Aula 3 - Purificação de Proteínas

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QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 11 de setembro 2013
Separac¸a˜o e Cromatografia de Proteı´nas
Universidade de Sa˜o Paulo
QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 11 de setembro 2013
Resumo da aula
• Separac¸a˜o por interac¸o˜es moleculares
• Efeito hidrofo´bico
• Cromatografias:
– Filtrac¸a˜o em gel ou exclusa˜o molecular
– Troca Ioˆnica
– Lı´quida de fase reversa
– Afinidade
– ...
• Recuperac¸a˜o e Enriquecimento em separac¸o˜es
Instituto de Quı´mica - Departamento de Bioquı´mica
QBQ0316N: Bioquı´mica Experimental – Farma´cia Sa˜o Paulo, 11 de setembro 2013
Separac¸a˜o por interac¸o˜es moleculares
• Proteı´nas tem diferentes propriedades moleculares que
podem ser usadas para separar misturas
• Propriedades exploradas:
– Solubilidade (∼ Kps) e variac¸a˜o com pH, T, sais
– Tamanho
– Carga e variac¸a˜o com pH
– Hidrofobicidade
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Efeito hidrofo´bico em proteı´nas
• Principal determinante da agregac¸a˜o e estabilidade
• ´E um balanc¸o de forc¸as fundamentais (van der Waals e
eletrosta´tica), responsa´veis pela solvatac¸a˜o aquosa
• Solutos apolares quebram rede de ligac¸o˜es de H.
Forma-se “jaula” de a´gua em torno do soluto. Diminuem
as interac¸o˜es favora´veis a´gua–a´gua e a entropia
• Agregac¸a˜o diminui superfı´cie da jaula e, logo, a quantidade
de a´gua “congelada”. A entropia do solvente aumenta e
interac¸o˜es fortes a´gua–a´gua sa˜o em parte restabelecidas.
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Colunas de cromatografia
• Suporte so´lido→ fase estaciona´ria
• Soluc¸a˜o aquosa com proteı´nas→ fase mo´vel
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Coluna cromatográfica
amostra
Detector UV 280nm Coletor de frações
Sistema para FPLC
Filtração em Gel ou Cromatografia de Exclusão Molecular
Tamanho:
100 kD
20 kD
Fluxo de solução 
tamponante 
através da coluna
volume
abs280
5 µm
fluxo
volume
Tipos de resina
Sephacryl (dextrana + bis-acrilamida)
50 µm
Sepharose (dextrana + epiclorohidrina)
10 – 120 µm
Cromatografia de Troca Iônica
Carga líquida:
Aminoácidos possuem cadeias laterais ionizáveis;
Proteínas possuem terminais C e N ionizáveis.
pI (ponto isoelétrico) = pH no qual o número total de cargas
positivas é igual ao número total de cargas negativas. Logo, a
proteína não tem carga líquida.
Se o pH > pI, a carga líquida da proteína é negativa
Se o pH < pI, a carga líquida da proteína é positiva
-+
Fluxo de solução 
tamponante com pH 
definido
-
+
Fluxo de solução 
tamponante com pH 
definido
volume
-
+
Fluxo com solução 
tamponante contendo NaCl
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
volume
NaCl
+
+++
pI = 7
pI = 9
pH = 6
F α q1.q2
+
+++
+++
volume
NaCl
Tipos de resina
Cromatografia líquida de fase reversa
Polaridade:
(Material poroso apolar é a fase estacionária)
Proteína ricas 
em aminoácidos
mais apolares: 
mais retidas
Proteínas ricas em 
aminoácidos mais 
polares: menos 
retidas
Eluição:
aumento da % de 
solvente orgânico
na solução eluente
1o. 2o.
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Recuperac¸a˜o em separac¸o˜es
• Medida de atividade (U) enzima´tica recuperada:
Recuperac¸a˜o > 100%→ ativac¸a˜o da enzima
Recuperac¸a˜o < 100%→ parte da enzima perdida
• Condic¸o˜es do meio, outras proteı´nas, etc podem modular
atividade
• Ex.: Lisado com 0.1 mL com 10 U/mL foi filtrado. Das 25
frac¸o˜es de 0.5 mL obtidas, 2 frac¸o˜es tem 0.8 U/mL
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Enriquecimento em separac¸o˜es
• Medida da variac¸a˜o de atividade especı´fica (U/mg):
Enriquecimento > 100%→ pureza ↑
Enriquecimento < 100%→ pureza ↓
• Diretamente proporcional a` pureza da amostra
• Ex.: Lisado com 0.1 mL com 10 U/mL e [proteina] = 10
mg/mL foi filtrado. Das 25 frac¸o˜es de 0.5 mL obtidas, 2
frac¸o˜es com atividade 1 U/mL e [proteı´na] = 0.1 mg/mL
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