RELATÓRIO SACCHAROMICES CEREVISAE

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ 
 TAINARA MELO LIRA
TESTE COM Saccharomyces cerevisiae
TERESINA – PIAUÍ
 JUNHO/2016
 TAINARA MELO LIRA
 
TESTE COM Saccharomyces cerevisiae
Profa. Dra. Hercília Maria Lins Rolim
TERESINA – PIAUÍ
 JUNHO/2016
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO. ...........................................................................................................4
OBJETIVO....................................................................................................................5
 Objetivos gerais...........................................................................................5
2.1 Objetivos específicos...................................................................................5
METODOLOGIA...........................................................................................................6
 Métodos.......................................................................................................6
 Materiais......................................................................................................6
RESULTADOS E DISCUSSÃO. ..................................................................................8
CONCLUSÃO.............................................................................................................10
REFERÊNCIAS..........................................................................................................11
INTRODUÇÃO
	Os antioxidantes possuem larga aplicação em diferentes produtos como alimentos, cosméticos e medicamentos. Em alimentos os antioxidantes são utilizados com a finalidade de bloquear os processos óxido-redutivos desencadeados pelos radicais livres, aumentando o tempo de vida útil e evitando a ocorrência de reações químicas indesejáveis (SÁNCHEZ- MORENO et al., 1999).
Diferentes metodologias têm sido desenvolvidas para obter uma medição, seja qualitativa ou quantitativa, da capacidade antioxidante de compostos, tanto através de in vitro (testes químicos) ou in vivo (testes biológicos). 
Nos ensaios microbianos, Saccharomyces cerevisiae é uma levedura muito utilizada por semelhante a uma célula eucariota, metabolismo semelhante a metabolismo de células mamárias, sendo assim representativos das condições celulares do homem.
Tais ensaios microbianos têm-se mostrado muito adequados na determinação da capacidade antioxidante, constituindo-se em testes rápidos, sensíveis, econômicos e reprodutíveis (RABELLO-GAY et al., 1991). 	
A avaliação da capacidade antioxidante de um composto pode ser realizada através da medida da sobrevivência de microrganismos tratados com o antioxidante e agentes estressores. Os testes realizados nestes tipos de sistemas são rápidos e permitem a utilização de um grande número de células com as mesmas características genéticas. Por estas razões a levedura Saccharomyces cerevisiae torna-se um dos melhores modelos de sistema eucariótico unicelular para estudos de estresse oxidativo. (SOARES; et al., 2005).
OBJETIVOS
Objetivos gerais
Analisar propriedades do gengibre, diferenciando capacidades oxidativas do extrato e de um composto isolado do gengibre (encontrado principalmente na casca).
2.1 Objetivos específicos
Analisar qualitativa ou quantitativamente a capacidade antioxidante de compostos através de culturas celulares de Saccharomyces cerevisiae (testes biológico), observando se o extrato oxida de forma semelhante ao peróxido de hidrogênio.
METODOLOGIA
 Materiais
Alças estéreis
Placas de Petri
Linhagens de Saccharomyces cerevisiae (6)
Discos de papel filtro estéreis 
Pêra
Pipeta
Ponteiras
Pinças
Solução salina
Meio de cultura YEL (extrato de levedura 0,5%, 2% de Bacto-peptona, 2% de glucose)
 Métodos
 Em uma capela são inoculadas todas as seis linhagens de Saccharomyces cerevisiae em placas de Petri com meio de cultura YEL a 28 ºC. As placas de Petri devem estar desenhadas de forma a apresentar a marcação de linhas contínuas para cada uma das linhagens. 
O procedimento do repique das células (Teste do Disco Central) em suspensão das linhagens na placa de Petri (Figura 1.) envolve a utilização de uma alça estéril para coleta de uma quantidade relativamente pequena do material biológico (levedura). Após a coleta, o material é inoculado de forma homogênea no decorrer das linhas desenhadas na placa (Figura 2). 
Dessa forma, inocula-se cada uma das seis linhagens. Em sequência, é colocado no centro da placa um disco de papel filtro estéril e 10 µl das concentrações substância a ser testada (produto teste) que é, no caso, o isolado do gengibre.
 Assim, logo após o procedimento, encubam-se as amostras por durante 48 horas na estufa à temperatura de 37ºC. Usa-se um controle negativo com salina e controle positivo com peróxido de hidrogênio. 
Outro método é utilizar a substância diretamente com o peróxido de hidrogênio (no caso de substâncias oxidantes), se oxidante, pode usar diretamente peróxido ou pode ser usada em três tipos: co-tratamento, pré-tratamento ou pós-tratamento com peróxido de hidrogênio. 
Na utilização do co-tratamento: no mesmo momento em que se inocula a substância, se coloca peróxido de hidrogênio;
Na utilização do pré-tratamento: cerca de das horas antes se inocula o peróxido e depois a substância;
E no pós-tratamento: inocula-se primeiramente a substância teste e cerca de duas horas depois o peróxido de hidrogênio.
 
 
 Figura 1. Procedimento inoculação de linhagens no Teste do Disco Central. Figura 2. Placa de Petri com seis linhagens inoculadas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após o processo de repique e do encubação em estufa, pôde-se o observar crescimento da população de S. cerevisiae semeadas nas placas. Sabendo que no repertório de linhagens existia uma mutada com superóxido dismutase citoplasmática; uma mitocondrial; uma deficiente em catalase; uma deficiente superóxido dismutase citoplasmática e catalase e outra apresentando superóxido dismutase citoplasmática e mitocondrial. Pôde-se observar na prática cada uma das características das seis linhagens apresentam que as diferem na capacidade oxidativa. (Tabela 1.). 
Tabela 1. Descrição das linhagens de S. cerevisiae usadas no estudo.
	Descrição
	Genótipo
	Origem
	EG103 (SODWT)
	MATa leu2-3,112 up1-289 ura3-S2 GAL- 
	Edith Gralla. L. Angeles
	EG118 (Sod 1N)
	sod1::URA3 all other markers as EG103
	Edith Gralla. L. Angeles
	EG110 (Sod 2N)
	sod2::TRP1 all other markers as EG103
	Edith Gralla. L. Angeles
	EG133 (Sod 1NSod2N)
	sod1::URA3 sod2::TRP1 double mutant all other markers as EG103
	Edith Gralla. L. Angeles
	EG223 (Cat1N)
	EG103, except cat1:: TRP!
	Edith Gralla. L. Angeles
	EG (Sod1NCat1N)
	EG103, except sod1:: URA3 and cat 1:: TRP1
	Edith Gralla. L. Angeles
Adaptado de Oliveira et al., 2014.
O resultado da encubação é observado com controle negativo (com solução salina) e controle positivo (com peróxido de hidrogênio) onde inibição bem maior do halo de crescimento. Dessa forma, observa-se se o extrato vai oxidar de forma semelhante ao peróxido de hidrogênio, pois este é composto é altamente oxidante a este nível celular. Assim, se analisa onde existe a inibição do crescimento da levedura e onde se tem halo de crescimento. Quando há inibição do crescimento significa então que esta apresenta propriedade oxidativa e quando há formação de halo de crescimento é porque esta não oxidou. 
Desse modo, pode-se ver o nível de alteração genético das leveduras a partir da medição do diâmetro halo (mm), apagar nome dos discos com algodão, deixando apenas a numeração. Após a obtenção dos dados, analisam-se os resultados incluindo os dados em (mm) em programas estatísticos(como Prisma, PSS) para observar se houve significância com resultados esperados. 
Baseado nisto, várias razões tornam a levedura S. cerevisiae um dos melhores modelos de sistema eucariótico unicelular para estudos de estresse oxidativo por tratar-se de um organismo provido de núcleo e de organelas com metabolismo semelhante à de eucariotos superiores. (HENRIQUES et al., 2001).
 A facilidade e a rapidez na obtenção de gerações permite sua manipulação em laboratório para a realização dos mais diversos experimentos, com número grande de repetições e desenhos experimentais, além do custo acessível.
CONCLUSÃO
Com base no conhecimento dos métodos e finalidade dos testes com Saccharomyces cerevisiae conclui-se que a levedura é um dos melhores modelos de sistema eucariótico unicelular para estudos de mecanismo de ação de diferentes antioxidantes, principalmente pelo fato do genoma de apresentar um genoma totalmente conhecido (ajudando na sua rápida e precisa identificação e caracterização) e dos ensaios que podem ser realizados facilmente, com custo acessível.
REFERÊNCIAS
HENRIQUES, J. A. P.; DAFREÉ, A. L.; PICADA, J. N.; Maris, A. F.; SALVADOR, M. (2001). Espécies Reativas de Oxigênio e Avaliação de Antioxidantes em Sistemas Biológicos. In: Biotecnologia na Agricultura e na Agropecuária; Luciana Serafini, Neiva Barros e João Lúcio Azevedo (Ed.) Agropecuária, Instituto de Biotecnologia de Caxias do Sul.
RABELLO- GAY, M. N.; RODRIGUES, M. A. L.A. R. & MONTELEONE NETO, R. Mutagênese, teratogênese e carcinogênese: métodos e critérios de avaliação. Ribeirão Preto. Sociedade Brasileira de Genética / Revista Brasileira de Genética, 1991.
SÁNCHEZ-MORENO, S.; LAURRAURI, J.A.; CALIXITO-SAURA, F. Free radical scavenger capacity and inibition of lipid oxidation of wines, grapes juices and related polyphenolic constituints. Food Res. Internat., 32: 407-412, 1999.
SOARES, D. G; ANDREAZZA, A. C.; SALVADOR, M. Avaliação de compostos com atividade antioxidante em células da levedura Saccharomyces cerevisae. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, São Paulo, v. 41, n. 1, p. 97-100, 2005.