Métodos de purificação e identificação de proteínas

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Métodos de purificação e identificação de proteínas
Uma preparação pura é essencial para que as proteínas possam ser separadas completamente e com isso seja possível determinar as propriedades e atividades de uma só proteína. Sabe-se que uma só célula contém milhares de diferentes tipos de proteínas. Diante de tal conhecimento surge uma dúvida: como é possível purificar com êxito uma proteína? A resposta é simples, cada proteína apresenta propriedades e que variam e as diferem das outras, como por exemplo: tamanho (massa molecular), nem todos possuem a mesma quantidade de resíduos; carga líquida, elas variam entre neutra, positiva e negativa; polaridade, podem ser hidrofílicas ou hidrofóbicas; afinidade química, como por exemplo a um anticorpo. 
Cromatografia líquida:
 
 Nesse método há duas fases:
Um material sólido poroso com propriedades químicas apropriadas (Fase estacionária) é mantido em uma coluna, pela qual é percolada uma solução tampão (Fase móvel). 
 Há um tipo de gel para cada característica: afinidade, polaridade...
 Gel-filtração: separa de acordo com a massa molecular.
- Nesse caso, as proteínas de maiores massas serão eluídas primeiro. Isso se deve pelo fato delas não terem que passar pelos “labirintos” que há no gel.
 Troca iônica: separa de acordo com a carga elétrica líquida em um dado pH.
- Haverá ligação entre as cargas positivas e as cargas negativas.
- A matriz da coluna é resina (polímero sintético) contendo grupos carregados. Contendo grupos aniônicos são “trocadoras de cátion” e quando grupos catiônicos são “trocadoras de ânions”.
- A afinidade de cada atração é afetada quando mudado o pH ou a concentração de íons de sais livres (ex.:Na+), que competem na solução.
 Líquida de fase reversa: a propriedade explorada nessa é a polaridade.
- Todos as proteínas apresentam aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílico, consequentemente todas ficarão retidas no líquido apolar. É necessário então o uso de solventes hidrofóbicos. As proteínas com mais anéis aromáticos precisarão de mais solventes hidrofóbico para se eluir.
 De afinidade: tem como base a afinidade de ligação.
- Os grânulos na coluna apresentam um grupo químico covalente ligado denominado ligante.
- As proteínas com afinidades a esses ligantes tem sua migração através da matriz retardada.
- Para “desprender” as proteínas que não foram eluídas é necessário romper com a ligação e enfraquecer a afinidade, e isso pode ser feito com: alteração de pH, adição de sal e uso de competidor.
Eletroforese:
 Proteínas podem ser separadas e caracterizadas por eletroforese, que tem como base a migração de proteínas carregadas em um campo elétrico. As proteínas migram em direção ao catodo, via cargas.
Ela tem por objetivo: saber peso molecular da proteína e saber se ela está pura. 
 Vantagem: as proteínas podem ser vistas quanto separadas, permitindo estimar rapidamente o número de diferentes proteínas em uma mistura ou o grau de pureza de uma determinada preparação proteica.
 Consegue determinar o ponto isoelétrico e a massa molecular (aproximada). 
 Técnica mais usada de eletroforese de proteínas é a PAGE- eletroforese gel de poliacrilamida.
 SDSPAGE- técnica utilizada para a estimativa da pureza e a massa molecular. SDS é um detergente, o qual possui carga negativa, com isso iguala as cargas e o que vai diferenciar e importar de fato é o tamanho (massa molecular). Nesse caso, diferentemente da cromatografia liquida gel-filtração, a menor proteína quem chegará mais rapidamente.
 IEF-PAGE: determina os pontos isoelétricos. 
 Eletroforese bidimensional: é a técnica mais sensível. Nela é possível separar proteínas de massa molecular idêntica que diferem em pI, ou proteínas com valores de pI semelhantes, mas massas moleculares diferentes. 
 
Nesse caso, colocamos proteínas com massas moleculares conhecidas na canaleta um e na dois a proteína em questão, e assim conseguimos estimar a massa de tal proteína. 
OBS.: É possível interferir na solubilidade da proteína?
Sim, o efeito “salting in” é o aumento da solubilidade de proteínas devido ao acréscimo de baixas concentrações de sais em solução. Os íons salinos interagem com as cargas iônicas das proteínas aumentando assim o número efetivo de cargas e a quantidade de moléculas de água fixadas à ionosfera protéica. O efeito “salting out” é a precipitação de proteína em solução por altas concentrações de sais. Os sais atraem as moléculas de água do meio, de modo a ficar menos água disponível para as moléculas protéicas o que acarreta na diminuição da solubilidade e precipitação.