Apostila de Exercícios

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Departamento de Bioquímica 
Instituto de Química – USP 
 
 
 
EXERCÍCIOS 
 
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 
 
 
 
QBQ 0316N 
2013 
 
Professores 
 
Carlos Takeshi Hotta 
Guilherme Menegon Arantes 
 
 
2 
 
1. O ácido dinitrosalicílico (DNS) pode ser usado para medir a quantidade de açúcares redutores em 
amostras, pois a reação deste com o grupo aldeído livre presente no carbono 1 das aldoses, ou com o 
grupo cetônico presente em frutoses, libera um produto que absorve luz à 540 nm. Alunos de um curso de 
bioquímica, montaram a seguinte curva padrão usando uma solução de glicose 5 mM (massa molar = 180 g) 
e obtiveram os seguintes resultados após ferver as amostras por 10 min: 
Glicose 5 mM 
(µl) 
Água 
(µl) 
Reagente DNS 
(µl) 
Massa de glicose 
(µg) 
Abs 540 nm 
0 500 500 0,010 
50 450 500 0,100 
100 400 500 0,250 
150 350 500 0,380 
200 300 500 0,480 
250 250 500 0,620 
300 200 500 0,680 
350 150 500 0,820 
400 100 500 0,940 
450 50 500 1,100 
500 0 500 1,220 
 
O reagente da Glicose Oxidase (TGO) pode ser usado para medir especificamente a quantidade de glicose 
presente em uma amostra. A glicose oxidase, ao oxidar glicose, reduz um grupo NAD
+
 para NADH. Essa 
reação pode ser acoplada à oxidação de um grupo como a o-dianisidina, a qual passa a absorver luz a 
420nm ao ser oxidado. Foi montada uma curva padrão com uma solução de glicose 0,5 mM e, após incubar 
a amostra por 1 h a 37°C para ocorrer a reação foram obtidos os seguintes resultados: 
Glicose 0,5 mM 
(µl) 
Água 
(µl) 
Reagente TGO 
(µl) 
Massa de glicose 
(µg) 
Abs 420 nm 
0 500 500 0,020 
50 450 500 0,120 
100 400 500 0,200 
150 350 500 0,270 
200 300 500 0,390 
250 250 500 0,510 
300 200 500 0,620 
350 150 500 0,660 
400 100 500 0,780 
450 50 500 0,910 
500 0 500 0,980 
 
 
O reagente Fenol-Sulfúrico (FS) pode ser usado para medir a quantidade de açúcares presentes em uma 
amostra, pois após a hidrólise pelo ácido sulfúrico e a reação do fenol com os grupos hidroxila é gerado um 
produto que absorve a 490 nm. Foi montada a curva padrão abaixo com uma solução de glicose 1 mM e 
após a reação foram obtidos os dados abaixo: 
 
 
 
3 
 
Glicose 1 mM 
(µl) 
Água 
(µl) 
Reagente FS 
(µl) 
Massa de glicose 
(µg) 
Abs 490 nm 
0 400 400 0.001 
10 390 400 0.050 
20 380 400 0.075 
50 350 400 0.175 
100 300 400 0.450 
150 250 400 0.600 
200 200 400 0.750 
250 150 400 0.990 
300 100 400 1.150 
400 0 400 1.600 
 
Diferentes variedades de cana-de-açúcar foram testadas para saber qual das variedades possui a maior 
quantidade de açúcares solúveis, o que é de grande interesse para a indústria açucareira. Pedaços do colmo 
da cana-de-açúcar foram homogenizados em água e este material foi centrifugado por 10 min a 10.000 g a 
4°C. O sobrenadante foi diluído é usado para determinação de açucares com os métodos do ácido 
dinitrosalícilico (DNS), glicose oxidase (TGO) e fenol-sulfúrico (FS). Os resultados estão expostos na tabela 
abaixo: 
Variedade Massa de 
tecido (g) 
Volume 
final (ml) 
Diluição 
(X) 
Amostra 
(µl) 
Abs 
540 nm 
(DNS) 
Abs 
420 nm 
(TGO) 
Abs 
490 nm 
(FS) 
1 10 10 100 100 0,001 0,003 0,812 
2 5 10 20 100 0,005 0,001 1,525 
3 7 10 30 100 0,003 0,002 1,210 
4 2 10 5 100 -0,002 -0,009 0,994 
5 25 10 200 100 -0,010 0,001 0,853 
6 12 10 100 100 0,000 0,007 1,112 
7 8 10 100 100 0,001 -0,008 1,215 
8 10 10 100 100 0,003 -0,001 1,336 
9 4 10 15 100 0,002 0,001 1,201 
10 1 10 2 100 -0,008 0,002 1,487 
 
a) Qual das técnicas é a melhor para esse teste? Como você explicaria esses resultados? 
b) Calcule a concentração de açúcares solúveis nos diferentes homogeneizados e a quantidade de 
açúcar que pode ser obtida por grama de tecido vegetal. Qual das plantas é a melhor para a produção de 
sacarose? 
c) Uma indústria farmacêutica está interessada na produção de alfa-glicosidase de levedura para 
geração de glicose e frutose a partir de açúcar da cana (sacarose). Para tal, obteve várias linhagens de 
levedura e agora há a necessidade de medir a atividade de alfa-glicosidase presente nas células. Quais das 
técnicas – DNS, TGO ou FS – você usaria para medir a atividade dessa enzima, usando sacarose como 
substrato? 
 
2. A indústria farmacêutica preparou lisados de levedura de diferentes linhagens. Em todas as 
amostras usou 1 g de células e obtiveram 10 mL de lisado. Esses lisados foram utilizados para ensaios 
enzimáticos, empregando p-nitrofenil α-glicosídeo (pNPαglc) como substrato. Foram obtidos os resultados 
a seguir: 
 
4 
 
linhagem diluição lisado 
diluído 
(µl) 
água 
(µl) 
pNPαglc 
(µl) 
Abs 
420 nm 
(15 
min) 
Abs 
420 
nm 
(30 
min) 
Abs 
420 
nm 
(45 
min) 
Abs 
420 nm 
(60 
min) 
A 100x 100 100 200 0,050 0,100 0,150 0,200 
B 50x 20 180 200 0,080 0,160 0,240 0,320 
C 8x 50 150 200 0,250 0,500 0,750 1,000 
D 70x 200 0 200 0,100 0,200 0,300 0,400 
E 500x 200 0 200 0,010 0,020 0,030 0,040 
F 200x 200 0 200 0,075 0,150 0,225 0,300 
 
As mesmas amostras foram submetidas à determinação de proteínas com o reagente de Bradford 
(comassie blue G), obtendo-se os dados a seguir: 
linhagem diluição lisado diluído 
(µl) 
água (µl) Reagente 
Bradford 
(ml) 
Abs 
595 nm 
(15 min) 
A 20x 100 0 1 0,265 
B 50x 20 80 1 0,320 
C 10x 50 50 1 0,50 
D 20x 80 20 1 0,105 
E 5x 10 90 1 0,750 
F 80x 100 0 1 0,415 
 
Confeccionou-se também uma curva padrão usando albumina de ovo: 
Albumina 
0,2 g/l 
(µl) 
água (µl) Reagente 
Bradford 
(ml) 
Massa de 
proteína (mg) 
Abs 
595 nm 
(15 min) 
0 100 1 0,010 
10 90 1 0,080 
20 80 1 0,160 
30 70 1 0,240 
40 60 1 0,320 
50 50 1 0,400 
60 40 1 0,480 
70 30 1 0,560 
80 20 1 0,640 
90 10 1 0,720 
100 0 1 0,800 
 
Calcule a concentração de atividade enzimática no lisado de cada uma das linhagens de levedura. Calcule 
também a atividade obtida por grama de células. Calcule a concentração de proteína em cada um dos 
lisados e a atividade específica de cada um dos materiais. Se o próprio lisado for utilizado industrialmente 
como fonte de enzima, qual das linhagens é melhor para produzir essa enzima em larga escala? Se for 
necessário purificar a enzima, qual das linhagens é a melhor fonte? Justifique as respostas. 
 
5 
 
3. Um homogeneizado do epitélio do tubo digestivo de rato apresenta atividade da enzima alfa-
glicosidase. Para as condições de preparação deste homogeneizado obteve-se uma atividade enzimática de 
80 mU/ml e uma atividade específica de 80 mU/mg. A fim de purificar esta alfa-glicosidase, 1,5 ml deste 
homogeneizado foram submetidos a uma cromatografia de troca iônica em uma coluna DEAE-celulose e 
obteve-se o seguinte perfil de atividade de alfa-glicosidase nos tubos coletados durante a cromatografia: 
 
 
 
Os tubos com maior atividade de alfa-glicosidase foram reunidos. Este material com volume de 1,0 ml foi 
denominado “DEAE”. Em seguida, o DEAE foi utilizado para determinação de atividade enzimática e 
concentração de proteína total. As condições do ensaio de atividade enzimática e os resultados obtidos 
estão descritos na tabela abaixo: 
p-nitrofenil α-
glicosídeo 4mM 
(µl) 
DEAE 
(µl) 
Tempo de 
incubação a 30 oC 
(min) 
Abs 
420 nm 
 
50 50 5 0,1 
50 50 10 0,19 
50 50 15 0,32 
50 50 20 0,4 
Nas condições de ensaio de atividade de alfa-glicosidase descritas acima, a curva padrão utilizada para 
cálculo da atividade enzimática tem a equação Abs420 = 0,0056 nmols. 
 
As condições utilizadaspara determinação da concentração de proteína total estão descritas na tabela 
abaixo: 
DEAE 
(µl) 
Água 
(µl) 
Reagente Bradford 
(µl) 
Abs 
595 nm 
10 990 1000 0,052 
40 960 1000 0,130 
50 950 1000 0,150 
100 900 1000 0,350 
 
A curva padrão do reagente de Bradford preparada nas mesmas condições de volume que a tabela acima 
está apresentada a seguir: 
6 
 
 
Utilizando estas informações e resultados, determine: 
a) a concentração de atividade enzimática (mU/ml) do DEAE 
b) a concentração de proteína total (mg/ml) do DEAE 
c) a atividade específica do DEAE 
d) a recuperação de atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica 
e) o enriquecimento da atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica 
 
Obs: 1 mU (miliunidade) de atividade enzimática corresponde à quantidade de enzima que catalisa uma 
reação química com a velocidade de formação de 1 nmol de produto/minuto. 
 
4. O gráfico abaixo representa a atividade enzimática de alfa-glicosidase eluída em uma cromatografia 
de troca iônica em coluna DEAE-celulose. Sabendo que o ponto isoelétrico (pI) desta enzima é 7,0 e que 
esta cromatografia foi feita em tampão pH 8, construa um esboço do gráfico esperado para cromatografias 
realizadas em pH 9,0 e pH 4,0. Estes esboços devem indicar o ponto de eluição da atividade enzimática em 
relação ao gradiente de NaCl. 
 
 
 
7 
 
5. As figuras a seguir apresentam o perfil de eluição da atividade de alfa-glicosidase em uma 
cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-celulose. Cada uma das cromatografias foi realizada 
utilizando um tampão com pH diferente (9,0 – 8,0 – 6,0). Com base nos resultados responda qual a 
provável faixa de valores do pI (ponto isoelétrico) desta alfa-glicosidase: 
 
 
 
 
 
 
6. Você conseguiu purificar uma celulase através da marcha de purificação a seguir. 
 
1º passo: cromatografia de troca aniônica em pH 10. 
2º passo: cromatografia de filtração em gel em pH 6,0. 
8 
 
 
Após cada passo os tubos que continham a atividade de celulase foram reunidos. Para este material foi 
calculada a atividade enzimática total de celulase e também a quantidade de proteína. A tabela abaixo 
resume estes resultados: 
Passo Atividade de 
celulase aplicada 
(U) 
Atividade de 
celulase recuperada 
(U) 
Proteína total 
aplicada 
(mg) 
Proteína total 
recuperada 
(mg) 
Troca iônica 500 100 1,0 0,05 
Filtração em gel 100 80 0,05 0,02 
 
Após cada cromatografia os tubos que continham atividade de celulase também foram reunidos e 
analisados por SDS-PAGE: 
 
SDS-PAGE de materiais recolhidos ao longo da marcha de purificação. M – meio de 
cultura; T – material recuperado após cromatografia de troca aniônica; F – material 
recuperado após cromatografia de filtração em gel; P – padrões de peso molecular. 
 
Para a coluna de filtração em gel de 25 ml usada na marcha de purificação foi previamente preparada uma 
curva de calibração utilizando proteínas de diferentes pesos moleculares. Os dados obtidos estão descritos 
na tabela abaixo juntamente com o resultado para cromatografia da celulase: 
 
Material Volume de eluição (ml) 
Proteína padrão de 2.000.000 daltons 7,53 
Proteína padrão de 66.000 daltons 9,38 
Proteína padrão de 45.000 daltons 10,46 
Proteína padrão de 12.400 daltons 13,70 
Proteína padrão de 6.500 daltons 16,22 
Atividade celulásica 9,58 
 
a) Calcule a recuperação da atividade enzimática após cada um dos passos da purificação da celulase. 
b) Calcule a atividade específica da celulase após cada um dos passos da marcha de purificação. 
c) Qual dos passos é melhor na purificação desta enzima? Por quê? 
d) Calcule a massa molecular da enzima determinada por SDS-PAGE e por filtração em gel. Compare os 
valores e formule hipóteses para explicar os resultados. 
9 
 
7. Um bioquímico recebeu uma amostra para análise. Nela, havia diversas proteínas que precisavam 
ser separadas umas das outras. Numa primeira etapa, o bioquímico utilizou uma coluna de gel filtração 
recomendada para proteínas de alto peso molecular (> 60 kDa) e obteve o seguinte perfil de eluição: 
8. 
 
Perfil da cromatografia de gel filtração em Superdex-200. As proteínas 
separadas foram coletadas nos tubos 1, 2, 3 e 4. 
 
Os volumes aproximados de eluição para cada tubo foram: 
Tubo 1 = 10 ml 
Tubo 2 = 11 ml 
Tubo 3 = 13 ml 
Tubo 4 = entre 14,5 e 15 ml 
Volumes aproximados (+/- 0,5 ml) 
 
Usando essa mesma coluna de gel filtração (volume total de 25 ml), nas mesmas condições da corrida 
anterior, o bioquímico analisou os padrões de peso molecular, obtendo os seguintes resultados: 
 
Material Volume de eluição (ml) 
Proteína padrão de 2.000 kDa 7,53 
Proteína padrão de 250 kDa 9,38 
Proteína padrão de 170 kDa 10,46 
Proteína padrão de 65 kDa 13,70 
Proteína padrão de 24 kDa 16,22 
Atividade celulásica 9,58 
 
Os tubos marcados de 1 a 4 foram então analisados por SDS-PAGE em condições redutoras e não 
redutoras, sendo obtido o seguinte perfil: 
10 
 
 
Eletroforese de SDS-PAGE em condições redutoras (c/β-mercaptoetanol) e não redutoras 
das proteínas contidas nos tubos 1, 2, 3 e 4. No último poço, encontram-se os padrões de 
pesos moleculares. 
Após analisar os dados, o bioquímico então decidiu submeter a amostra do tubo 4 a uma cromatografia de 
troca de ânions (-) em pH 7, seguida de eletroforese SDS-PAGE das frações obtidas. Os resultados da 
cromatografia e da eletroforese estão na figura abaixo: 
 
Responda: 
a) Quantas proteínas estavam presentes na amostra? 
b) Qual o peso molecular de cada uma delas? Quais continham mais de uma subunidade e qual o peso 
molecular de cada cadeia proteica? 
c) Qual o pI aproximado de cada proteína do tubo 4 (maior, menor ou próximo de 7)? 
 
8. Para uma alfa-glicosidase foram determinadas as velocidades de hidrólise de diferentes 
concentrações de substrato (NpαGlc) na presença de diferentes concentrações de um inibidor. Estes dados 
estão apresentados na tabela abaixo. Baseando-se nesta tabela determine o Vmax e o Km para a hidrólise 
do substrato e o Ki para este inibidor. 
 
11 
 
[S] (mM) V (nmol/min) 
[I] (mM) 0 2 4 6 8 
0,10 0,91 0,48 0,32 0,24 0,20 
0,20 1,67 0,91 0,63 0,48 0,38 
0,30 2,31 1,30 0,91 0,70 0,57 
0,40 2,86 1,67 1,18 0,91 0,74 
0,50 3,33 2,00 1,43 1,11 0,91 
0,75 4,29 2,73 2,00 1,58 1,30 
1,00 5,00 3,33 2,50 2,00 1,67 
1,50 6,00 4,29 3,33 2,73 2,31 
2,00 6,67 5,00 4,00 3,33 2,86 
2,50 7,14 5,56 4,55 3,85 3,33 
4,00 8,00 6,67 5,71 5,00 4,44 
6,00 8,57 7,50 6,67 6,00 5,45 
8,00 8,89 8,00 7,27 6,67 6,15 
10,00 9,09 8,33 7,69 7,14 6,67 
 
9. O tecido embrionário de fígado contém uma enzima que catalisa a reação S -> P. O tecido de fígado 
adulto também apresenta a atividade S -> P. Alguns dados cinéticos obtidos com extratos dos dois tecidos 
são apresentados abaixo. Que conclusões você pode tirar com relação à identidade das duas enzimas? 
[S] Velocidade inicial observada 
(µmoles.mg de proteína-1.min-1) 
[M] Extrato de Fígado 
Adulto (E1) 
Extrato de Fígado 
Embrionário (E2) 
1,67 x 10-5 1,05 5,00 
2,50 x 10-5 1,54 6,66 
3,33 x 10-5 1,98 8,00 
5,00 x 10-5 2,86 10,00 
7,00 x 10-5 3,78 11,67 
1,00 x 10-4 5,00 13,33 
1,50 x 10-4 6,67 15,00 
1,67 x 10-4 7,15 15,40 
2,00 x 10-4 8,00 16,00 
3,00 x 10-4 10,00 17,10 
 
10. Durante danos consideráveis do fígado, uma enzima (E1 do Probl. 9) é liberada na corrente 
sanguínea. Após exercícios intensos, uma enzima de músculo, E3, que catalisa a mesma reação, é liberada 
na corrente sanguínea. E1 e E3 podem ser diferenciadas facilmente porque apresentam diferentes valoresde Km (A Km da enzima de músculo é 2 x 10
-5
 M.) Uma determinação com uma amostra de sangue de um 
paciente apresentou os resultados dados na tabela abaixo: 
[S] (M) V (moles.ml de soro-1.min-1) 
5,0 x 10-5 43 
7,0 x 10-5 57 
1,0 x 10-4 75 
1,5 x 10-4 100 
2,0 x 10-4 120 
3,0 x 10-4 150 
6,0 x 10-4 200 
 
Sabendo que o paciente chegou inconsciente no hospital, de modo que você não pode fazer a ele nenhuma 
pergunta, o paciente sofre de uma doença do fígado, ou simplesmente tem se exercitado violentamente?