPO ou 
AP). Novamente os anticorpos que não se liga-
ram são removidos por lavagens. A con\ufb01 rmação 
da presença do antígeno viral é evidenciada pela 
adição de substrato e desenvolvimento da colo-
ração especí\ufb01 ca nas amostras negativas. A leitura 
é realizada pela inspeção visual ou pelo uso de 
fotocolorímetro. 
Incubação da
amostra suspeita
Lavagem
Anticorpos
antivirais
Antígenos na
amostra
suspeita
Anticorpo
antivírus
Lavagem
Anticorpos
marcados
Adição do
substrato
Positivo Negativo
Mudança
de cor
A B
Figura 3.5. Ilustração demonstrativa do ensaio
imunoenzimático (ELISA) para a detecção de antígenos.
(A)Amostrapositiva; (B)Amostranegativa.
2.3.4 Radioimunoensaio
O método de radioimunoensaio (RIA) de 
detecção de antígenos foi muito utilizado antes 
do surgimento dos testes de ELISA. A diferença 
básica entre os dois métodos reside no tipo de 
marcação utilizada. Na RIA, utiliza-se um isó-
topo radioativo em vez de enzima. O método é 
muito sensível e pode ser automatizado, porém 
os equipamentos requeridos são caros. A prin-
cipal restrição do teste refere-se ao uso de subs-
tâncias radioativas e ao descarte dos reagentes. 
Dessa forma, a técnica encontra-se em desuso 
progressivo.
68 Capítulo 3
2.3.5 Imunocromatografi a
A imunocromatogra\ufb01 a é uma técnica de 
visualização simples, geralmente realizada em 
dispositivos plásticos, podendo ser executada em 
clínicas e ambulatórios. A prova é baseada na rea-
ção antígeno-anticorpo, em que a amostra suspei-
ta (vírus ou antígenos virais) é passada através de 
um \ufb01 ltro e, então, impregnada em uma membra-
na, onde reagirá com o anticorpo especí\ufb01 co pre-
viamente imobilizado. A presença do antígeno é 
revelada pelo aparecimento de focos ou bandas 
coloridas, pois os reagentes são conjugados com 
substâncias cromógenas. O resultado depende 
essencialmente da qualidade dos reagentes. Um 
dos problemas do teste é o seu custo elevado. Vá-
rios testes diagnósticos são baseados nesse prin-
cípio (Capítulo 11).
2.3.6 Aglutinação em látex 
O ensaio de aglutinação em látex provavel-
mente seja o método mais simples de detecção de 
antígenos virais. O princípio da técnica baseia-se 
na mistura do material suspeito com anticorpos 
previamente adsorvidos a partículas de látex. A 
presença do antígeno resultará na sua ligação 
aos anticorpos e na aglutinação das partículas. 
A leitura da reação é visual e pode ser realizada 
imediatamente após a sua execução. Esta técnica 
tem aceitação por pequenos laboratórios e entre 
técnicos de campo. As suas principais restrições 
referem-se à baixa sensibilidade e especi\ufb01 cidade. 
Por isso, resultados falso-negativos são freqüen-
tes, a não ser que grandes quantidades de antí-
genos estejam presentes no material suspeito. A 
resolução dos problemas de sensibilidade e espe-
ci\ufb01 cidade pode aumentar a sua aplicabilidade.
2.3.7 Imunodifusão em ágar 
 
O teste de IDGA foi desenvolvido para a 
detecção de antígenos, porém tem sido mais uti-
lizado para a detecção de anticorpos. A prova é 
baseada na precipitação de complexos antígeno-
anticorpos em gel de ágar. O ensaio é realizado 
pela adição da amostra suspeita e do soro con-
trole em orifícios em posições opostas em uma 
matriz de ágar. As amostras difundem-se radial-
mente pelo gel e, ao se encontrarem, proporcio-
nam a reação antígeno-anticorpo, seguida da in-
solubilização e precipitação. A precipitação deste 
complexo forma linhas opacas no gel (linhas de 
precipitação), que podem ser visualizadas a olho 
nu, com o auxílio de uma fonte de luz (ver Figura 
11.9, no Capítulo 11). A IDGA é uma técnica bas-
tante difundida para a detecção de anticorpos, 
porém sem muita aplicabilidade para a detecção 
de antígenos ou partículas víricas.
2.3.8 Imunoblots
O princípio dos imunoblots é semelhante ao 
da IPX. Os antígenos virais são detectados pelo 
uso de anticorpos marcados com enzimas, que 
agem no substrato, provocando mudança de cor. 
A diferença fundamental entre a IPX e os imuno-
blots é que o material suspeito deve ser previa-
mente solubilizado e imobilizado em um suporte 
sólido, geralmente membranas de nitrocelulose 
ou nylon. A membrana é, então, incubada com 
o anticorpo antiviral