Resumo Biotecnologia DNA recombinante

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TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
A manipulação genética permite a criação de uma nova molécula de DNA, geralmente pela recombinação de DNA de diferentes organismos, por meios artificiais, utilizando-se enzimas conhecidas como enzimas de restrição, e a consequente produção de muitas cópias de DNA recombinante. Este processo designa-se clonagem. Um clone é uma cópia idêntica. A clonagem envolve a separação de um gene ou segmento de DNA específico de um cromossomo maior, ligando-o a uma pequena molécula de DNA-transportador, e depois replicando esse DNA modificado milhares de vezes. Em outras palavras, a clonagem molecular compreende pelo menos dois estágios importantes. Primeiro, o fragmento do DNA de interesse chamado de inserto é ligado a uma outra molécula de DNA chamada de vetor (agente de entrega) para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de transformação. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de transformante ou célula transformada. 
Passos gerais de uma clonagem:
1. Cortar o DNA em localizações específicas; as endonucleases sequencia-específicas fornecem as tesouras moleculares necessárias;
2. Selecionar e inserir uma pequena molécula de DNA capaz de auto-replicação = vetores de clonagem (plasmídeos ou DNA virais);
3. União de dois fragmentos de DNA de maneira covalente. A DNA ligase une o vetor de clonagem e o DNA a ser clonado = DNA recombinante;
4. Transferência do DNA recombinante para a célula hospedeira que fornecerá a maquinaria necessária para a replicação do DNA, produzindo-se inúmeras cópias idênticas, não só do vetor, mas também do fragmento de DNA que ele contém. Quando a célula hospedeira se divide, as cópias das moléculas de DNA recombinante são transmitidas à descendência e ocorre novo ciclo de replicação; 
5. Seleção ou identificação das células hospedeiras que contenham o DNA recombinante.			O microrganismo mais estudado é a E.Coli porque possui muitas vantagens: seu metabolismo do DNA é bem entendido, muitos vetores de clonagem naturais em E. Coli (plasmideos e bacteriófagos) são bem caracterizados. 
Enzimas de restrição (Endonucleases)
− São o bisturi que permitem “cortar” o DNA de um modo preciso e reprodutível. 
− Fazem parte do grupo das nucleases, enzimas que clivam ligações fosfodiester entre nucleótidos adjacentes. 
− Reconhecem e clivam apenas as ligações entre nucleótidos com uma sequência específica para gerar fragmentos menores.
− Existem nas bactérias servindo como o modo de defesa contra a entrada de DNA estranho (p.ex.: viral) na célula que contenha a sequência especifica identificada pela enzima em causa. 
− Reconhecem sequências com 4 a 8 pares de bases. 
− Existem enzimas que de modo a evitar a autodestruição de cadeia, ao reconhecerem sequências estranhas introduzem um grupo metilo (metilases). 
- Existem três tipos de endonucleases de restrição, I (mais complexa estruturalmente e clivam o DNA em sítios ao acaso), II (não requerem ATP, são mais simples e clivam o DNA dentro da própria sequencia de restrição) e III.
- Algumas endonucleases de restrição fazem cortes escalonados nas duas fitas de DNA, deixando de 2 a 4 nucleotideos de uma fita desempareada = extremidades coesivas, porque elas podem parear entre si ou com extremidades coesivas complementares a outros fragmentos. Outras clivam ambas as fitas de DNA em ligações fosfodiésteres opostas = extremidades cegas. 
Vetores de clonagem 
- Moléculas de DNA que têm como função transportar o DNA de interesse para a célula hospedeira. 
− As características mais importantes de um vetor de clonagem são: 
• Origem de replicação (ORI): permite que o vetor e a molécula de DNA recombinante, se mantenham na célula e seja transmitida à descendência. 
• Marca de seleção: a maioria dos vetores plasmídicos possui um gene que confere resistência a um antibiótico. Assim, apenas as bactérias que possuem o DNA recombinante sobrevivem quando crescidas em presença desse antibiótico. 
• Local de policlonagem (MCS): pequena sequência de DNA (~100 pb) que contém locais de corte únicos para várias enzimas de restrição. É neste local que é introduzido o fragmento de DNA que se pretende clonar. 
• Promotor: presente apenas em vetores de expressão e localizado a montante do local de policlonagem. A maquinaria de transcrição genética identifica a sequência do promotor e transcreve a partir desse local. Serve para quando se pretende a síntese de proteínas. 
− Plasmídios = são pequenas moléculas de DNA circular que se replicam separadamente do cromossomo hospedeiro.
- Podem ser introduzidos nas células bacterianas por transformação. 
-Eletroporação = técnica na qual se misturam bactérias e o vetor num único tubo e aplica-se um choque elétrico na mistura, com o objetivo de desestabilizar a membrana e permitir a entrada do vetor na bactéria. Ela é então rapidamente transferida para meio de cultura e incubada a 37ºC para que se possa recuperar após o choque.
- A transformação com cloreto de cálcio tem o mesmo objetivo, mas difere nos procedimentos. As bactérias e o vetor são misturados com uma solução de cloreto de cálcio e sofrem um choque térmico. Os íons cálcio têm a função de neutralizar as cargas negativas do DNA e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela membrana no momento do choque térmico. 
- Após a transformação, as bactérias são incubadas em condições adequadas para que se possam multiplicar e, a seguir, plaqueadas em meio sólido, para que se possam isolar colónias. A identificação das colónias recombinantes é feita utilizando as características conferidas pelos plasmídeos. Assim, se foi utilizado um plasmídeo que confere resistência ao antibiótico A, podem isolar-se as colónias que foram transformadas simplesmente plaqueando-as num meio de cultura com antibiótico A (as bactérias não transformadas não terão resistência ao antibiótico e morrerão).
- O plasmidio pBR322 da E.Coli oferece um bom exemplo de características úteis em um vetor de clonagem:
* Um origem de replicação é requerida para propagar o plasmidio e ajudar a mantê-lo num nível de 10 a 20 cópias por célula. 
* Dois genes que confiram resistência a antibióticos diferentes permitem a seleção das células que contenham o plasmidio ou a versão recombinante dele.
* Várias sequencias únicas de reconhecimento para diferentes endonucleases de restrição fornecem sítios onde o plasmidio pode ser cortado e o DNA estranho inserido.
* Um tamanho pequeno geralmente facilita a entrada do plasmidio nas células e a manipulação bioquímica do DNA.
Uso do pBR322 para clonar e identificar DNA estranho na E. coli:
O pBR322 é clivado no elemento de resistência à ampicilina pela PstI
O DNA estranho é ligado ao pBR322 clivado. Onde a ligação for bem sucedida, o elemento de resistência à ampicilina será rompido. O elemento de resistência à tetraciclina permanece intacto.
As células da E. coli são transformadas, depois crescidas em placas de ágar contendo tetraciclina para selecionar aquelas que tenham captado o plasmidio.
As colônias individuais são transferidas para posições correspondentes em placas adicionais. Uma placa contem tetraciclina e a outra, tetraciclina e ampicilina.
Células que cresceram na tetraciclina mas não na tetraciclina + ampicilina contém os plasmidios recombinantes que romperam a resistência à ampicilina, por causa do DNA estranho. As células com pBR322 sem o DNA estranho retém a resistência à ampicilina e crescem em ambas as placas. 
*Aula prática = transformação da E. Coli
A introdução de um DNA plasmidial na célula bacteriana a torna competente. Este DNA exógeno passa a fazer parte do material genético bacteriano, que será herdado pelas novas células à medida que a bactéria se multiplica, ou seja, a transformação é o processo natural onde o DNA exógeno liberado após a lise celular é capturado por outra célula, a receptora.As bactérias, ao receberem este DNA, geralmente adquirem uma ou mais características novas, como por exemplo, a capacidade de crescer em meio de cultura contendo antibiótico. Uma bactéria competente é uma bactéria que está apta a receber DNA exógeno. A competência pode ocorrer naturalmente ou pode ser produzida através de diferentes técnicas. Estas técnicas envolvem tratamento com soluções, como cloreto de cálcio, e mudanças bruscas de temperatura. Os íons de metal e as mudanças bruscas de temperatura alteram a permeabilidade da parede celular, fazendo com que estas células permitam a entrada de DNA exógeno através da membrana plasmática. As bactérias competentes são bastante frágeis e devem ser manuseadas com cuidado. A quantidade de células transformadas por 1 micrograma de DNA é chamada eficiência da transformação.										Na primeira etapa faz-se a ligação entre um fragmento de DNA, chamado inserto, contendo o gene de interesse com uma outra molécula de DNA, o vetor, para formar uma quimera ou molécula de DNA recombinante 
Na segunda etapa, a molécula de DNA recombinante é transportada para dentro de uma célula hospedeira, em geral uma bactéria, ocorrendo o processo de transformação. A célula que recebeu o DNA recombinante é chamada de célula transformada, a qual sofre muitos ciclos de divisão, produzindo várias cópias do DNA recombinante. 
A célula apta a receber um DNA exógeno é dita como competente. A competência está relacionada à presença de receptores na superfície das células doadoras, os quais se ligam ao DNA exógeno e o aproximam da superfície celular. Este material é então internalizado e, finalmente, incorporado ao genoma da célula receptora.									Na primeira etapa faz-se a ligação do inserto, contendo o gene de interesse com o vetor, para formar uma quimera ou molécula de DNA recombinante. Na segunda etapa, a molécula de DNA recombinante é transportada para dentro de uma célula hospedeira, em geral uma bactéria, ocorrendo o processo de transformação. 
- Inserto do DNA: interrompe a sequência do lac Z_a: as células transformadas com o inserto perdem a atividade desta enzima.
- Xgal: substrato sintético para determinar a atividade da β-galactosidase 
 	As células transformadas sem inserto permanecem com a atividade de β-galactosidase e são azuis, conforme a reação abaixo:
Figura 2. Formação do 5,5’-Dibromo-4,4’-dichloro-indigo
 β-galactosidase ativa 
Cliva X-gal :Colônias azuis 
Lacz_a segmentado (com inserto)
β- galactosidase inativa
Não cliva Xgal: colônias brancas
Figura 3. Formação das colônias azuis ou brancas
Os transformantes são crescidos sob a presença do indutor IPTG do operon Lac, a proteína inibidora é incapaz de se ligar ao promotor e o gene lacZ é então expresso. Para que a enzima beta-galactosidase seja ativa, é necessário que os vetores sejam transformados em linhagens de bactérias que possuam a inserção da sequência codificadora da outra fração do gene lacZ´. Para isso, as duas porções expressas pelo vetor e pelo DNA cromossomal se combinam para formar a proteína ativa da beta-galactosidase. Este processo é denominado complementação alfa. A enzima ativa é capaz de hidrolisar o substrato genericamente conhecido como X-gal, o que produz colônias azuis.		Para a clonagem no vetor pUC, são realizados os mesmos procedimentos utilizados para outros vetores. Tanto o vetor como o inserto sofre digestão enzimática, de preferência com enzimas que produzem extremidades compatíveis. O sítio múltiplo de clonagem dos vetores pUC se localizam na região codificadora da proteína LacZ. Assim, ao sofrer a digestão enzimática, a sequência codificadora referente à fração LacZ é interrompida. Sem esta fração, a célula hospedeira é incapaz de formar uma enzima com atividade biológica. Portanto, as colônias transformadas com os vetores que possuem o inserto não são capazes de clivar a X-gal e, por isso, formam colônias brancas.
- Bacteriófagos = O bacteriófago λ possui em mecanismo muito eficiente de entrega do DNA. Duas características chaves contribuem para sua utilidade:
1. Cerca de 1/3 do genoma λ não é essencial e pode ser substituído com DNA estranho.
2. O DNA é empacotado em partículas de fagos infecciosos apenas se seu tamanho estiver entre 40.000 e 53.000pb, uma restrição que pode ser usada para garantir o empacotamento apenas do DNA recombinante.
- Cromossomos artificiais de bactérias = plasmídios simples designados para clonar segmentos de DNA muito longos (100.000 a 300,000pb). Geralmente incluem marcadores de seleção, como resistência ao antibiótico cloranfenicol bem como uma origem de replicação muito estável. Os DNAs circulares longos são introduzidos dentro da célula hospedeira por eletroporação. 
O processo básico da técnica do DNA recombinante consiste em: 
• A enzima de restrição “abre” a molécula de DNA do plasmídeo num ponto especifico, deixando livres extremidades com sequências especificas. 
• Com enzimas de restrição do mesmo tipo abre-se outra molécula de DNA, que funciona como doadora, e isola-se o gene que se quer inserir no plasmídeo. 
• O gene a inserir é colocado em contato com o plasmídeo, juntamente com um outro tipo de enzimas, as ligases do DNA. As extremidades do vetor e do fragmento de DNA são unidas pela complementaridade das bases pela ação de DNA ligases não especificas. 
1. O vetor liga-se a si próprio 
2. O fragmento de DNA liga-se corretamente 
3. O fragmento de DNA liga-se ao contrário 
4. Liga-se mais do que um fragmento de DNA ao mesmo vetor. 
− Se as 2 extremidades forem cortadas com enzimas de restrição diferentes, a especificidade é maior, logo o fragmento só se pode ligar corretamente. 
• O gene passa a fazer parte do plasmídeo, que possui agora, para além dos seus genes, o gene estranho que lhe foi inserido, isto é, possui um DNA recombinante. 
• O plasmídeo recombinante em contato com bactérias pode introduzir-se nelas. 
• Estas bactérias funcionam como células hospedeiras, aceitam o plasmídeo e, com ele, o novo gene. 
• A partir do DNA recombinante, o gene inserido passa a comandar a síntese da proteína desejada. 
- Após a produção de DNA recombinante, abrem-se poros na bactéria (pela desestabilização dos íons) para a entrada da molécula produzida. 
􀀹 De seguida é necessário realizar uma seleção das bactérias que contém o DNA recombinante, partindo do principio que se o tiverem são resistentes ao antibiótico. Para este processo as bactérias são colocadas num meio com antibiótico, as células que não tiverem DNA recombinante não sobrevivem. 
􀀹 Depois, é necessário realizar um extração do DNA, após lise das paredes celulares, de modo a poder analisá-lo. 
􀀹 O cromossomo é separado do DNA recombinante por centrifugação, devido às suas diferenças de tamanho. 
􀀹 O DNA recombinante é novamente sujeito à digestão por ação das enzimas de restrição, linearizando a molécula. 
􀀹 Os fragmentos de DNA são sujeitos a eletroforese. 
􀀹 Como nem todos os insertos se ligam ao vetor, ou podem ligar-se correta ou incorretamente, a eletroforese de DNA permite distinguir pelo tamanho e utilizando enzimas de restrição, pelo estudos dos mapas de restrição, todas estas sequências. 
Detecção de Ácidos Nucleicos e Proteínas
Hibridização = processo mais comum de detecção baseado na sequencia de um gene particular ou segmento de ácido nucleico. A maioria usa uma DNA ou fragmento de RNA marcado (radioatividade por exemplo) = sonda, complementar ao DNA a ser pesquisado. Um papel de nitrocelulose é pressionado em placa de ágar contendo muitas colônias de bactérias individuais, cada uma com DNA recombinante diferente. Algumas células de cada colônia aderem ao papel formando uma réplica da placa. O papel é tratado com álcali para romper as células e desnaturar o DNA que permanece no papel. A sonda radioativa anela-se apenas ao seu DNA complementar. Depois que toda sonda não anelada dor retirada por lavagem, o DNA hibridizado pode ser detectado por auto-radiografia. 
− Southernblotting = permite a análise de fragmentos genómicos de grandes dimensões e não exige o conhecimento prévio da sequência de nucleótidos da região de interesse. 
− A técnica de Southern blotting envolve: 
• Separação de DNA genómico por eletroforese em gel de agarose 
• Transferência das moléculas separadas para um suporte sólido (membrana ou filtro de nitrocelulose) hibridação com uma sonda marcada (em geral, radioactivamente) 
• Detecção do sinal da sonda (por autoradiografia). 
− Devido às grandes dimensões do DNA genómico, para que se possa proceder à sua separação, é necessário tratá-lo com uma enzima de restrição. 
− Esta enzima vai cortar o DNA de forma previsível, dando origem a milhares de fragmentos genómicos diferentes que cobrem um leque vasto de tamanhos, produzindo um aspecto típico de mancha arrastada (smear) após eletroforese. 
− As dimensões dos fragmentos genómicos formados vão ser característicos de cada indivíduo, já que são consequência da existência de um local de restrição da enzima usada em determinada posição do genoma e, portanto, refletem a sequência do genoma. 
- Northen Blotting = Permite analisar o RNA, da mesma forma que o Southern para DNA 
− Como o RNA já é fragmentado o passo da digestão com enzimas não é necessário. 
− Dá-nos a informação da expressão de um gene 
BIBLIOTECAS DE DNA
O estudo genômico de tantas espécies ao longo do tempo levou à necessidade da construção de bibliotecas de DNA. Estas são coleções de fragmentos de DNA de um organismo, clonados em vetores, geralmente vírus ou plasmídeos, e armazenadas em células hospedeiras (E. coli). A denominação destas bibliotecas varia conforme a natureza do DNA, ‘biblioteca de DNA genômico’ ou ‘biblioteca de cDNA’. Em ambos os casos o DNA é bastante complexo surgindo a necessidade de produzir um número elevado de clones para assegurar que se obtém todas as partes do genoma.
 Biblioteca de DNA genômico
A biblioteca que inclui fragmentos representativos da totalidade do genoma de uma célula ou organismo é designada por biblioteca genômica. Nesta biblioteca estão presentes não só as regiões codificantes, mas também as regiões não codificantes. Desta forma, quando se pretende estudar uma zona não codificante mas importante para a regulação da transcrição, por exemplo, recorre-se a este tipo de biblioteca.
De uma forma geral, os passos necessários à construção de uma biblioteca genômica são:
Isolamento de DNA de alto peso molecular;
Digestão do DNA isolado com enzimas de restrição de modo a produzir fragmentos de tamanho compatível com o vetor de clonagem;
Ligação desses fragmentos ao vetor, geralmente baseado no fago l;
Introdução do DNA recombinante nas células hospedeiras de E. coli.
Quando se pretende obter um certo fragmento da biblioteca é necessário fazer o screening, ou seja, utilizando sondas de DNA, identifica-se e seleciona-se os clones que contêm o fragmento de interesse.
Bibliotecas de DNA complementar (cDNA)
A enzima transcriptase reversa é capaz de sintetizar DNA a partir de mRNA. Desta reação, surge o cDNA que é constituído apenas pela parte codificante, uma vez que o mRNA só contém os éxons. Assim, a sua utilização na área da biotecnologia trouxe muitas vantagens como a possibilidade de cDNAs de células eucarióticas superiores serem diretamente transcritos e traduzidos em microorganismos, permitindo assim a produção em grande escala de polipeptídios ou a determinação direta da sequência de RNA e subsequente dedução da sequência de aminoácidos da proteína por ele codificada, importante para a sequenciação. Com a utilização crescente deste tipo de DNA surgiu a necessidade de organizar esta informação em bibliotecas, da mesma forma que se fez para o DNA genômico. 
A construção de bibliotecas de cDNA passa pelas seguintes etapas:
Extração do RNAm total da célula de interesse;
Síntese in vitro de cDNA a partir do RNAm pela transcriptase reversa e conversão das moléculas de cadeia simples de cDNA em cadeia dupla pela polimerase;
Introdução dos cDNA recombinantes nos vetores e estes nas células hospedeiras;
Identificação dos clones de interesse através de um processo de triagem dos clones recombinantes.
Tal como nas bibliotecas de DNA genômico, quando se pretende obter um certo fragmento da biblioteca é necessário fazer o screening. Neste caso, se a sequência for conhecida utiliza-se sondas de DNA, se não utiliza-se anticorpos (se cDNA estiver num vector de expressão). Depois identifica-se e seleciona-se os clones que contêm o fragmento de interesse.
Ferramentas para o estudo de variabilidade
- Eletroforese de DNA
	O movimento de partículas carregadas eletricamente sob a ação de um campo elétrico é denominado eletroforese. Uma vez que as proteínas apresentam carga líquida em qualquer pH diferente do seu ponto isoelétrico, também migram quando sujeitas a um campo elétrico e sua velocidade de migração é proporcional à densidade de carga. Moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo (ânodo) e moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo (cátodo). Além das cargas, as moléculas migram também pelo seu tamanho.						Para contornar os problemas de interferências e perturbações no sistema, desenvolveram-se técnicas para os efeitos prejudiciais à análise serem minimizados. Esses sistemas ocorrem num meio estabilizado - conhecidas como suportes - com as quais a solução interage e que diminuem as perturbações mecânicas e os movimentos de convecção no líquido. 						Os géis além de evitar a convecção e minimizar a difusão, participam ativamente do processo de separação, interagindo com as partículas que estão migrando. Eles são constituídos de poros que funcionam como uma peneira molecular, assim a separação ocorre em função da carga e também do tamanho (PM) da molécula (nesse tipo de eletroforese, as grandes moléculas têm sua migração retardada com relação às moléculas de menor tamanho). Quando a amostra é aplicada no poço do pente, o gel está imerso em uma solução tampão até em cima, assim a amostra fica dispersa no tampão. Ao tirar o pente, por estar imerso, ainda terá o tampão, mas aí a amostra preenche todo o poço, pois se mistura com o tampão. Depois de aplicada, a amostra é arrastada por uma fronteira de íons em movimento, que é criada quando a corrente elétrica passa através dos eletrodos, do pólo negativo em direção ao pólo positivo. Então quando começar a correr, a parte de baixo da amostra vai começar a descer e a de cima só vai descer quando o que está entre ela e o gel chegar na região de empacotamento, então sempre terá uma mancha, pois descerão separadas. Assim, a função do stacking, é concentrar as amostras. Ele tem uma proporção de acrilamida e bisacrilamida menor, então seus poros são maiores, facilitando a mobilização. Aqui, a corrente aplicada é baixa, então ela é apenas suficiente para mobilizar as proteínas onde os poros são maiores. Aí quando a amostra chega no poro menor, a corrente não é suficiente, formando uma linha de concentração da amostra na região que delimita os dois géis. Agora já pode começar a corrida, aplicando uma corrente maior.				A eletroforese através de um gel, separa as moléculas de DNA e RNA de acordo com o seu tamanho, e também de acordo com sua forma; uma molécula de DNA relaxada ou com uma quebra migra mais lentamente do que uma molécula linear de igual massa; e os DNA super torcidos, que estão compactados e apresentam volume efetivo menor, migram mais rápido do que os DNAs menos torcidos ou circulares relaxados de igual massa.	 									O princípio é baseado no fato da molécula de DNA possuir carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e consequentemente, quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel (porosa e inerte, semelhante a uma gelatina) submetida a um campo elétrico, migra em direção ao pólo positivo (ânodo), funcionando como uma peneira, onde as moléculas maiores vão correr mais lentamente pelo gel do que as moléculas menores. A velocidade da migração depende do tamanho da molécula. Porisso em um dado momento da eletroforese moléculas de tamanhos distintos se encontram em diferentes pontos da matriz. O tipo de matriz que é usada (agarose ou poliacrilamida) depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar e visualizar. Devido à diferença no tamanho dos poros dessas matrizes, utiliza-se normalmente o gel de agarose para a separação de fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases) e o gel de poliacrilamida para separação de fragmentos pequenos, de até 1kb. Alternativamente para a resolução de fragmentos superiores a 1 kb pode-se utilizar a agarose com baixo ponto de fusão (Low Melting) que é um tipo de agarose derivada de síntese orgânica. 												Apesar de ser mais efetivo para separar fragmentos pequenos, o gel de poliacrilamida (Polimeriza-se a partir da reação da acrilamida (C3H5NO) com a Bis-Acrilamida (N,N´- Metileno-bis-acrilamida) em presença de perssulfato de amônio e catalisada por TEMED (N,N,N´,N´-Tetrametiletilenodiamino). A mistura, dissolvida no tampão de corrida desejado, é posta rapidamente para polimerizar numa cuba de montagem semelhante à utilizada para agarose, mas orientada verticalmente. Também é posto um pente para a formação de poços) apresenta algumas desvantagens. Entre elas, destaca-se o fato da poliacrilamida em solução, isto é, quando não polimerizada, ser neurotóxica. Assim, a preparação do gel exige certa cautela. Além disso, a preparação é mais laboriosa, requerendo a mistura de componentes adicionais à poliacrilamida para ajudar na polimerização e mais tempo para que a polimerização ocorra propriamente. 								Já o gel de agarose (Polissacarídeo em forma de pó. Quando suspenso em solução aquosa e aquecido dissolve-se completamente, solidificando-se vagarosamente conforme a temperatura cai. Enquanto está em forma líquida, é colocado num molde que lhe dará o formato de um bloco quando resfriar. Enquanto isso são feitos pequenos poços em uma das suas extremidades, perpendicularmente ao seu comprimento com o uso de um “pente”; são os poços que receberão o produto da PCR) é feito apenas através da mistura de um tampão e agarose, não apresentando toxicidade. A polimerização é mais rápida e o gel pode ser reciclado após o uso, isto é, pode ser reutilizado na elaboração de outros géis. Além disso, a eletroforese em gel de agarose pode ser usada como método analítico ou preparativo, isto é, quando o fragmento de DNA é recuperado e purificado a partir do gel. Entretanto, dependendo do método utilizado para a visualização do DNA, o gel de agarose pode ser desvantajoso. Frequentemente se utiliza a coloração com brometo de etídio (EtBr – que se liga ao DNA e se intercala entre as bases empilhadas), uma substância mutagênica. Em adição, para a visualização do DNA corado com EtBr, é necessária a utilização de transiluminador de luz ultravioleta. Para a utilização de tal aparelho e para a o uso do brometo de etídio, é necessário o cuidado com a segurança não somente do manipulador, mas de todos os que compartilham o uso do laboratório. É possível calcular o tamanho exato de um dado fragmento com base na sua razão de migração. Após a eletroforese em gel, os fragmentos de DNA normalmente são corados com brometo de etídeo, que possui afinidade pelo DNA e fluorece (torna-se visível) vivamente em contato com a luz ultravioleta. Dessa forma pode-se localizar as bandas que correspondem ao DNA. Os fragmentos de DNA podem, então, ser isolados e purificados a partir dos géis de agarose. 												Se houver a necessidade de separar fragmentos maiores do que 50 kb é necessário utilizar a eletroforese em campo pulsado (pulsefield gel electrophoresis – PFGE), que consiste, simplificadamente, de um gel submetido a uma corrente elétrica que se alterna em direções perpendiculares.												Em qualquer um dos casos, estas substâncias são dissolvidas numa solução-tampão eletrolítica, obrigatoriamente a mesma que recobrirá o gel na cuba de eletroforese e possibilitará a passagem de corrente elétrica (Tampão de Corrida).Para eletroforese de DNA, normalmente utiliza-se o TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (Tris-Acetato EDTA) Quanto à aplicação das amostras no gel, é importante ressaltar que antes disso elas são misturadas a uma outra (Tampão de amostra), que tem como função aumentar a viscosidade da amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tampão de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema. Além disso, o tampão de amostra possui um corante, que possibilita a visualização do andamento da corrida. Usualmente, pode-se utilizar uma mistura de Azul de Bromofenol (Corante), Xileno-Cianol e Glicose (aumentam a viscosidade), dissolvidos no tampão de corrida apropriado para cada reação. Após a polimerização, os procedimentos são os mesmos em relação a um gel de agarose: Cobertura pelo tampão de corrida na cuba de eletroforese, aplicação das amostras e do ladder, aplicação da corrente elétrica.						Apesar da sua versatilidade e relativo baixo nível de dificuldade de realização, a eletroforese convencional tem a desvantagem de identificar os fragmentos apenas quanto ao tamanho, e não quanto à sequência. 
Eletroforese de campo pulsante
Esta movimentação obedece ao seguinte princípio: quando um campo elétrico é aplicado ao gel, as moléculas de DNA se alongam na direção do campo e migram no gel. Quando o primeiro campo é removido e um segundo é aplicado em relação ao primeiro, a molécula de DNA deve mudar sua conformação e re-orientação antes que ela possa migrar na direção do segundo campo elétrico O tempo necessário para que essa re-orientação ocorra é proporcional ao peso molecular do fragmento, sendo a re-orientação das moléculas maiores mais demoradas que a das moléculas menores. Existem Diversos equipamento no mercado, que empregam o campo pulsante, sendo que eles apresentam variações na geometria do campo elétrico.
- PCR – Reação em cadeia da Polimerase
	Método eficaz para a amplificação de segmentos específicos de DNA por ciclos repetidos de replicação de DNA in vitro. A PCR utiliza a DNA polimerase, responsável pela síntese de DNA a partir de substratos de desoxirribonucleotídios sobre um molde de DNA de fita simples. 
	Princípios da PCR: Síntese enzimática “in vitro” de cópias de DNA a partir da seqüência alvo; A especificidade é dada pelo uso de primers (iniciadores) específicos para o gene ou região do DNA de interesse; A utilização de dois primers delimitam o alvo e a repetição dos ciclos da PCR dá origem a bilhões de cópias do alvo.
	Etapas da PCR: 1) Desnaturação – abertura da dupla fita do DNA (94 - 96° C)
 2) Anelamento (pareamento) dos primers em T° C mais baixa (50 – 65ºC)
 3) Reação de polimerização (síntese) da fita complementar pela Taq DNA polimerase = extensão (68 – 72ºC)
 4) Repetição por 30 a 40 ciclos (no 3º ciclo já temos a cadeia do tamanho desejado, tamanho alvo, sendo 2, de 8 DNA)
Reagentes: DNA molde, iniciadores (primers), dNTP’s, DNA polimerase, tampão.
	A multiplicação destes trechos específicos se dá alternando-se a temperatura de ensaio entre: a) Desnaturação das cadeias do DNA genômico; b) anelamento (annealinng) dos primers, usados para delimitar a seqüência a ser amplificada; c) temperatura ótima específica da enzima: 72ºC; d) reinício do ciclo.
Especificidade dos primers: Alta temperatura = separação das fitas
 Baixa temperatura = tendência ao pareamento
	Como os pares A-T possuem ligação dupla, se rompem em uma temperatura mais baixa, pois precisam de menos energia para tal ruptura, comparado com os pares C-G. Então é a composição que vai determinar a temperatura de pareamento e extensão.
	O brusco abaixamento de temperatura pode fazer com que os primers pareiem bases erradas, então é preciso descer a temperatura até um certo ponto.
	Na primeira etapa da PCR o DNA molde é desnaturado por calor e anelado a oligonucleotídeosiniciadores (primers) sintéticos, correspondentes aos limites da seqüência de DNA a ser amplificada. A seguir, a DNA polimerase é utilizada para copiar o molde de fita simples, estendendo-a a partir dos iniciadores. Na próxima etapa, o DNA é novamente desnaturado, anelado aos iniciadores e utilizado como molde para um novo ciclo de síntese de DNA. Nesse segundo ciclo, os iniciadores podem iniciar a síntese a partir de fitas de DNA recém sintetizadas no ciclo anterior, bem como a partir do DNA molde original. Quando a DNA polimerase estende o iniciador marcado em verde que anelou na fita molde recém sintetizada a partir do ciclo de síntese de DNA anterior a polimerase prossegue por toda a extensão até o final do molde e, então, se desliga. Assim, nesse segundo ciclo, o DNA que será sintetizado é aquele que cobre precisamente a seqüência de DNA a ser amplificada. A seguir, ciclos adicionais de desnaturação, anelamento e síntese de DNA irão produzir segmentos de DNA que correspondem ao intervalo de seqüência delimitado pelos dois iniciadores. Esse DNA aumentará em abundancia geométrica a cada ciclo subseqüente de reação em cadeia.
A PCR em tempo real nada mais é do que a metodologia de PCR + Sistema de detecção de sinais fluorescentes, para a quantificação do número de moléculas produzidas a cada ciclo. O procedimento da técnica de PCR em tempo real segue o princípio geral da PCR convencional. Assim, apresenta as três fases características da PCR: a fase de crescimento exponencial, fase de crescimento linear e fase estacionária. A primeira fase é bastante específica e precisa. Na fase de crescimento linear os produtos da reação são consumidos e iniciam o processo de degradação. A fase estacionária corresponde ao final da análise devido ao elevado nível de degradação dos produtos da PCR. Os compostos fluorescentes adicionados ao DNA geram um sinal de fluorescência que é diretamente proporcional à quantidade de produto amplificado ao longo das diferentes fases. 				As características relevantes do PCR em tempo real são rapidez, especificidade, sensibilidade e quantificação. A amplificação é dividida em 3 fases: a linha basal na qual não há produtos de PCR suficientes para detectar fluorescência, a fase log em que a quantidade de produtos de PCR dobra a cada ciclo e a fase platô onde não há mais aumento no número de produtos. A análise in vitro dos produtos da amplificação por PCR em tempo real é concretizada através da utilização de compostos fluorescentes. Todos os protocolos requerem o uso de um termociclador de PCR em tempo real específico, bem como capilares de vidro onde se desenvolve a reação em cadeia da polimerase. Estes equipamentos incluem ainda um sistema óptico, uma fonte de iluminação ultra-violeta e um detector de fluorescência. 
- Sequenciamento de DNA
	O princípio básico do sequenciamento de DNA consiste na separação, por tamanho, de subconjuntos de moléculas de DNA. Cada uma dessas moléculas de DNA inicia em uma mesma extremidade 5’ comum e termina em um de vários pontos finais alternativos em 3’. 				O sequenciamento didesoxi ou por terminação da cadeia é baseado na incorporação de desoxinucleotídeos (dNTPs) e de didesoxinucleotídeos (ddNTPs) a uma cadeia de DNA em crescimento, tendo como molde o DNA de interesse. Quando os ddNTPs são adicionados, a extensão da cadeia é interrompida pois esses didesoxinucleotídeos não apresentam um grupo hidroxila (OH) 3’ necessário para a ligação do próximo desoxinucleotídeo (dNTP). Como esses ddNTPs são marcados, podem ser detectados e a seqüência dos nucleotídeos identificada. 
Esse método apresenta duas modalidades:
Sequenciamento Manual
No método manual, a sequência de bases do DNA é lida manualmente, após a exposição das bases identificadas em um filme de raio-X. Para isso são preparados 4 tubos de reação, cada um contendo o DNA molde, a DNA polimerase e um primer. Cada tubo recebe uma pequena quantidade de ddNTP (dATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP) junto com um dos dNTPs (dATP, dTTP, dCTP ou dGTP) marcados com fósforo radioativo (P32). Em qualquer um dos 4 tubos serão produzidos vários comprimentos de cadeia, cada um correspondente ao ponto no qual o respectivo ddNTP desse tubo foi incorporado e ocasionando o término do crescimento da cadeia. As amostras de cada tubo são submetidas à eletroforese e posterior exposição em filme de raio-X para que a posição das bases correspondentes possam ser determinadas lendo-se ao longo das 4 colunas do gel.
No tubo, o fragmento deixa de alongar quando tiver adenina, citosina, ou guanina, ou seja, o que eu foi colocado no tubo. Enquanto for incorporado os nucleotídeos normais, nos fragmentos, eles vão se alongar, a partir do momento que for incorporado uma didesoxiribose dos nucleotídeos, interrompe-se a elongação.
*Só se conhece o último nucleotídeo e o tamanho na análise eletroforética dos fragmentos, com longos géis de poliacrilamida.
 
Sequenciamento Automático
Aqui a reação ocorre num único tubo. O sequenciamento automático utiliza sequenciadores com eletroforese vertical em placa ou eletroforese em capilar, onde os próprios ddNTPs possuem marcação com fluorescência, ao contrário do método manual, em que estes apresentam marcação radioativa. Para a geração de fragmentos durante a reação de sequenciamento, os dNTPs são adicionados à nova fita e no momento da adição de um ddNTP, a extensão da cadeia é interrompida e consequentemente marcada com o último didesoxinucleotídeo incorporado. No final de vários ciclos tem-se várias cadeias de DNA de diferentes tamanhos terminadas com diferentes ddNTPs que posteriormente serão identificados (lidos em sequenciador automático). A reação de sequenciamento ocorre em termociclador e é caracterizada por várias etapas ou ciclos em diferentes temperaturas, repetidos por várias vezes por um determinado período de tempo. Suas etapas são:
1- Desnaturação - É a primeira etapa da reação de sequenciamento na qual a molécula de DNA é separada em fita simples. Para ocorrer a desnaturação eleva-se a temperatura a 96ºC durante 2 minutos.
2- Anelamento - Caracterizada pela utilização de um único primer que irá se anelar à fita de DNA na região complementar à sua seqüência. Para ocorrer ao anelamento diminui-se a temperatura para 50ºC durante 15 segundos.
3- Extensão - Após o anelamento do primer, ocorre a extensão do fragmento através da inserção dos dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) pela Taq DNA Polimerase. Como os ddNTPs estão em concentrações muito menores que os dNTPs, a sua inserção na cadeia é menos frequente. Essa etapa ocorre a 60ºC durante 4 minutos. Quando os ddNTPs são inseridos no lugar dos dNTPs, a extensão para, pois os ddNTPs contém um átomo de H no terceiro Carbono, ao contrário dos dNTPs que contém um grupo OH na mesma posição. 											Após a reação de sequenciamento, os produtos são purificados para a remoção dos nucleotídeos não incorporados e demais reagentes, para não interferir na leitura quando submetidos ao sequenciador automático. Logo após a purificação os produtos são submetidos ao sequenciador automático, cujo princípio é o da eletroforese. Os fragmentos marcados com fluorescência migram ordenadamente no interior dos capilares e à medida que são excitados por um feixe de laser, emitem luz em diferentes comprimentos de onda que são detectados por um fotomultiplicador. Em seguida essa informação é transmitida ao computador e processada para que ao final da corrida, os dados possam ser recuperados em formato de eletroferograma ou de texto (fasta), seguindo-se da análise de bioinformática. 
REPLICAÇÃO DO DNA
Replicação: é a duplicação do DNA, ocorre no núcleo (eucariota), durante o período S da interfase. 
1.    A replicação é semiconservativa, tendo em vista que cada molécula filha conserva uma das fitas da molécula mãe. 
2.    Ocorre da seguinte forma: a helicase (enzima) separa as cadeias do DNA quebrando as pontes de hidrogênio, cada uma das fitas vai servir de molde para a produção de uma nova fita, as novascadeias são construídas pelo DNA Polimerase, a construção segue a ordem de 5’ para 3’. No filamento progressivo, a construção da nova fita é contínua, já no filamento retardatário, vários fragmentos de Okazaki são criados pelo DNA Polimerase, depois disso, a DNA ligase sai juntando esses fragmentos, criando a nova fita. *A replicação ocorre em vários sítios (bolhas de replicação) simultaneamente, acelerando o processo. 
·         Transcrição: é o processo de síntese de RNA a partir do DNA
A enzima envolvida nessa situação é a RNA Polimerase
Ocorre na G1 e na G2 (durante a interfase)
Dá-se assim: o RNA Polimerase se liga ao gene, separando as duas fitas do DNA e usando uma (fita líder ou principal) como molde para a produção do RNA. O sentido da síntese é: 5’3’. Na síntese do RNA, as adeninas são ligadas às uracilas. *Gene: segmento de DNA que pode ser transcrito em RNA. 
1.    O processo de transcrição pode ser melhor visualizado neste vídeo: Transcrição
2.    Tipos de RNA:
§  Mensageiro (mRNA): leva a informação da sequência de aminoácidos da proteína a ser sintetizada (é a cópia da receita)
§  Transportador (tRNA): transporta aminoácidos para o local da síntese (leva os ingredientes da receita)
§  Ribossômico: faz parte do ribossomo, estrutura que traduz o mRNA e sintetiza a proteína (é o cozinheiro)
Dano e reparo do DNA
	As alterações na sequência de DNA decorrem de erros de cópia e dos efeitos de vários agentes físicos e químicos, ou carcinógenos. Se essas alterações forem deixadas sem correção, tanto o crescimento quanto a falta de crescimento das células somáticas podem acumular tantas mutações que já não poderiam funcionar, além do fato de que não seria formado um descendente viável de mutações nas células germinativas. Todos os carcinógenos (agentes que causam câncer) são mutagênicos, ou seja, alteram um ou mais nucleotídios no DNA. As estruturas variadas dos carcinógenos químicos têm uma característica unificante: reatividade eletrofílica (são eletrofílicos ou metabolizados no corpo para se tornarem eletrofílicos). Ocorre ativação metabólica através do sistema do citocromo P-450, via em geral usada por células para se livrarem de substâncias químicas nocivas.
A leitura de Provas (Proofreading) pela DNA Polimerase corrige erros de cópias
	Muitos erros de cópia que ocorrem durante a replicação do DNA são corrigidos pela função de leitura de provas da DNA polimerases que podem reconhecer bases incorretas (malpareadas) na extremidade 3’ da fita em crescimento e depois removê-las por atividade de uma exonuclease 3’5’. 
 *Fidelidade da reação de replicação
- distribuição espacial dos átomos dos nucleotídeos (quando há um pareamento incorreto, primeiramente as ligações de H ficam comprometidas, caso não fique, por ter distanciamentos OH com o P, dificultando a atuação da polimerase. Caso ela consiga, o nucleotídeo seguinte pode ficar numa distribuição complexa a ponto de não conseguir continuar a ação da polimerase);
- alta processividade da DNA polimerase = capacidade da enzima permanecer em um único molde, sem se dissociar e reassociar, o que minimiza a ocorrência de inserções e deleções de bases;
- Mecanismo de revisão = mecanismo para correção e erros durante a síntese de ácidos nucléicos que envolve o exame minucioso de cada posição após o nucleotídeo ser incorporado ao novo filamento. 
Taxa de erros: - Esperada: ~10-3 a 10-5 por base incorporada
 # proofreading = reduz para 10-5 a 10-7 por base incorporada
 # reparo reduz para 10-8 a 10-10 por base incorporada
 - Observada: ~10-8 a 10-10 por base incorporada corresponde a aproximadamente 1 erro por genoma a cada 1000 ciclos de replicação bacteriana.
O dano do DNA pode ser reparado por vários mecanismos
	Esse sistema de reparo opera logo depois da incorporação da base errada, antes que a fita filha recém sintetizada fique metilada. No reparo do pareamento errado, uma porção curta de uma fita de DNA recém sintetizada contendo base incorporada é identificada, removida e substituída por síntese de DNA direcionada pelo molde correto. 
	No reparo por excisão, são removidas (sofrem excisão) lesões volumosas do DNA, decorrentes de exposição à luz UV (pode fazer com que resíduos de timina adjacentes na mesma fita de DNA fiquem ligados covalentemente) e a várias substâncias químicas por sistemas de nucleases especializados; a síntese do DNA por uma polimerase preenche o espaço e a ligase une as extremidades livres. Uma chave para esse tipo de reparo é a capacidade de certas proteínas de deslizar ao longo da superfície de uma molécula de DNA com dupla hélice procurando abaulamentos ou outras irregularidades de forma da dupla hélice. 
	Quebras da dupla hélice podem ser reparadas por recombinação homóloga e por uma união de extremidades de duplas hélices de DNA não homólogas. A união das extremidades quebradas de diferentes cromossomos, contudo, leva à translocação de pedaços do DNA de um cromossomo a outro, podendo desencadear crescimento anormal. No último processo, são removidas várias bases no ponto da quebra. As quebras de fita dupla podem ser reparadas corretamente apenas se as extremidades livres do DNA se unirem novamente de maneira exata, sendo complicado pela ausência de regiões de fita simples que possam direcionar o pareamento de bases durante o processo de junção. Um dos mecanismos é a recombinação homóloga, onde a fita dupla num cromossomo é reparada com o uso de informação do cromossomo homólogo intacto. 	
Nos organismos multicelulares, contudo, o mecanismo predominante para reparo de quebras de fita dupla envolve a reunião das extremidades das duas moléculas de DNA; e embora produza uma molécula contínua com fita dupla, ele resulta na perda de vários pares de bases no ponto de união (um exemplo de como um reparo pode introduzir mutações). Eucariotos tem sistemas de reparo de DNA análogos aos da E.coli.
Sistemas induzíveis de reparo do DNA são propensos ao erro
	As células bacterianas e eucarióticas têm sistemas induzíveis de reparo do DNA, expressos quando o dano do DNA é tão extenso que pode ocorrer replicação antes que os mecanismos constitutivos possam reparar todo o dano. O sistema de reparo induzível SOS nas bactérias é propenso a erro e, dessa forma, gera e perpetua mutações. 
	Os mecanismos de reparo do DNA ineficazes ou propensos a erro podem perpetuar mutações. Esse é um dos principais meios pelos quais o dano do DNA causado pela radiação ou por carcinógenos químicos induz a formação de tumores. Dessa forma, os processos celulares de reparo do DNA têm sido implicados na proteção contra o desenvolvimento de câncer e como agentes contribuintes para ele.