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Resumo de bio mol- P1 Estrutura e propriedades físico químicas de ácidos nucleicos Os ácidos nucleicos são polímeros formados por cadeias de nucleotídeos. O ácido desoxirribonucleico é um polímero composto por unidades de desoxirribonuleotídeos, os quais são compostos por um açúcar, uma base nitrogenada e grupamentos fosfato. O açúcar é a pentose desoxirribose que está ligada pelo carbono 1’ a uma base nitrogenada heterocíclica e pelo carbono 5’ a grupamentos fosfato. As bases nitrogenadas podem ser de adenina e guanina (bases púricas) ou de timina e citosina (bases pirimídicas). A ligação entre a base nitrogenada e a pentose é chamada de ligação glicosídica. A molécula composta pela base nitrogenada ligada ao açúcar, sem o grupamento fosfato é chamada de nucleosídeo. Quando o grupamento fosfato está ligado ao carbono 5’ da pentose, a molécula é denominada nucleotídeo, que pode ser mono, di ou tri-fosfatado (grupamentos alfa, beta e gama). A molécula de DNA conterá sempre nucleotídeos monofosfatados e os precursores para sua síntese serão sempre trifosfatados. São necessários três grupamentos fosfato para um nucleotídeo ser incorporado a uma molécula pois é necessária energia para formar a ligação fosfodiéster, a qual é obtida pela quebra das ligações dos fosfatos. Os desoxirribonucleotideos formam cadeias, sendo unidos por ligações covalentes chamas ligações fosfodiéster, as quais são estabelecidas entre o grupamento fosfato (5’-P) e o grupamento hidroxílico (3’-OH) do carbono 3’ do nucleotídeo adjacente. Isso confere as cadeias polinucleotídicas uma propriedade importante chamada direcionalidade. O primeiro nucleotídeo da cadeia terá uma extremidade 5’ com um grupamento fosfato e o ultimo nucleotídeo na extremidade 3’ terá um grupamento hidroxílico. O próximo nucleotídeo adicionado a cadeia será obrigatoriamente adicionado à extremidade 3’OH da cadeia polinucleotídica. O DNA é uma hélice dupla e suas duas fitas se enrolam em torno do eixo da hélice. As desoxirriboses, ligadas umas as outras pelos grupamentos fosfato, ficam externas em relação as bases nitrogenadas. As ligações fosfodiéster nas duas fitas estão em direções opostas (uma na direção 5’ 3’ e outra na direção 3’ 5’) sendo portanto antiparalelas. Os anéis aromáticos das bases nitrogenadas são hidrofóbicos e ficam orientados para o interior da hélice dupla. O pareamento das bases nitrogenadas entre as fitas ocorre pela formação de ligações de hidrogênio entre ambas. Entre T ou U e A são formadas duas pontes de hidrogênio e entre C e G são formadas três. Isto confere a molécula complementaridade (sempre uma A estará pareada a T ou U e uma C estará pareada a um G). As ligações de hidrogênio CG são mais fortes que AT, necessitando de mais energia para serem rompidas. As ligações glicosídicas no DNA, entre as desoxirriboses e as bases nitrogenadas não estão diretamente opostas na hélice dupla, gerando duas cavidades desiguais em seu contorno. Elas são denominadas cavidade maior e cavidade menor. Nestas cavidades as bases estão expostas ao meio solvente e são quimicamente distinguíveis. Assim moléculas ( em geral proteínas) que interagem com sequencias especificas de bases podem identificar estas sequencias sem romper a estrutura da dupla hélice. Além da complementaridade e do antiparalelismo, o DNA possui uma terceira propriedade importante, sendo essa a de desnaturação e renaturação da hélice dupla. A desnaturação ocorre quando as ligações de hidrogênio entre as cadeias complementares são rompidas e as fitas se separam. O processo inverso (formação da hélice dupla) é a renaturação. Sempre que a molécula de DNA é replicada, transcrita ou realiza recombinação as cadeias são desnaturadas e renaturadas. A composição de pares de base em regiões definidas do DNA definem a estabilidade de temperatura necessária para a separação (AT vão se separar mais rápido e a uma temperatura mais baixa que CG). A desnaturação/renaturação pode ser acompanhada pela absorbância da luz ultravioleta, em um espectrofotômetro. O efeito hipercrômico é a diferença na absorção de luz entre o DNA desnaturado e o nativo, sendo o desnaturado o quê absorve mais luz, pois as bases nitrogenadas estão mais expostas então a luz passa com mais interferência e é mais absorvida. A absorbância aumenta com a temperatura até o momento em que as fitas se separam completamente. A temperatura na qual 50% do DNA está desnaturado é chamada de temperatura média de fusão, a qual varia conforme o nível de estabilidade da molécula (quanto mais CG, maior a temperatura de fusão). Além da estrutura secundaria da hélice dupla, o DNA assume uma estrutura terciária, denominada supertorcida, a qual é basicamente o enrolamento da hélice dupla sobre si mesma. Esta estrutura é fundamental para o empacotamento do DNA nos genomas e nucleossomos. O passo da hélice de uma fita dupla de DNA corresponde ao numero de pares de bases por volta da molécula (quanto menor a torção, mais bases e vice e versa). A estrutura da fita é mutável, ou seja, a torção pode aumentar ou diminuir. Para a manutenção da homeostasia da supertorção e da conformação do DNA na célula, existe um sistema complexo de enzimas, as topoisomerases. Elas são enzimas que promovem a quebra transitória de ligações fosfodiéster da fita de DNA gerando uma forma intermediária, em que a proteína permanece ligada covalentemente ao DNA e permite que as fitas do DNA passem umas sobre as outras ou sofram torção, alterando, assim, a supertorção da molécula. A molécula de DNA possui diferenças em relação a molécula de RNA. A molécula de RNA possui ribose como açúcar componente, é menos estável que o DNA, possui fita simples e mais curta que o DNA, não persiste por muito tempo na célula (ocorre alta reciclagem de moléculas) e possui uma uracila (U) ao invés de uma timina (T). Apesar da estrutura predominante ser de fita simples, o RNA possui estrutura secundária em alguns casos, e isso causa diferenças nas conformações de diferentes tipos de RNA (transportador, mensageiro e ribossômico). Isso também confere estabilidade maior em um tipo em relação aos outros. Estrutura de genes e genomas procarióticos Gene: segmento de DNA que inclui todas as sequencias nucleotídicas necessárias e suficientes para a síntese de pelo menos um produto correspondente, que pode ser um mRNA a ser traduzido em uma proteína ou outros tipos de RNA. Cada gene é constituído pela região codificadora (sequencia nucleotídica que codifica o seu produto) que e regiões reguladoras (flanqueiam a região codificadora e regulam sua expressão). Todo o gene é DNA, mas nem todo o DNA é um gene, ou seja, nem todo o DNA tem estrutura e funções de um gene. Regiões de DNA onde não são expressos produtos funcionais não são genes. Genes são autossuficientes em relação a regulação de sua expressão. Genoma: conjunto de todos os genes. Sequencia intergênica: região não codificadora do DNA, a qual determina a orientação do gene. Nucleóide: local onde o material genético fica localizado em procariotos. NÃO é delimitado por membrana. Estruturas típicas de genomas procarióticos: forma cirular (pontas covalentemente ligadas), tamanho médio de 4639 kb, possuem alta densidade (regiões intergênicas são mínimas. Eles precisam ser altamente condensados devido a rapidez de sua produção, pois o genoma não pode ser muito espaçado, caso contrário demoraria muito para se replicar), a maioria das espécies de bactérias e archeas tem seus genomas representados por um único cromossomo, possui poucas sequencias gênicas repetidas, os genomas de células endossimbiontes e parasitas são menores pois dependem da célula hospedeira (onde pegam as informações genéticas), opérons procarióticos. Definição da orientação de um gene: a região reguladora determinara a orientação do gene. Os genes podem ter orientações diferentes nas mesmas fitas de DNA, pois cada gene possui a sua região reguladora. Se a sequencia codificadora de um gene estiver em uma fita e a de um gene próximo em outra fita, consequentementesuas regiões reguladoras estarão em fitas diferentes e terão orientações opostas. Óperons procarióticos: são duas ou mais regiões codificadoras co-orientadas sob controle de regiões reguladoras comuns. São importantes para economia de energia e espaço, pois o produto da transcrição é único. As diferentes regiões codificadoras presentes em um opéron são co-transcritas em um único RNA, chamado de policistrônico. A extensão das sequencias entre as regiões codificadoras adjacentes de um óperon são chamadas regiões intercistrônicas, e são elas que determinam o começo e término da tradução de proteínas no óperon. Compactação do DNA: a extensão do DNA é muito maior que o compartimento que o contém. Por isso é necessária sua compactação, a qual é permitida por sua associação com proteínas que interagem principalmente com o açúcar e o fosfato da sequencia nucleotídica. A estrutura da compactação é reversível, e isso pode ser observado por exemplo na expressão de um produto por um gene, sendo que o último não pode estar em sua forma compactada. Elementos genéticos móveis: são moléculas que até certo ponto podem transferir informação genética para outra célula em uma relação horizontal (células sem parentesco). São extracromossômicos. São elementos genéticos móveis: plasmídeos, bacteriófagos e elementos transponíves. Plasmídeos: são moléculas de DNA de fita dupla circulares, extracromossômicos e com capacidade de autorreplicação. São estruturas típicas de procariotos e podem ter funções de fertilidade, resistência a antibióticos, patogenias, toxicidade e virulência. Podem ser replicados uma vez a cada ciclo de divisão celular (plasmídeos cópia única) ou mais de uma vez (plasmídeos multicópia). Os fenômenos envolvendo a mobilização de plasmídeos em bactérias são a conjugação e a transformação. Bacteriófagos: são vírus de bactérias. No ciclo lítico um fago adere a uma bactéria hospedeira e injeta seu genoma, acarretando em uma série de eventos que culmina na lise da bactéria. Em um ciclo lisogênico, fagos temperados são capazes de perpetuar seu material genético sem causar morte de célula hospedeira. A transferência genética horizontal de sequencias cromossômicas bacterianas é chamada de transdução. Elementos transponíveis: são segmentos de DNA que possuem a propriedade de transposição, ou seja, são capazes de se mover de um ponto a outro do cromossomo, mudar de cromossomo e saltar do genoma de uma espécie para outro. A transposase é a enzima que pode retirar o elemento do seu sítio e transpô-lo para um novo sítio. Essa é a chamada transposição conservativa, a qual não aumenta o número de cópias. Em outros casos a transposase pode manter o elemento em seu sítio original e transpor uma cópia dele para um novo sítio, sendo esse processo chamado de transposição replicativa. Transposons são os elementos que transpõem utilizando a enzima transposase para esse processo. A enzima reconhece determinadas sequencias de DNA presentes em ambas extremidades do elemento. Esse processo tem como consequências a inativação insercional de genes, ativação de genes anteriormente inativos, recombinação homóloga, transferência genética horizontal e aumento da plasticidade dos genomas. Estrutura de genes e genomas eucarióticos O genoma nuclear é organizado em nucleossomos, os quais são um conjunto de histonas (proteínas básicas com carga positiva) + DNA. O conjunto de nucleossomos forma a cromatina. O DNA possui carga negativa conferida pelo grupamento fosfato. Genes interrompidos: em genes eucarióticos, ocorre a presença de sequências intervenientes, denominadas íntrons. Em genes codificadores de proteínas, os íntrons interrompem a região codificadora. Os íntrons de genes eucarióticos se diferem dos procarióticos quanto a estrutura, sendo que os eucarióticos não adotam estruturas secundárias no contexto de transcritos de RNA e os procarióticos por sua vez formam estruturas secundárias relativamente complexas e isso faz com que os íntrons sejam removidos por processos autocatalíticos durante o processamento do RNA (os eucarióticos possuem seus íntrons removidos através de spliceossomos). Íntrons: regiões não-codificantes dentro da sequencia codificadora. Éxons: regiões codificantes dentro da sequencia codificadora. Características típicas de genomas eucarióticos: os genes eucarióticos são maiores que os procarióticos; os eucarióticos mais simples possuem genes com extensões de até 14kb, enquanto os procarióticos dificilmente ultrapassam 10kb; as regiões intergênicas em eucariotos não são facilmente delimitadas com precisão, visto que existem muitos elementos de sequência envolvidos na regulação da expressão de genes e com frequência esses elementos estão muito distantes dos genes por eles regulados; o tamanho de genomas eucarióticos é consideravelmente maior que o de procarióticos. Paradoxo do valor C: é um aspecto evidente em qualquer análise mais abrangente sobre variação de tamanho entre genomas eucarióticos. Esse fenômeno pode ser observado em muitos grupos taxonômicos e descreve uma frequente falta de correlação entre a complexidade biológica de organismos e os tamanhos dos respectivos genomas. Organismos pertencentes a uma mesma classe podem ter variações de mais de 120 vezes no tamanho de seus genomas, enquanto grupos completamente distintos podem ter espécies com genomas de tamanhos similares. O paradoxo do valor C resulta de presença, nos genomas eucarióticos de algumas espécies, de uma grande quantidade de sequências não associadas a genes, o quê faz com que o tamanho do genoma não reflita diretamente o número de genes nele presente. Genes homólogos: apresentam localização idêntica nos dois cromossomos. Um par de cromossomos homólogos possui genes para os mesmos caracteres. Genes ortólogos: genes encontrados em diferentes grupos taxonômicos e que codificam para a mesma proteína. Genes parálogos: todas as duplicações gênicas que ocorreram dentro de um mesmo grupo táxonômicos que geraram proteínas com funções levemente ou muito diferentes. Família de genes parálogos: a ocorrência de eventos de duplicação genica ao longo da evolução determina que muitos genes façam parte de famílias de parálogos, cujo grau de parentesco (definido pela similaridade das sequencias) pode variar de 30 a 100% ao longo de todo gene ou de um ou mais éxon. Pseudogenes: são genes parálogos não funcionais, formados por duplicação e divergência por mutação de famílias gênicas. Sequencias repetidas de genomas eucarióticos: a fração intergênica de genomas eucarióticos apresenta um grande número de sequencias curtas que podem estar repetidas até milhões de vezes, chamas sequencias repetidas simples. Em mamíferos elas representam menos de 10% do genoma. São mais comuns unidades de repetição de 5 a 10pb. Em relação a origem, acredita-se que as sequencias repetidas podem ter tido suas primeiras copias originas a partir de eventos de tranposição. Um número inicial dessas copias teria depois expandido ao longo da evolução por meio de sucessivos eventos de recombinação desigual. As sequencias repetidas são muito mais abundantes em eucariotos, porem também estão presentes em genomas procarióticos. Um exemplo de função das sequencias repetidas é definir a estrutura de centrômeros de modo a viabilizar sua interação com microtúbulos do fuso. Compactação de um genoma eucariótico nuclear: o genoma se encontra em sua forma compactada quando na forma de cromatina, a qual pode ter diferentes níveis de compactação. A cromatina eucariótica é um complexo formado por DNA+ proteínas nucleares. As principais constituintes proteicas da cromatina são as histonas. A cromatina também é composta em maior número por proteínas não- histonicas. As histonas respondem pelos níveis de organização básica do material genético, enquanto as não-histonicas estão associadas com a estruturação da cromatina em níveis superiores. A organização da cromatina é dinâmica, pois se altera conforme ao estágio do ciclo celular e de acordo com a sua atividade. Durante a intérfase,dois tipos básicos de cromatina podem ser observados: eucromatina (menor compactação) e heterocromatina (maior compactação). Características típicas do genoma de organelas: em eucariotos, mitocôndrias e plastídeos são organelas que apresentam grande genoma próprio, chamado de genomas extranuclear. Eles contem um elenco de genes relacionados com as funções de cada organela, centrados na síntese de ATP como fonte de energia. A presença de genomas próprios é resquício da origem evolutiva dessas organelas (teoria endossimbionte). Do ponto de vista estrutural, os genomas de organelas são constituídos por moléculas de DNA de fita dupla, em geral circulares. Outra semelhança com genomas procarióticos, além do fato se serem circulares, é o fato de os genomas serem pequenos, conterem genes que codificam funções relacionadas, serem organizados em óperons, além de muitas das proteínas por eles codificadas serem mais similares as proteínas correspondentes de bactérias do que as codificadas por genomas nucleares eucarióticos. Diferentes graus de compactação da cromatina: Nucleossomo Solenoide com estrutura super helicoidal com 6 nucleossomos na volta Alças de cromatina formadas a partir da associação da fibra de 30nm Replicação A replicação é responsável por uma cópia integral do genoma antes da divisão celular. Tanto em procariotos como em eucariotos ela é sincronizada com a divisão celular. A replicação é semiconservativa, e isso significa que há separação das fitas e cada uma serve de molde para a síntese de cadeias complementares a elas. Importância das orientações das fitas na molécula de DNA: a orientação 5’para 3’ ou 3’ para 5’ é baseada na terminação do nucleotídeo, sendo que o 5’ começa no fosfato (P) e o 3’ na hidroxila (OH). As orientações permitem definir qual fita é líder e qual é tardia. A fita líder será sintetizada simultaneamente com o andamento da forquilha de replicação, enquanto que a tardia, por estar sendo sintetizada no sentido oposto do andamento da forquilha, apresentará fragmentos que precisarão ser preenchidos posteriormente. Sentido do alongamento da cadeia: 5’ para 3’. Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados são adicionados sequencialmente e de forma complementar à fita molde na extremidade 3’-OH da cadeia nascente. Origem de replicação: é o ponto inicial da replicação ao longo da molécula de DNA. Origens de replicação de diversas espécies já foram isoladas e observou-se a característica comum de serem ricas em nucleotídeos AT. Bolha de replicação: é o lugar onde se inicia a replicação que é continuada pela(s) forquilha(s) de replicação. Os primeiros pb são separados, formando uma bolha no DNA, pois o restante da molécula ainda está unida. Forquilha de replicação: as forquilhas de replicação se encontram nas pontas das bolhas de replicação, sendo responsáveis pela contínua separação das fitas de DNA. A enzima helicase se encontra na frente da forquilha e é ela que realiza a abertura das fitas. No evento de replicação as duas cadeias tem que ser simultaneamente sintetizadas, e isso depende do avanço da forquilha de replicação. Na replicação bidirecional, duas forquilhas atuam na bolha de replicação, havendo então dois centros de síntese de DNA. Replicação semidescontínua: ambas as fitas-filha (líder e tardia) são sintetizadas no sentido 5’ para 3’, pois as DNA-polimerases somente sintetizam neste sentido. Mas para que o sentido do processo de replicação (movimento da forquilha) seja o mesmo para ambas, a fita líder é sintetizada de forma contínua e a tardia de forma descontínua (formação dos fragmentos de Okazaki). Fragmentos de Okazaki: eles ocorrem durante a síntese da fita descontínua, pois ela é polimerizada em diversos fragmentos. Os fragmentos de Okazaki possuem entre 1000 e 2000 nucleotídeos em procariotos e entre 100 e 200 em eucariotos. A síntese de cada fragmento prossegue até encontrar a região 5’-P do fragmento anterior, quando a DNA-polimerase se dissocia da fita descontínua. Replicon: é a origem de replicação. O cromossomo procariótico é um único replicon (circular). Já nos eucarióticos, existem muitos replicons (lineares) por cromossomo, os quais são trechos de replicação desencadeados a partir de uma origem. O replicon eucariótico começa no meio da bolha e termina quando se encontra com a forquilha de replicação de outro replicon. DNA polimerases bacterianas e eucarióticas: há diferenças em termos de eficácia, fidelidade e processividade (capacidade de se manter ligada ao DNA por mais tempo) entre as enzimas procarióticas e eucarióticas. A principal DNA polimerase é a DNA polimerase III (replicase). Ela é muito eficiente e incorpora muitos nucleotídeos por minuto, porém está presente em um número menor de moléculas. Existem quatro DNA polimerases, e esta enzima é responsável por catalisar uma ligação fosfodiéster. As DNA polimerases I e III atuam como exonucleases (remoção de nucleotídeos a partir da extremidade do DNA). A primeira atuam nos sentidos 5’ para 3’ e 3’ para 5’. O sentido 5’ para 3’ é chamado de translação de corte (a DNA polimerase I preenche lacunas entre fragmentos de Okazaki) e o de 3’ para 5’ é de revisão e correção de erros (se a enzima incorporou um nucleotídeo errado, a conformação do DNA é alterada e a enzima para de polimerizar e passa a sua função de exonuclease). Já a DNA polimerase III possui atividade somente no sentido 3’ para 5’. DNA polimerase III: possui elevada potência catalítica, alta processividade, alta fidelidade, atividade de exonuclease 3’ para 5’, complexo formado por dez polipeptídeos diferentes. São necessária 4 enzimas por replicon (uma por forquilha, em cada fita molde). Subunidade beta da DNA polimerase III: a DNA polimerase III possui dois núcleos catalíticos, sendo cada um deles associado com uma subunidade beta. Ela é responsável por recrutar o complexo DNA polimerase, pela sua capacidade de se envolver no DNA. Ela se apresenta em um homodímero em forma de anel que fixa a DNA polimerase III ao DNA, garantindo sua processividade. Forma o “grampo” na síntese da fita tardia. Síntese simultânea das fitas líder e tardia: a DNA polimerase III está anexada na fita líder, indo em direção à forquilha de replicação. Mas para sintetizar a fita tardia é necessária a inversão do sentido da enzima. Isso ocorre pelo dobramento da fita molde tardia, a qual será puxada em direção a enzima, possibilitando que a mesma sintetize os fragmentos de Okazaki. A subunidade beta é a responsável pela formação do grampo. Formação do grampo. DNA polimerase I: ela participa dos processos celulares de replicação e reparação do DNA. Ela apresenta 3 domínios de atividade, sendo na região carboxiterminal a atividade de polimerase, adjacente a ela a atividade de exonuclease 3’ para 5’ e na região aminoterminal a atividade de exonuclease 5’ para 3’. Coordenação temporal entre a replicação e a divisão celular: é necessária a coordenação temporal pois após a divisão celular, tanto em procariotos como em eucariotos, o mesmo material genético deverá estar presente em todas as células. Para isso, todo o genoma deverá ser replicado antes de cada evento de divisão celular. DNA A: inicia a bolha de replicação, a qual é pequena e instável, sendo possível as fitas voltarem a se ligar devido a sua complementaridade. O primeiro passo do início da replicação é o reconhecimento da origem de replicação, o qual é feito pelo DNA A. Ele possui afinidade com as repetições na origem. As sequencias de 9pb são os sítios específicos de reconhecimento da proteína DNA A. Ela possui capacidade de ligar-se especificamente a cada região repetida de 9pb. DNA B: possui atividade catalítica de helicase, separando as duas fitas através da quebra das ligações de hidrogênio e estendendo a região de origem. Neste ponto a DNA A é descartada. DNA C: proteína acessória que ajuda a mobilizar a DNA B para as forquilhas de replicação. Proteínas SSB (single strand bindingproteins): são responsáveis por estabilizar temporariamente a bolha de replicação. Possuem elevada afinidade pela fita simples de DNA, ocorrendo ligação de forma cooperativa. Sua presença é importante pois ao se ligarem as regiões de fita simples, elas evitam que aquela região sofra torções, induzindo uma conformação do DNA ideal para a replicação, além de protegerem as fitas simples da degradação por nulceases. DNA girase: é uma topoisomerase que entra em ação para aliviar a supertorção na fita dupla de DNA. Por ação da helicase, a torção na ponta de fita dupla começa a ficar cada vez mais apertada, dificultando a separação do DNA (é necessário muito gasto de energia). A DNA girase então é incorporada a frente da forquilha de replicação e separa as fitas. Ela quebra uma ligação fosfodiéster e deixa uma ponta girando livremente até aliviar a supertorção. Após aliviada, a DNA girase catalisa novamente a ligação fosfodiéster original. Primase: as DNA polimerases são incapazes de iniciar a síntese de novas cadeias, pois não são capazes de sintetizar o oligonucleotídeo inicial. Entra em ação então a enzima primase a qual é uma RNA polimerase e sintetiza os primers (iniciadores), os quais são um pequeno número de nucleotídeos que iniciam a síntese de novas cadeias. A RNA polimerase consegue iniciar a síntese, porém apresenta dificuldade para continua-la, sendo por isso escolhida para a síntese dos primers. Está então configurado o substrato para a DNA polimerase III e se inicia então a fase de alongamento. São necessários centenas de primers para a replicação do cromossomo, pois é necessário um primer para cada fragmento de Okazaki na fita tardia. Já na fita líder, somente um primer é necessário, pois sua replicação é contínua. DNA ligase: a DNA ligase liga os fragmentos de Okasaki da fita tardia. A DNA polimerase I preenche as lacunas existentes entre os fragmentos de Okasaki, remove os primers de sintetiza os novos oligonucleotídeos até o próximo fragmento (isso é necessário pois os nucleotídeos iniciais eram ribonucleotídeos, visto que a primase é uma RNA polimerase), justapondo os fragmentos. Porém eles se encontram somente justapostos e não ligados, sendo essa a tarefa exercida pela ligase. Replissomo: é um complexo enzimático que contém todas as proteínas e enzimas necessárias para a replicação. As principais proteínas do reino Bacteria são: DNA B (helicase), SSB, DNA G (primase), DNA polimerase III, subunidade beta da DNA polimerase III, complexo gama da DNA polimerase III (promove a ligação da DNA polimerase ao DNA na fita descontínua). Terminação da replicação em procariotos: proteínas auxiliam a maquinaria de replicação a parar no momento certo e enzimas topoisomerases separam cromossomos que estão grudados e precisam ir para células diferentes. Terminação da replicação em eucariotos: ocorre a falta de um fragmento de Okazaki: as DNA polimerases necessitam de um primer para a síntese das novas fitas de DNA e só incorporam os nucleotídeos no sentido 5’ para 3’. Portanto, na síntese da fita descontínua, a remoção do primer localizado na extremidade 5’-P da cadeia resultaria na perda de parte do DNA a cada geração celular, o que acabaria por ocasionar perda da informação genética. Um dos mecanismos utilizados para evitar tal perda de informação genética são os telômeros, os quais estão relacionados com a estabilidade genômica. A enzima telomerase alonga os telômeros, em um mecanismo de ação que consiste em alongar uma das fitas de DNA por meio de adição de nucleotídeos na extremidade 3’-OH livre. Resumo das funções envolvidas na replicação de E. coli Proteínas SSB III III III NÃO ESQUECER QUE A DNA POLIMERASE I TAMBÉM ESTÁ PRESENTE. Transcrição A transcrição é o processo pelo qual são sintetizados todos os RNAs celulares. Esse processo conecta a informação presente na sequência de bases do genoma (genótipo) com as características funcionais da célula (fenótipo). A transcrição é o primeiro passo da expressão gênica, visto que os RNAs sintetizados produzem os RNAs funcionais e as proteínas. A transcrição também é um dos principais processos em que ocorre a regulação da expressão gênica, definindo quais genes serão transcritos, quando esta expressão ocorre e quais as quantidades de produto serão produzidas. Alterações pós transcricionais e traducionais: alterações que ocorrem nos RNAs após a transcrição e tradução. Ciclo da transcrição: é dividido em três fases: início, em que promotores (sequencias específicas do DNA) sinalizam o local de formação do complexo de transcrição para iniciar a cópia das sequencias de DNA em RNA; alongamento, na qual a molécula de RNA é sintetizada; e a terminação, processo em que a síntese do RNA é terminada em resposta a terminadores. Cada ciclo ocorre várias vezes no gene e antes que um complexo atinja a região de terminação, outros complexos de transcrição estão iniciando a síntese de RNA. A reação depende de um molde de DNA fita dupla, cuja sequencia de bases é copiada por complementaridade. A reação é processiva e ocorrre no sentido 5’ para 3’. Assim como na replicação, na transcrição a hélice dupla do DNA deve ser desnaturada por ruptura das ligações de hidrogênio para que a sequência de nucleotídeos da fita molde possa ser exposta e copiada. Apenas uma das fitas será utilizada para a transcrição, e será aquela com orientação 5’ para 3’. Essa fita é chamada de fita codificante. A fita de RNA sintetizada é copiada, portanto de outra fita, denominada fita molde, pois síntese ocorre por complementaridade. Bolha de transcrição: estrutura na qual a fita dupla está desnaturada na região do DNA onde ocorre a transcrição e o complexo RNA polimerase mantém a estrutura estável, ao passo que o RNA sintetizado permanece parcialmente pareado com a fita molde do DNA e a parte já sintetizada deixa o complexo de transcrição. Fita molde Fita codificante RNA polimerases: todas as RNA polimerases celulares são complexos proteicos com subunidades múltiplas. Elas são capazes de realizar a transcrição basal, ou seja, sintetizar RNA a partir do promotor de um DNA molde. Entre suas atividades se encontram: reconhecer e se ligar a sequencias específicas do DNA; separar a hélice dupla do DNA, expondo a sequencia de nucleotídeos a ser copiada; manter as fitas de DNA separadas na região de síntese do RNA; manter estável a estrutura DNA-RNA na região da síntese; renaturar o DNA na região posterior a síntese; terminar a síntese de RNA. A reação catalisada pelas RNA polimerases ocorre entre o grupamento 3’-OH de um ribonucleotídeo e o grupamento fosfato do carbono 5’ do ribonucleosídeo trifosfatado a ser incorporado. A reação de adição ocorre no sentido 5’ para 3’ e a fita molde é aquela de sentido 3’ para 5’. Para o ribounuleotídeo ser incorporado, deve possuir complementaridade com o desoxirribonucleotídeo do DNA molde. As RNAS polimerases não necessitam de um primer para começar a síntese. Promotores procarióticos: as sequencias especificas na molécula de DNA que determinam o local de formação dos complexos e iniciam a transcrição são denominadas promotores. Primeiro nucleotídeo da sequencia do DNA, copiado no RNA, é denominado de sitio de inicio da transcrição e demarcado como nucleotídeo +1 na molécula de DNA. Os desoxirribonulceotídeos localizados antes do nucleotídeo +1 (região a montante) recebem sinal negativo e números crescentes. Os que se localizam após o nucleotídeo +1, em direção ao terminador (região a jusante) recebem números crescentes positivos. Nos procariotos, o promotor é o conjunto de sequencias do DNA onde o complexo RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição. O nucleotídeo +1 é uma purina (A ou G); duas regiões, -10 (TATA box) e -35, são os determinantes primários da eficiência dos promotores. Promotores eucarióticos: em eucariotos, a RNA polimerases não se ligam diretamente à sequencia do promotor, que primeiroé reconhecida pelos fatores de transcrição que dirigem a ligação das RNA polimerases para o inicio da transcrição. Existem dois tipos de sítios de iniciação de transcrição: o promotor focalizado (ocorre em genes regulados), no qual a transcrição inicia em um único nucleotídeo ou em uma região bastante restrita; e o promotor disperso( ocorre em genes constitutivos), no qual a iniciação da transcrição ocorre em múltiplos sítios em uma região ampla de 50 a 100 nucleotídeos. Fatores de transcrição: pequenas proteínas que possuem o papel de facilitar a ligação da RNA polimerase. Podem ser indutores (possibilita a ligação e induz a transcrição) ou repressores (possibilita a ligação mas reprime a transcrição). Inicio da transcrição: o primeiro passo é o reconhecimento e ligação da RNA polimerase ao promotor; o complexo formado entre a RNA polimerase e o promotor no momento da ligação é denominado binário fechado; após as fitas de DNA serem separadas no nucleotídeo +1 ocorre a formação do complexo binário aberto. A região -10 recebe o nome te TATA box pois é rica em nucleotídeos AT, o que facilita a abertura da dupla fita. Alongamento: durante esta etapa, a RNA polimerase deve realizar várias atividades: desnaturar a hélice dupla do DNA na região à jusante, expondo a sequencia de nucleotídeos a ser copiada; manter as fitas de DNA separadas na região de síntese; catalisar a reação de incorporação dos ribonucleotídeos; manter o complexo estável; permitir a saída do RNA já sintetizado do complexo de transcrição; renaturar o DNA na região à montante. Terminação da transcrição: após o seu alongamento, o complexo RNA polimerase deve reconhecer o terminador , cessar a incorporação de ribonucleotídeos, dissociar o complexo de transcrição e liberar o RNA sintetizado. Em procariotos existem dois mecanismos gerais de terminação: rô dependente e rô independente (terminação intrínseca). Na terminação intrínseca uma sequencia definida no gene sinaliza o fim da síntese de RNA. Já na terminação rô dependente, é utilizado um conjunto de proteínas denominadas “rô”, as quais reconhecem um “grampo” na região 3’ do RNA e ao encontra-lo, induzem a saída do RNA e da RNA polimerase, terminando a transcrição. Em eucariotos o termino da transcrição é baseado na região terminadora. Processamento de RNA O processo de transcrição geralmente não produz moléculas de RNA completamente funcionais. Os transcritos primários (pré-RNAs) são os produtos diretos da transcrição e com frequência não estão associados a nenhuma atividade biológica. Portanto as moléculas de pré-RNA devem passar por uma série de reações que tendem a alterar a sua sequencia primária. Essas alterações são denominadas processamento de RNA, compreendendo reações de adição, remoção ou modificação de nucleotídeos. Em procariotos, ocorre processamento em pré-tRNA e pré-rRNA, não ocorrendo em pré-mRNA. Já em eucariotos, ele ocorre nos três casos. Antes do seu processamento o RNA é mais instável e mais sujeito a degradação. OBS: os três tipos de RNA possuem estabilidades diferentes, sendo o mRNA o mais instável pelo fato de não possuir pareamentos internos (estrutura secundária), pois sua forma precisa ser linear. O mRNA é degradado, diferentemente do t e rRNA que são reciclados na célula. Pré- RNA RNA maduro Estado precursor não funcional Estado maduro funcional Processamento do r-RNA de E. coli: um precursor policistronico (transcrito a partir de um óperon) possui a sequencia de mais de um rRNA, sendo necessárias clivagens endonucleolíticas realizadas por RNases específicas. São removidas as sequencias que não devem estar presentes no RNA maduro. As endoribonucleases clivam a sequencia não baseadas em sua sequencia nulceotídica propriamente dita, mas sim baseadas em sua estrutura secundária. Além disso ocorrem modificações químicas, como metilação de bases nitrogenadas de alguns nucleotídeos específicos. Processamento de rRNA em eucariotos: é semelhante aos procariotos, porém após seu término precisa ser exportado do núcleo para o citoplasma, onde ocorre a sua síntese proteica. Processamento de tRNA em E. coli: mesmo o pré- tRNA não é linear, ocorre um extenso pareamento intracadeia. Ocorre a remoção de sequencias através de duas etapas: clivagem endonucleolítica e exonucleolítica e com isso são removidos todos os nucleotídeos adicionais. Ocorrem muitas modificações químicas em bases nitrogenadas especificas para ser possível que o tRNA adquira sua atividade e função.* *em eucariotos ocorrem, além das atividades de procariotos, um splicing. Porque o mRNA não é processado em procariotos? O mRNA precisa ser lido e interpretado para que ocorra a tradução e para isso ele necessita estar estável e funcional. Em procariotos, não é necessário o processamento para que ocorra a estabilidade de funcionabilidade do mRNA, pois a tradução ocorre imediatamente enquanto o mRNA está sendo transcrito. A transcrição e tradução são simultâneas em procariotos porque ocorrem no mesmo compartimento: a célula (não há núcleo). Em eucariotos, a transcrição ocorre no núcleo e a tradução no citoplasma, sendo necessário então o processamento. Processamento do pré- mRNA eucariótico: adição do cap na extremidade 5’: ao primeiro nucleotídeo (5’) será adicionado um nucleotídeo modificado, 7-metilguanosina. Ocorre então uma ligação 5’-5’ a qual não é uma ligação fosfodiéster típica e protege a extremidade da degradação, pois a ribonuclease não a reconhece. Adição da cadeia de poli-A (poliadenilação) à extremidade 3’: uma proteína específica identifica a sequencia AAUAAA e uma enzima cliva o RNA, formando uma extremidade 3’. São então adicionados ribonucleotídeos de adenina, os quais estabilizam o RNA e protegem a extremidade 3’ da degradação. Splicing: clivagem e remoção dos íntrons e junção dos éxons exatamente na sua ordem. É um processo extremamente preciso, pois a modificação de um nucleotídeo pode alterar a codificação da proteína. No pré-mRNA estão presentes tanto os íntrons quanto os éxons, porém no RNA maduro só ocorre a presença de éxons. No processo de splicing típico as sequencias de bases que definem o que são íntrons e o que são éxons. A quebra de uma ligação de um íntron libera energia que é usada para a formação da ligação dos éxons, e isso é chamado de reações de transesterificação do splicing. O spliciossomo é o complexo de ribonucleoproteínas que tem a propriedade de reconhecer os sítios de ligação, junções éxon-íntron, etc. O spliciossomo possui, entre suas ribonucleoproteínas, pequenas sequencias de RNA (smRNAs), os quais possuem complementaridade com a sequencia de RNA e proporcionam a grande especificidade do processo. Em procariotos (nas raras espécies que ocorrem íntrons) não há ocorrência de spliciossomo, sendo a estrutura secundária do próprio RNA a mediadora do splicing (splicing auto-catalítico). Acredita-se que essa era a forma ancestral do splicing. O surgimento de genes com íntrons foi um passo muito importante na evolução, pois permitiu a ocorrência do splicing alternativo, gerando uma grande variabilidade de proteínas. As diferenças no splicing do pre-mRNA geram muitas variantes proteicas.
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