Titulação de aminoácidos

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Exemplo de titulação de um aminoácido
A titulação é utilizada para determinar a quantidade de um ácido numa determinada solução. Um certo volume de um ácido é titulado através da utilização de uma base forte, normalmente o hidróxido de sódio (NaOH), de concentração conhecida. O NaOH é adicionado em pequenas quantidades até o ácido ser neutralizado, o que pode ser indicado através de um pH metro. A concentração do ácido na solução original pode ser determinada através do volume de NaOH adicionado.
A tendência de qualquer ácido (HA) para perder um protão e formar a sua base conjugada (A-) é definida pela constante de equilíbrio Keq para a reacção reversível
 
 HA 	 H+ + A- , a qual é dada por Keq= [H+] [A-] / [HA]
O gráfico do pH versus a quantidade de NaOH adicionado (uma curva de titulação) revela o pKa do ácido, sendo este o ponto médio da curva de titulação. Quanto mais forte for o ácido, menor o pKa e quanto mais forte for a base, maior o pKa. 
À medida que o NaOH vai sendo introduzido, o OH- adicionado vai reagir com o H+ que se encontra livre na solução, formando H2O. Esta remoção do ião H+ vai fazer com que HA se dissocie para satisfazer a sua constante de equilíbrio, e assim se vai formando mais A-.
Como exemplo de titulação de um aminoácido vamos analisar a glicina. A curva de titulação tem duas fases diferentes, correspondendo cada uma à remoção de protões dos seus dois diferentes grupos. A pH muito baixo, a espécie iónica predominante da glicina é a forma completamente protonizada +H3N – CH2- COOH. A meio da primeira fase da titulação, na qual o grupo carboxilo da glicina perde o seu protão, as concentrações do dador (+H3N – CH2 – COOH) e aceitador de protões (+H3N – CH2 – COO-) são equivalentes. A meio de qualquer titulação é atingido um ponto de inflexão onde o pH é igual ao pKa do grupo protonado que está a ser titulado. O pH para o ponto médio da primeira fase na glicina é 2.34, dado que o seu grupo carboxilo tem um pKa de 2,34. Com o continuar da titulação outro ponto importante é alcançado ao pH=5,97. Aqui existe outro ponto de inflexão, no qual o primeiro protão já foi praticamente removido e inicia-se a remoção do segundo protão. A este valor de pH a glicina encontra-se maioritariamente sob a forma de +H3N – CH2 – COO-. 
A segunda fase da titulação corresponde à remoção do protão do grupo NH3+ da glicina. A meio desta segunda fase o pH toma valor de 9.60, equivalente ao pKa do grupo amina. A titulação fica praticamente completa quando o pH atinge o valor de 12. Neste ponto a forma predominante da glicina é H2N – CH2 – COO-. 
Das curvas de titulação da glicina podemos tirar diversas informações importantes. Primeiro dá-nos uma medida quantitativa do pKa de cada um dos grupos ionizáveis: 2,34 para o grupo carboxilo e 9.60 para o grupo amina. Note-se que o grupo carboxilo da glicina é cerca de 100 vezes mais ácido (mais facilmente ionizável) que o grupo carboxilo do ácido acético, o qual tem um valor de pKa de 4.76. A diferença de pKa do grupo carboxilo na glicina é causado pela repulsão entre o protão que sai e o grupo amina carregado positivamente do carbono(. As cargas opostas ao estabilizarem-se deslocam o equilíbrio para a direita. À semelhança deste, o pKa do grupo amina da glicina fica abaixo do seu valor médio médio. Este efeito é devido parcialmente à electronegatividade dos átomos de oxigénio do grupo carboxilo, que tende a atrair electões, aumentando a tendência de o grupo amina ceder um protão. Dai o grupo amina ( tem um pKa que é inferior ao de um grupo amina alifático, como por exemplo o da metilamina. De forma geral, o pKa de qualquer grupo funcional é maioritariamente afectado pelo ambiente químico, um fenómeno por vezes explorado no centro activo das enzimas para promover mecanismos de reacção que dependem dos valores do pKa dos grupos dadores/aceitadores de resíduos específicos. 
O segundo pedaço de informação fornecido pela curva de titulação da glicina é que o aminoácido tem duas regiões que funcionam como soluções tampão. Uma dessas regiões é uma parte relativamente rasa da curva, que corresponde a 1 unidade de pH para cada lado do primeiro valor de pKa (de 2,34), o que indica que a glicina é uma boa solução tampão quando apresenta valores de pH próximos desta área. A outra zona em que a glicina é uma boa solução tampão está centrada à volta de pH=9,60 (Note-se que a glicina não é uma boa solução tampão a um pH próximo do valor dos fluidos intersticiais ou do sangue, os quais andam à volta de 7,40). Dentro destes valores em que a glicina funciona como solução tampão, a equação de Henderson-Hasselbach pode ser usada para calcular as proporções das espécies dadora de protões e aceitadora de protões da glicina necessárias para fazer uma solução tampão a um certo valor pH.
Outro pedaço de informação importante que retiramos da curva de titulação da glicina é a relação entre a rede de cargas eléctricas e o pH da solução. No ponto de inflexão da curva de titulação entre as duas fases, em que o pH é de 5.97, a glicina está presente predominantemente nas suas formas dipolares, totalmente ionizadas mas sem rede de cargas eléctricas. O pH característico próximo do qual a rede de cargas eléctricas é zero é chamado o ponto isoléctrico ou pH isoeléctrico, designado pI. Para a glicina, que não tem nenhum grupo ionizável na sua cadeia lateral, o pI é simplesmente a média aritmética dos dois valores de pKa:
pI= ½ (pK1 + pK2 ) = ½ (2.34 + 9.60 )= 5.97
A glicina tem uma rede negativa de carga para qualquer pH acima do seu pI e desloca-se então em direcção ao eléctrodo positivo (ânodo) quando colocado num campo eléctrico. Qualquer pH abaixo do seu pI, a glicina tem uma rede de cargas eléctricas negativa e vai-se movimentar em direcção ao eléctrodo negativo (o cátodo). Quanto mais afastado o pH for do pI, maior a carga da rede eléctrica da população das moléculas de glicina. Por exemplo, a pH=1.0 a glicina existe quase inteiramente na forma +H3N – CH2- COOH, com uma rede positiva de cargas de 1.0. Ao pH 2.34, onde há uma igual mistura de +H3N – CH2- COOH e +H3N – CH2- COO-, a rede positiva de cargas é 0.5. O sinal e a magnitude de uma rede de cargas de qualquer aminoácido a qualquer pH pode ser previsto da mesma maneira.
Grupo 2
Nuno Barros
Diana Nunes
Luís Rosado
Carlos Silva